Name: 液相亲和捕获试验用磁珠研究蛋白质相互作用:脊髓灰质炎病毒的Nanobody范例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学习使用钴涂层磁珠进行液相亲和捕获实验，定量分析标记蛋白与放射性标记蛋白的相互作用。该方法适用于研究构象转换敏感蛋白，如脊髓灰质炎病毒与纳米抗体的结合特性。

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作者感谢制药生物技术和分子生物学系的工作人员，特别是感谢Monique De Pelsmacker在放射性标记病毒制备方面的工作。我们衷心感谢Ellen Merckx和Hadewych Halewyck提出的有益评论和讨论，感谢Gerrit De Bleeser在实验室中的帮助。本研究得到了布鲁塞尔自由大学OZR基金（OZR1807）、弗兰德斯科学研究基金（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen，G.0168.10N）以及世界卫生组织（TSA 200410791）的经费支持。Lise Schotte是弗兰德斯科学研究基金（FWO）的博士前研究员。

原理（A）与方法的示意图（B）见图1。
1. 缓冲液的制备
<ol>
	<li>通过将磷酸二氢钠（50 mM）和氯化钠（300 mM）溶于水中，配制结合/洗涤缓冲液，并将pH值调节至8.0。再加入Tween 20（终浓度0.01%（m/v））、甲硫氨酸（终浓度2%（m/v））和牛血清白蛋白（终浓度0.1%（m/v）），并定容至所需体积。</li>
</ol>
2. 磁珠的制备
根据说明书准备磁珠。简要步骤如下：
<ol>
	<li>使用涡旋振荡器重悬磁珠。</li>
	<li>每个样本转移 10 μl 重悬后的磁珠（40 mg/ml）至离心管中。</li>
	<li>使用磁力架吸附磁珠，直至上清液澄清（约 30 秒），小心移除上清液。</li>
	<li>洗涤磁珠两次：加入 150 μl 结合/洗涤缓冲液重悬磁珠，用磁力架将磁珠移至管壁一侧，待上清液澄清后，小心吸除上清液。</li>
	<li>每个样本使用 40 μl 结合/洗涤缓冲液重悬磁珠（10 mg/ml）。</li>
</ol>
3. 亲和捕获实验
注意：为测量（宇宙）背景放射性（0%放射性），在对照样本1中不添加放射性标记的病毒，而是加入相同体积的结合/洗涤缓冲液。
注意：100% 放射性通过对照样本 2 定义，该样本中除纳米抗体外添加所有组分，而以相同体积的结合/洗涤缓冲液替代纳米抗体。
<ol>
	<li>将 2000 cpm 的 35S 标记（β-辐射）脊髓灰质炎病毒 Sabin 1 型毒株9用结合/洗涤缓冲液稀释至 80 μl，加入 96 孔微量滴定板中。</li>
	<li>向各孔中加入 10 μl 纳米抗体稀释液。</li>
	<li>使用振荡器混匀约 10 秒。</li>
	<li>室温孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 40 μl 洗涤后的磁珠悬浮液，室温下持续振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>使用磁铁分离磁珠与上清液，并将澄清的上清液转移至离心管中。</li>
</ol>
4. 放射性测量
<ol>
	<li>将第 3.6 步中的 50 μl 上清液转移至计数瓶中。</li>
	<li>加入 3 ml 液体闪烁液并混匀。使用 β 闪烁计数器测定放射活性。</li>
</ol>
5. 磁珠的回收
<ol>
	<li>将使用过的磁珠收集到一个离心管中，以500 × g离心2分钟，或直至获得清晰的上清液。</li>
	<li>弃去上清液，并将磁珠重悬于6 ml 0.5 M NaOH溶液中。</li>
	<li>将悬浮液转移至多个离心管中，在超声水浴中孵育5分钟。</li>
	<li>使用磁铁收集磁珠，并弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入1 ml 2% SDS溶液，通过涡旋振荡重悬磁珠，随后煮沸5分钟。</li>
	<li>收集磁珠并弃去上清液，将磁珠重悬于1 ml 0.2 M EDTA（pH=7）溶液中。</li>
	<li>将离心管置于超声水浴中孵育5分钟，再次弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入1 ml水，重悬磁珠，收集磁珠后弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>弃去上清液，将磁珠重悬于1 ml 10 mM CoCl2溶液中，置于摇床上振荡10分钟。</li>
	<li>使用磁铁收集磁珠，弃去上清液，再将磁珠重悬于1 ml结合/洗涤缓冲液中。</li>
	<li>弃去上清液，并用1 ml 20%（v/v）乙醇洗涤磁珠两次。</li>
	<li>将磁珠重悬于原始体积的20%（v/v）乙醇中，以获得再生磁珠，浓度为40 mg/ml。</li>
</ol>
6. 结果解读
<ol>
	<li>对照样品1，未添加放射性标记病毒，用于校正本底放射性并设定0%放射性值。对照样品2，不含纳米抗体，因此所有放射性标记病毒均保留在上清液中，将其设定为100%放射性值。</li>
	<li>上清液中放射性所占百分比（= a%）可反映纳米抗体对放射性标记病毒总体沉淀程度（= 100 - a%）。</li>
</ol>
7. 典型结果
该亲和捕获实验的代表性结果如图2、图3和图4所示。图2展示了针对脊髓灰质炎病毒特异性的纳米抗体PVSS38C的亲和力。PVSS38C对脊髓灰质炎病毒的三种不同抗原形式进行了测试：天然抗原（N-抗原）、加热抗原（H-抗原）和14S亚单位。N-抗原是具有感染性的完整病毒。当病毒被加热（56 °C下持续20分钟）或附着于固相表面时（未发表结果），衣壳构象发生变化，导致病毒RNA（部分）丢失以及衣壳蛋白VP4的缺失，从而形成空衣壳，即称为H-抗原。14S亚单位是病毒组装过程中的中间产物。这些抗原在免疫后可被不同类型的抗体识别10，因此具有不同的表位和抗原位点。图中显示了上清液中放射性百分比随纳米抗体浓度变化的关系。可以看出，含有放射性标记14S亚单位的样品，其上清液中的放射性随着纳米抗体PVSS38C浓度的增加而降低。这表明与纳米抗体PVSS38C结合（并间接结合磁珠）的脊髓灰质炎病毒14S亚单位数量增加。捕获滴度（= 捕获50%放射性标记病毒所需的纳米抗体浓度）可通过图形法计算为0.099 nM。未观察到PVSS38C与脊髓灰质炎病毒N-抗原或H-抗原形式之间的亲和力。根据这些数据可推断，PVSS38C所识别的表位仅存在于14S亚单位上，而不存在于脊髓灰质炎病毒的另外两种抗原形式上。
为了证明上清液中放射性信号的减少仅源于纳米抗体对其抗原的特异性亲和力，本实验使用了Nb1进行了相同的检测；Nb1是一种针对硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus sulfataricus）lrpB转录调节因子而制备的纳米抗体，已知其与任何脊髓灰质炎病毒抗原均无相互作用。该实验结果如图3所示。所有放射性标记的病毒均保留在上清液中，表明Nb1对脊髓灰质炎病毒的三种抗原形式均无反应性。
通过在不同日期由不同人员重复实验共八次，对特定纳米抗体（即 PVSP29F）结果的可重复性进行了测试。结果如图4所示。针对每种纳米抗体浓度，计算了上清液中放射性百分比的平均值，并对应其标准偏差进行表示。
<img alt="纳米抗体检测脊髓灰质炎病毒；示意图显示磁珠和实验体系中的His标签纳米抗体。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1。"> 
图1. 检测原理（A）与方法（B）示意图。A. 能够特异性识别某种脊髓灰质炎病毒抗原的His标签纳米抗体可与钴涂层磁珠结合，并沉淀放射性标记的病毒。B. 将His标签纳米抗体加入放射性标记的脊髓灰质炎病毒中并进行孵育，随后加入钴涂层磁珠，通过磁分离法分离结合与未结合的抗原。测定上清液的放射性，从而推算出捕获抗原的量。
<img alt="纳米抗体浓度与放射活性关系图；N抗原、H抗原、14S结合比较。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 纳米抗体PVSS38C对不同脊髓灰质炎病毒抗原的磁珠亲和捕获。上清液中检测到的放射活性百分比随PVSS38C浓度的变化而变化。对于14S，可观察到浓度-反应关系，表明PVSS38C与仅存在于14S上的表位发生相互作用。未检测到与N抗原或H抗原的显著相互作用，尽管在极高浓度下可观察到可忽略的非特异性捕获。
<img alt="放射性活度与纳米抗体浓度关系图；抗原结合能力评估；实验结果。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 纳米抗体 Nb1 对不同脊髓灰质炎病毒抗原的磁珠亲和捕获。上清液中检测到的放射性活度百分比随 Nb1 浓度的变化而变化。已知 Nb1 不与任何脊髓灰质炎病毒抗原或亚单位发生相互作用。由于上清液中检测到 100% 的放射性活度，表明病毒未非特异性结合至 Nb1。因此，图 2 中放射性活度的减少仅归因于纳米抗体对其抗原的特异性亲和力。
<img alt="放射性与VHH浓度关系图，显示放射性下降；结合实验结果的数据分析。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4."> 
图 4. 实验的重复性。上清液中放射性百分比的平均值表示为纳米抗体浓度的函数。该实验在不同日期由不同人员重复进行了八次。标准差以垂直条形表示。

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

在该实验方案中，与纳米抗体相互作用的抗原的放射性通过上清液中放射性标记病毒的减少量来定义。因此，可通过上清液中的放射性（= a %）间接估算沉淀的放射性（=100 - a %）（即结合到磁珠上的部分）。另一方面，也可通过使用500 mM咪唑将免疫复合物从磁珠上洗脱，直接测定抗原结合部分的放射性。先前已有研究11证实，总放射性与上清液和沉淀组分中放射性之和完全一致。因此，测定上清液的放射性是可接受且节省时间的方法。从磁珠上洗脱免疫复合物的具体方法由Thys et al., 201111描述。
除脊髓灰质炎病毒外，其他小RNA病毒也被证实对固体表面诱导的构象转换敏感，例如具有重要经济意义的口蹄疫病毒（FMDV）2。文献中已有描述，蛋白质在结合到塑料表面后通常会发生形状改变以及结合亲和力降低的现象12。因此，该检测方法可用于研究其他对构象变化敏感的蛋白质之间的相互作用，用于表位作图、确定正确折叠蛋白质的含量、在生产过程中筛查与结构相关的杂质、在生产期间对批次进行快速筛选、纯化由高度相...

<table><tbody><tr><td>His标签蛋白分离与沉淀用Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>101.03D</td><td>磁珠</td></tr><tr><td>Optiphase &amp;rsquo;HiSafe&amp;rsquo; 2</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1200 - 436</td><td>闪烁液</td></tr></tbody></table>

一种利用磁珠进行液相结合捕获分析研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法：以脊髓灰质炎病毒-纳米抗体为例

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

本文介绍了一种简单、定量的液相亲和捕获检测方法。只要一种蛋白质可被标记，另一种蛋白质可被示踪，该方法即可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法一方面依赖于钴包被磁珠对带标签蛋白的识别，另一方面依赖于带标签蛋白与另一种被示踪的特异性蛋白之间的相互作用。首先，将被示踪和带标签的蛋白质混合，并在室温下孵育。然后加入可识别标签的磁珠，利用磁铁将结合态的示踪蛋白与未结合的游离部分分离。通过测定未结合组分中残留示踪蛋白的信号，可间接定量被捕获的示踪蛋白量。所述液相亲和检测法在检测对构象转换敏感的蛋白质时尤为有用。本文以脊髓灰质炎病毒与其识别纳米抗体之间的相互作用为例，展示了该检测方法的开发与应用1。由于脊髓灰质炎病毒在结合固相表面时易发生构象转换2（未发表结果），ELISA 的应用受到限制，因此应优先选用基于液相的检测系统。在脊髓灰质炎研究中常用的一种液相检测系统是微蛋白 A 免疫沉淀试验3,45。尽管该方法已证明其适用性，但它需要 Fc 结构域，而纳米抗体缺乏该结构6,7。然而，作为一种替代方案，这些有趣且稳定的单域抗体8可方便地通过基因工程引入多种标签。(His)6 标签是广泛使用的一种标签，可特异性结合镍或钴等二价离子，而这些金属离子又可轻易包被于磁珠表面。因此，我们开发了基于钴包被磁珠的简单定量亲和捕获检测法。为使脊髓灰质炎病毒与纳米抗体的相互作用不受阻碍，并实现定量检测，本研究采用35S 对病毒进行标记。该方法操作简便，成本低廉，且磁珠可高效再生，进一步降低了使用成本。

本文介绍了一种简单、定量的液相亲和捕获检测方法。该技术基于磁珠与带标签蛋白（如纳米抗体）之间的相互作用，以及带标签蛋白与另一种标记蛋白（如脊髓灰质炎病毒）之间的亲和力，是一种可靠的检测手段。

本文介绍了一种简单、定量的液相亲和捕获检测方法。前提是其中一个蛋白质可被标记，另一个蛋白质……

本方案利用脊髓灰质炎病毒与其识别纳米抗体之间的相互作用，展示一种简单的定量液相亲和捕获检测方法。主要采用钴包被的磁珠来沉淀带标签的蛋白质以及任何相互作用的放射性标记蛋白质。首先，混合标记的和带标签的蛋白质，并在室温下孵育。然后加入识别该标签的磁珠，利用磁铁将结合了标签蛋白的部分与未结合的部分分离开。接着检测未结合部分中标签蛋白的信号，并确定未结合部分中标签蛋白的含量。当检测对构象转换敏感的蛋白质时，该液相亲和力测定的结果具有极高的应用价值。这种液相亲和捕获检测方法可用于研究脊髓灰质炎病毒、识别纳米抗体与不同脊髓灰质炎病毒抗原之间的相互作用。只要其中一种蛋白质可被标记，另一种可被检测，该方法也可应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用的研究。我们最初开发该方法是出于研究脊髓灰质炎病毒、识别纳米抗体与不同脊髓灰质炎病毒抗原之间相互作用的兴趣。由于脊髓灰质炎病毒对构象转换敏感，当其附着于固相表面时，ELSA 的应用受到限制。因此，应优先选用基于液相的检测系统。在脊髓灰质炎病毒研究中，常用的液相系统之一是微蛋白检测法。免疫沉淀实验。尽管该检测方法已证明其适用性，但它需要传统抗体的晶体结构，而纳米抗体缺乏这种结构。这些纳米抗体是具有吸引力且非常稳定的单域抗体，可轻松通过不同的文本进行改造。该方法被广泛使用。He标签对二价离子（如镍和钴）具有亲和性，而这些离子又可轻松包被在磁珠上。因此，我们开发了基于钴包被磁珠的简单定量亲和捕获检测方法。涡旋重悬磁珠储备液，每份样品取10 µL转移至离心管中，用磁力架沉淀磁珠。弃去上清液以洗涤磁珠，加入150 µL结合缓冲液。使用磁铁收集珠子，并在第二次洗涤后弃去上清液。每个样品加入40 µL结合缓冲液重悬珠子以进行对照。对于样品1的背景对照，准备一个不加放射性标记病毒但加入等体积结合缓冲液的孔作为对照。取两份放射活性为100%的样品。除用结合缓冲液替代纳米抗体外，将所有组分加入孔板中。随后，向所有样品中加入总计80微升结合缓冲液中含有每分钟2000计数的S 35标记的Ⅰ型脊髓灰质炎病毒七型毒株。接受对照。样品一。向每个样品中加入10 µL的纳米抗体稀释液。在振荡器上充分混匀10秒，室温孵育1小时。随后加入40 µL洗涤后的磁珠悬浮液，室温下持续振荡孵育10分钟，用磁铁收集磁珠，将上清液转移至另一管中以测定各样品的放射活性，取50 µL上清液加入计数瓶中。加入3 mL闪烁液混合物，在液体闪烁仪上读数。将使用过的磁珠放入离心管中，用水进行反向拉动，并在500 × g条件下离心2分钟。弃去上清液，将磁珠重悬于6毫升0.5摩尔氢氧化钠溶液中。然后将悬液分装至多个离心管中，在超声水浴中孵育5分钟。将磁珠在磁力架上离心并弃去上清后，向每根试管中加入1 mL的2% SDS溶液，涡旋混匀后用铝箔包裹，孵育5分钟。随后收集磁珠。向每根试管中加入1 mL 0.2

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