液相亲和捕获试验用磁珠研究蛋白质相互作用:脊髓灰质炎病毒的Nanobody范例
2012年5月29日
在这篇文章中，提出了一个简单，定量，液相亲和力捕获检测。这是一个可靠的技术基础上，一方面与亲和力之间的标记蛋白，对其他的第二个标记蛋白（如脊髓灰质炎病毒）之间的磁珠和标签蛋白（如纳米抗体）的相互作用。
该方案利用脊髓灰质炎病毒和脊髓灰质炎病毒之间的相互作用，识别纳米抗体来演示简单的定量液相亲和捕获测定。钴包被的磁珠主要用于下拉标记的蛋白质以及任何相互作用的放射性标记蛋白质。首先，混合标记和标记的蛋白质，并在室温下孵育。
然后添加识别标签的磁珠，使用磁铁将标记蛋白质的结合部分与未结合的部分分开。然后测量在未结合级分中发现的标记蛋白的信号，并确定在未结合级分中发现的标记蛋白的量。当分析确认转化敏感蛋白时，这种液相亲和分析的结果非常有用。
这种液相亲和捕获测定可以深入了解脊髓灰质炎病毒之间的相互作用，识别纳米生物和不同的脊髓灰质炎病毒抗原。该方法也可以应用于其他蛋白质蛋白质相互作用，前提是一种蛋白质可以被标记而另一种蛋白质可以被检测。当我们对研究脊髓灰质炎病毒之间的相互作用感兴趣时，我们第一次有了这种方法的 ID，识别纳米抗体和不同的脊髓灰质炎病毒抗原。
由于脊髓灰质炎病毒对确认转化敏感，因此当附着在固体表面时，e LSA 的使用受到限制。因此，应首选基于液相的系统。脊髓灰质炎病毒研究中经常使用的这种基于液相的系统的示例是微蛋白。
免疫沉淀测定。尽管该测试已经证明了其适用性，但它需要传统抗体的结晶结构，而纳米抗体中不存在这种结构。这些纳米抗体是有趣且非常稳定的单域抗体，可以很容易地使用不同的文本进行工程设计。
应用广泛。He 堆栈对二价离子（如镍和钴）表现出亲和力，而二价离子又可以很容易地包被在磁珠上。因此，我们开发了基于钴包被磁珠的简单定量亲和捕获测定法。
Reese 通过涡旋对磁珠库存进行检测，并将每个样品的 10 微升转移到试管中，使用磁铁沉淀磁珠。取出透明旋毛以清洗珠子。加入 150 μL 结合缓冲液。
使用磁铁收集珠子，并在第二次洗涤后去除旋毛。将磁珠重新悬浮在 40 μL 结合缓冲液中，以控制每个样品。对于样品 1 中的背景，准备一个没有放射性标记病毒但等体积的结合缓冲液用于对照的孔。
样本 2 为 100% 无线电活动。将所有组分添加到孔中，除了用结合缓冲液替换纳米抗体。现在，在所有样品中每分钟加入 2000 计数的 S 35 标记的脊髓灰质炎病毒 7 型毒株 1 型，总体积为 80 微升。
接受控制。示例一。向每个样品中加入 10 微升纳米体稀释液。
在摇床上充分混合 10 秒钟，并在室温下孵育 1 小时。接下来，加入 40 微升洗涤过的磁珠悬浮液，在室温下连续摇动孵育 10 分钟，用磁铁沉淀珠子，将澄清的 SUP natant 转移到试管中以测量每个样品的放射性，将 50 μL 螺旋液转移到计数瓶中。加入 3 毫升闪烁液混合物并读取此绝缘材料。
用水将用过的磁珠反向拉入试管中，并以 500 倍 G 离心 2 分钟。丢弃腌原液，将珠子重新悬浮在 6 毫升 0.5 摩尔氢氧化钠中。然后将悬浮液分装到多个试管中，并在超声波浴中孵育 5 分钟。
用磁铁沉淀珠子并去除滑球后，向每个试管中加入 1 毫升 2% SDS 溶液，然后涡旋混合并贴膜 5 分钟。现在，收获珠子。向每根试管中加入 1 毫升 0.2 摩尔 EDTA pH 7，并在超声波浴中孵育试管 5 分钟。
然后收集珠子，用 1 毫升水洗涤珠子 3 次，然后用 1 毫升 10 毫摩尔氯化钴溶液洗涤。将试管放在摇床上 10 分钟。继续在磁铁上收获磁珠，并在 1 mL 结合缓冲液中复苏悬浮。
在 1 毫升 20% 乙醇中洗涤两次，最后将珠子重悬于其原始体积的 20% 乙醇中，以获得浓度为 40 毫克/毫升的再生珠子。通过设置控制校正背景放射性。样品 1 为 0% 放射性值，对照样品 2 为 100% 放射性值。
现在对于每个样品，计算物质中放射性的百分比，作为纳米体对放射性标记病毒的总沉淀量的量度。本实验使用脊髓灰质炎病毒、天然抗原、加热抗原和 14 s 亚基的三种不同抗原评估 PVSS 38 C 和脊髓灰质炎病毒特异性抗体的亲和力。有趣的是，含有放射性标记的 14 s 亚基的样品中的放射性随着纳米体 PVSS 38 C 浓度的增加而降低，这表明与纳米体 P pvs、S 38 C 相连并间接连接到磁珠的脊髓灰质炎病毒 14 s 亚基的数量增加。
由于未观察到 pvs S 38 C 对脊髓灰质炎病毒的 N 抗原和 H 抗原形式的亲和力，因此纳米体似乎对脊髓灰质炎病毒的 14 s 亚基具有特异性。通过该方法测量的纳米抗体对其抗原的亲和力与无关纳米抗体一样具有特异性。NB 1 对脊髓灰质炎病毒的三种抗原形式没有反应性。
该系统产生高重现性，如不同研究者在不同日期生成的剂量反应曲线所示。一旦掌握了这种可靠的液相，就可以在两小时内正确进行亲和捕获测定，回收所包含的节拍。观看此视频后，您应该对在研究不同蛋白质之间的相互作用时如何使用这种基于磁搏动的液相亲和捕获分析有一个很好的了解，尤其是在无法使用基于固相的系统时。
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概述
本文介绍了一种利用磁珠与标记蛋白相互作用的定量液相亲和捕获检测方法。该方法特别适用于分析标记蛋白与标记蛋白（如脊髓灰质炎病毒）之间的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质相互作用
- 检测法开发
背景
- 亲和捕获检测对于研究蛋白质相互作用至关重要。
- 磁珠可以简化结合和未结合蛋白的分离。
- 标记蛋白可用于提高检测的特异性。
- 了解蛋白质相互作用对于各种生物学应用至关重要。
研究目的
- 展示一种捕获和定量蛋白质相互作用的可靠方法。
- 利用磁珠有效分离蛋白质。
- 提供一个可以应用于构象转换敏感蛋白的协议。
使用的方法
- 在室温下混合标记和标记蛋白。
- 添加钴涂层磁珠以捕获标记蛋白。
- 使用磁铁分离结合的蛋白和未结合的蛋白。
- 测量未结合部分中标记蛋白的信号。
主要结果
- 该检测有效分离结合和未结合的蛋白。
- 可以从未结合部分获得定量结果。
- 该方法适用于各种蛋白质相互作用。
- 结果对于研究构象转换敏感蛋白很有价值。
结论
- 这种液相亲和捕获检测是一种可靠的蛋白质相互作用研究技术。
- 磁珠提高了蛋白质捕获和分离的效率。
- 该协议可以适应各种标记蛋白和应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative liquid phase affinity capture assays using magnetic beads address a critical need for studying protein-protein interactions where conformational sensitivity limits solid-phase approaches. This method enables robust, reproducible measurement of binding events, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Its adaptability and low cost make it valuable for early discovery and assay development pipelines across diverse protein systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-protein interactions in solution, preserving native conformations.
- Supports functional target validation by quantifying specific binding events between engineered proteins and ligands.
- Facilitates mechanistic de-risking for targets sensitive to surface-induced conformational changes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative assay format for evaluating binding specificity and affinity.
- Delivers reproducible outputs suitable for dose-response and competitive binding studies.
- Enables rapid assay setup and regeneration of magnetic beads for scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Applicable to disease-relevant systems where protein conformation is critical for function.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative measurement of interaction specificity.
- Reduces risk of false negatives associated with solid-phase artifacts in sensitive protein systems.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially for systems where conformational integrity is essential.
- Discovery Biology: Quantifies protein-protein interactions to clarify binding mechanisms and validate targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or ligand evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of binding across conditions using measurable outputs from unbound fractions.
- Translational Research: Maintains relevance for conformationally sensitive targets, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, low-cost platform adaptable to various tagged and labeled protein systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein interaction studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assay workflows with bead regeneration capability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing assay artifacts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets sensitive to conformational changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein labeling, tagging, and quantitative detection methods.
- Needs access to magnetic bead handling and radioactivity measurement infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay setup, controls, and data interpretation.
- Adaptable to various protein systems provided tagging and labeling are feasible.
- Limited to interactions where at least one protein can be tagged and another labeled.
