高密度人胚胎干细胞培养中快速去除成纤维细胞

以下实验的总体目标是以快速高效的方式分离人类干细胞克隆。该目标通过将人类胚胎细胞培养于一层致密的小鼠胚胎成纤维细胞上来实现。随着时间推移，干细胞群体的扩增不仅增加了人类干细胞的数量，还使其在基质中形成类似岛屿的克隆集落。

接下来，通过抽吸去除甲醇层，留下人胚胎干细胞的单个克隆。干细胞标志物的免疫组织化学染色结果显示，该方法是一种有效去除饲养层并维持克隆完整性的分离方法。我最初在实验室进行细胞共培养时产生了这种方法的想法，目的是从过度融合的培养体系中挽救干细胞培养物。

因此，大多数人在使用该系统时面临的主要问题是缺乏人类干细胞培养的经验。我们发现，当需要为实验分离大量人类胚胎干细胞时，该方法尤为有用。与其他方法（如流式分选或手工挑选干细胞克隆）相比，该方法在从高密度培养物中分离克隆时更快、更高效。

在与胚胎干细胞共培养之前，应使用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞或对其进行照射，以阻止其发生分裂。在接种meph前两小时，用2毫升0.05%明胶对每个60毫米的等离子体处理培养皿进行包被。解冻一管经处理的mes，于1,500 RPM离心5分钟，然后接种。在明胶包被的培养皿上以约20,000个细胞/厘米²的密度接种培养物，并过夜培养以使贴壁细胞贴附。可从冻存细胞启动新培养，或将现有培养物传代至甲醇包被的培养皿中。当起始培养含有较大人胚胎干细胞集落的培养板时，先用3毫升预温的磷酸盐缓冲液洗涤一次。

加入3毫升浓度为1毫克/毫升的胶原酶IV溶液，在37摄氏度下孵育5至10分钟。在此条件下，细胞不会像使用胰蛋白酶时那样变得明显分离或成球状。使用5毫升移液管吸头的边缘，在细胞集落上划出网格状图案，将其破碎成小的细胞团块。

现在将移液枪吸头末端垂直于培养皿，刮取培养皿底部，使所有细胞从表面脱落。将细胞转移至离心管中，以1000 RPM离心五分钟，吸弃上清液。接着，吸去前一天接种的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基。

然后将人胚胎干细胞以1:3的比例从原培养皿进行传代，并加入3 mL人胚胎干细胞培养基进行培养。人胚胎干细胞以高密度培养10至14天。将吸管的尖端置于培养皿边缘，用负压轻轻提起甲醇酸膜的边缘。

移除培养皿中的培养基。让移液枪头接触细胞片层，然后缓慢以弧形轨迹在培养板上方移动枪头。如果细胞片层经常堵塞移液枪头，则从培养物中移除该片层。

轻敲培养皿顶部，用移液器彻底打散细胞，并通过完全吸除去除细胞。接种至培养皿后，立即更换人胚胎干细胞培养基，并将培养物放回细胞培养箱中。该共培养系统可形成高密度的人胚胎干细胞克隆，周围由小鼠胚胎成纤维细胞包绕。

吸取法可去除MES，并产生小而未受干扰的人胚胎干细胞集落。由于完整集落周围极少有MES存在，胚胎干细胞集落能够显著扩增，形成非常大的集落。例如，此例中所示的人胚胎干细胞集落在甲醇去除后立即开始扩增，在甲醇处理后的10天内可观察到通过免疫荧光鉴定的大规模集落。

耗尽结果显示，集落仍维持其多能性标志物的表达，且未表现出向中胚层命运分化的迹象。这些透射光图像展示了在不同放大倍数下免疫荧光染色集落的形态。DAPI 对细胞核进行染色。

重要的是，这些人胚胎干细胞表达人类干细胞标志物SSEA-4、TRA-3-4和TRA-1-80。需要注意的是，图像显示的细胞集落具有典型的光滑边界。这些细胞不表达中胚层分化早期标志物FLK-1，也不含有成纤维细胞，这由DDR-2染色缺失所证实。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用培养技术调控自然环境，以分离人类干细胞克隆。掌握该技术后，整个操作可在数秒内完成。此外，移除培养基及杂质层时，切记不要让细胞培养物干涸。