Name: 快速高密度的人类胚胎干细胞培养成纤维细胞去除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习利用抽吸技术快速分离人胚胎干细胞集落，去除小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。该方法保持细胞多能性和集落完整性，适用于大规模培养与下游实验应用。

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本工作由加州再生医学研究所的新教员奖 II（RN2-00921-1）以及美国国立卫生研究院资助的国家研究奖（F32-HL104924）资助。

1. 小鼠胚胎饲养层的制备
<ol>
 <li>用于hESC共培养的MEF应预先经辐照或丝裂霉素C处理，以抑制细胞分裂。</li>
 <li>在接种MEF前两小时，用2 ml 0.05%明胶对每个60 mm经等离子体处理的培养皿进行包被。</li>
 <li>解冻一管经处理的MEF，以约20,000个细胞/cm2的密度接种。</li>
 <li>过夜培养使细胞贴壁。</li>
</ol>
2. 将hESC与MEF共接种
<ol>
 <li>可通过冻存的细胞系或如下的方法将现有细胞系传代至新的MEF包被培养皿来建立新的细胞克隆。</li>
 <li>用3 ml预热的1×PBS对含有拟传代的大规模hESC克隆的培养板洗涤1次。</li>
 <li>加入3 ml胶原酶IV/PBS溶液（1 mg/ml），在37 °C孵育5–10分钟。（注意：与胰蛋白酶处理不同，细胞不会明显分离或团缩成球状）。</li>
 <li>在细胞仍处于胶原酶处理状态时，使用5 ml移液管吸头的边缘在克隆上划出网格状图案，将其分割成小的细胞团块。</li>
 <li>将移液管吸头末端垂直于培养板表面，轻轻刮擦培养板底部，使所有细胞从表面脱落。</li>
 <li>将细胞收集至Falcon管中，在1000 rpm下离心5分钟。</li>
 <li>离心后，吸除上清液，保留Falcon管中的细胞沉淀。</li>
 <li>吸除前一天接种的MEF细胞所含的MEF培养基。</li>
 <li>按1:3的比例将细胞重新接种至新的培养板，并加入3 ml hESC培养基进行培养。</li>
</ol>
3. 从共培养体系中去除小鼠胚胎成纤维细胞
注意：人 ESC 培养物必须达到高密度，通常在培养 10 至 14 天之间。
<ol>
 <li>将吸管的管尖置于培养皿边缘，让负压轻轻吸起 MEF 细胞层的边缘。</li>
 <li>吸除培养皿中的培养基，并使管尖带动细胞层在培养皿上方以弧形轨迹缓慢移动。注意：细胞层可能会堵塞在吸管管尖，但这通常不会影响操作，用户仍可手动将细胞层从培养皿表面完全剥离。如果细胞粘附在吸管末端，可用培养皿盖顶部轻轻刮擦以分散细胞层，便于完全吸出。</li>
 <li>立即更换 hESC 培养基，并将培养皿放回培养箱中。</li>
</ol>
4. 典型结果
MEF 去除过程的最终结果是获得小型且未受干扰的 hESC 克隆（图 1D），这些克隆能够显著扩增形成非常大的克隆（图 2），同时维持多能性标志物 SSEA-4、Oct-¾ 和 Tra 1-81 的表达（图 3）。
<img alt="Stem cell colony growth, microscope image, cellular differentiation analysis, biological research." src="/files/ftp_upload/3951/3951fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. ESC集落形态在去除MEF前后的变化 人类胚胎干细胞集落 A) 第1天和 B) 接种至培养皿后的第2天。 C) 高密度 人胚胎干细胞集落（H7）被MEFs包围。两个hESC集落以红色虚线标出。 D) 在使用所述的吸除技术去除MEF后，我们获得了一个孤立的人类胚胎干细胞集落，其周围仅有极少量的MEF细胞环绕该完整集落。
<img alt="10天内的细胞生长；细胞克隆扩增的显微镜图像；延时实验。" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 去除 MEF 后 10 天的 ESC 克隆扩增。人胚胎干细胞（hESC）在去除 MEF 后的原始克隆 （左） 经培养后扩展为一个非常大的克隆 （右），直径约 800 μm，放大倍数为 10×。注意，原始克隆的成像放大倍数（10×）与复合克隆相同。
<img alt="显示DAPI、SSEA-4、Oct3/4、Tra-1-81、Flk-1、DDR2染色的干细胞显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. MEF去除后hESC集落的免疫染色。 MEF去除后长达10天的免疫荧光鉴定显示，集落仍维持多能性标志物的表达，Oct3/4、SSEA-4和Tra-1-81染色结果清晰可见。此外，这些hESC集落未表现出向中胚层分化的趋势，表现为Flk-1染色阴性。A、E、I和M)分别为免疫荧光染色集落的透射光图像，放大倍数分别为20倍、10倍、10倍和2倍。B、F、J和N)显示免疫荧光染色集落的细胞核——DAPI染色细胞，放大倍数分别为20倍、10倍、10倍和2倍。C-D)仅显示人干细胞标志物SSEA-4的表达及复合图像，放大倍数为20倍。G-H)仅显示人干细胞标志物Oct3/4的表达及复合图像，放大倍数为10倍。K-L)仅显示人干细胞标志物Tra-1-81的表达及复合图像，放大倍数为10倍。M-P)最后一行图像显示在2倍放大下具有典型光滑边界的集落，这些集落不表达O)Flk-1（中胚层分化的早期标志物），也未P)含有成纤维细胞，表现为DDR2染色阴性。
补充视频。 通过片状抽吸去除成纤维细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank"> 点击此处观看视频</a>。

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法为从人胚胎干细胞培养物中去除成纤维细胞饲养层提供了一种快速且成本较低的替代方案。成功去除成纤维细胞依赖于在较长时间的干细胞培养后形成的致密汇合单层成纤维细胞。培养7-10天后，生长中的人胚胎干细胞集落会将饲养层成纤维细胞向外推挤，从而在集落之间形成日益致密的成纤维细胞单层。成纤维细胞单层内部牢固的细胞间连接使其能够以细胞片的形式被快速移除。需特别注意的是，该纯化技术仅建议在实验前用于从人胚胎干细胞中去除MEF，而不应用于常规的扩增培养。
也可利用该纯化技术挽救质量较差的干细胞克隆。高质量的人胚胎干细胞（hESC）克隆应与饲养层细胞之间具有清晰的边界。然而，如果干细胞克隆已发生部分分化，克隆边界变得模糊不清，则该方法也可用于在去除MEF细胞层的同时清除部分分化的hESC克隆；但可能需要使用移液器吸头进行物理分离，以切断hESC克隆与不需要的分化细胞或MEF细胞之间的连接。

<table><tbody><tr><td>DDR2</td><td>Santa Cruz</td><td>7555</td><td>成纤维细胞标志物</td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td>细胞核标志物</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td>人胚胎干细胞标志物</td></tr><tr><td>Oct 3/4 </td><td>Santa Cruz</td><td>9081</td><td>人胚胎干细胞标志物</td></tr><tr><td>Flk-1 </td><td>BD Pharma</td><td>555307</td><td>早期分化标志物</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Acris</td><td>AM20377AF4-S</td><td>人胚胎干细胞标志物</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt; 用于人胚胎干细胞免疫染色的特异性试剂表。</td></tr></tbody></table>

高密度人胚胎干细胞培养中快速去除成纤维细胞

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

在囊胚分离后，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）建立人类胚胎干细胞（hESCs）培养体系1该饲养系统可维持hESCs在细胞扩增过程中不发生自发性分化。然而，这种共培养方法耗时耗力，需要高度熟练的技术人员操作，且获得的hESCs纯度较低。4许多实验室已尝试减少hESC培养中饲养细胞的数量（即 使用基质包被的培养皿或其他类型的饲养细胞5-8）。这些改良的培养系统已显示出一定前景，但尚未取代以丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层来培养人胚胎干细胞（hESCs）的标准方法，后者可有效延缓hESC培养物中非预期的自发性分化。因此，在进行分化实验时，应去除用于hESC扩增的饲养层细胞。尽管已有多种技术可用于从饲养层中纯化hESC集落（如FACS、MACS或使用药物抗性载体），但这些方法往往耗时耗力、成本较高，且可能对hESC造成损伤。本项目旨在建立一种高效的纯化方法，以获得更纯净的hESC群体。我们观察到，在融合生长的hESC培养体系中，可通过简单快速地抽吸去除MEF细胞层，从而实现MEF的清除。该过程依赖于多个因素，包括MEF细胞间较强的侧向细胞连接，以及MEF与聚苯乙烯培养皿之间的黏附力较弱；同时，干细胞集落在形成自身“微环境”过程中具有将成纤维细胞向外推挤的能力。在去除MEF后，我们对hESC进行了长达10天的SSEA-4、Oct3/4和Tra 1-81表达检测，以确认其多能性的维持。此外，去除MEF后hESC集落仍能持续生长并形成更大的集落，从而实现进一步的hESC扩增。

尽管目前仍在持续努力将细胞培养体系转向无饲养层条件，人类胚胎干细胞（hESC）的分离与培养在很大程度上仍依赖于与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的共培养。本文中，我们展示了一种在实验前快速去除hESC培养物中饲养层细胞的新型方法。

小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在囊胚分离后用于建立人类胚胎干细胞（hESCs）培养体系1。该饲养层系统……

以下实验的总体目标是以快速高效的方式分离人类干细胞克隆。该目标通过将人类胚胎细胞培养于一层致密的小鼠胚胎成纤维细胞上来实现。随着时间推移，干细胞群体的扩增不仅增加了人类干细胞的数量，还使其在基质中形成类似岛屿的克隆集落。接下来，通过抽吸去除甲醇层，留下人胚胎干细胞的单个克隆。干细胞标志物的免疫组织化学染色结果显示，该方法是一种有效去除饲养层并维持克隆完整性的分离方法。我最初在实验室进行细胞共培养时产生了这种方法的想法，目的是从过度融合的培养体系中挽救干细胞培养物。因此，大多数人在使用该系统时面临的主要问题是缺乏人类干细胞培养的经验。我们发现，当需要为实验分离大量人类胚胎干细胞时，该方法尤为有用。与其他方法（如流式分选或手工挑选干细胞克隆）相比，该方法在从高密度培养物中分离克隆时更快、更高效。在与胚胎干细胞共培养之前，应使用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞或对其进行照射，以阻止其发生分裂。在接种meph前两小时，用2毫升0.05%明胶对每个60毫米的等离子体处理培养皿进行包被。解冻一管经处理的mes，于1,500 RPM离心5分钟，然后接种。在明胶包被的培养皿上以约20,000个细胞/厘米²的密度接种培养物，并过夜培养以使贴壁细胞贴附。可从冻存细胞启动新培养，或将现有培养物传代至甲醇包被的培养皿中。当起始培养含有较大人胚胎干细胞集落的培养板时，先用3毫升预温的磷酸盐缓冲液洗涤一次。加入3毫升浓度为1毫克/毫升的胶原酶IV溶液，在37摄氏度下孵育5至10分钟。在此条件下，细胞不会像使用胰蛋白酶时那样变得明显分离或成球状。使用5毫升移液管吸头的边缘，在细胞集落上划出网格状图案，将其破碎成小的细胞团块。现在将移液枪吸头末端垂直于培养皿，刮取培养皿底部，使所有细胞从表面脱落。将细胞转移至离心管中，以1000 RPM离心五分钟，吸弃上清液。接着，吸去前一天接种的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基。然后将人胚胎干细胞以1:3的比例从原培养皿进行传代，并加入3 mL人胚胎干细胞培养基进行培养。人胚胎干细胞以高密度培养10至14天。将吸管的尖端置于培养皿边缘，用负压轻轻提起甲醇酸膜的边缘。移除培养皿中的培养基。让移液枪头接触细胞片层，然后缓慢以弧形轨迹在培养板上方移动枪头。如果细胞片层经常堵塞移液枪头，则从培养物中移除该片层。轻敲培养皿顶部，用移液器彻底打散细胞，并通过完全吸除去除细胞。接种至培养皿后，立即更换人胚胎干细胞培养基，并将培养物放回细胞培养箱中。该共培养系统可形成高密度的人胚胎干细胞克隆，周围由小鼠胚胎成纤维细胞包绕。吸取法可去除MES，并产生小而未受干扰的人胚胎干细胞集落。由于完整集落周围极少有MES存在，胚胎干细胞集落能够显著扩增，形成非常大的集落。例如，此例中所示的人胚胎干细胞集落在甲醇去除后立即开始扩增，在甲醇处理后的10天内可观察到通过免疫荧光鉴定的大规模集落。耗尽结果显示，集落仍维持其多能性标志物的表达，且未表现出向中胚层命运分化的迹象。这些透射光图像展示了在不同放大倍数下免疫荧光染色集落的形态。DAPI 对细胞核进行染色。重要的是，这些人胚胎干细胞表达人类干细胞标志物SSEA-4、TRA-3-4和TRA-1-80。需要注意的是，图像显示的细胞集落具有典型的光滑边界。这些细胞不表达中胚层分化早期标志物FLK-1，也不含有成纤维细胞，这由DDR-2染色缺失所证实。观看本视频后，您应能充分理解如何利用培养技术调控自然环境，以分离人类干细胞克隆。掌握该技术后，整个操作可在数秒内完成。此外，移除培养基及杂质层时，切记不要让细胞培养物干涸。

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