大鼠肠系膜外翻：研究血管生成过程中细胞动态变化的模型

以下实验的目的是确定血管生成过程中的空间和时间细胞动力学，血管生成定义为从已有血管生长出新血管的过程。通过使用一种简单且可重复的模型，首先通过短暂暴露大鼠肠系膜来诱导血管生成，并在刺激后的不同时间点采集肠系膜组织。接着对组织切片进行免疫标记。

例如，使用内皮细胞标记物来可视化组织内完整的重塑血管系统，并生成生长中的微血管网络的关键二维图像。该模型具有吸引力，因为综合来看，在相对较短的时间内，多种血管生成指标均显著增加。在单细胞水平上可视化血管网络，并将这些指标与多细胞标记相关联，已被证明在鉴定涉及毛细血管出芽的新型细胞表型方面极为有用。

该方法有助于解答关于微血管网络生长过程中所涉及的细胞动态的关键问题，包括特定细胞在毛细血管出芽过程中的出现时间与位置。该方法的主要优点在于操作简便、所需外科干预极少，并且在相对较短的时间内即可产生显著的血管生成反应。

此外，该方法利用了大网膜组织，这种组织可实现对完整网络直至单细胞水平的观察。根据我们的经验，该技术非常易于学习，因而可在不同研究人员之间稳定重复，以下将由本实验室的研究生 Peter Stapler 演示该操作流程。手术前准备步骤详见随附文本。

剃除大鼠腹部区域的毛发后，将麻醉后的大鼠仰卧于加热垫上以维持体温，用浸有70%异丙醇的无菌纱布交替擦拭腹部区域，并用碘酒消毒。在胸骨下方约一英寸处，沿皮肤做一小段纵向切口，随后切开白线。将预先裁剪好的手术巾覆盖在腹部切口区域，使开口与切口对齐。轻轻按压切口周围以暴露小肠。使用棉签轻轻拉出一段小肠，将肠系膜平铺在含有无菌生理盐水的塑料载片上，并定位回肠部位。

识别6至8个有血管分布的肠系膜窗，即为供应小肠的动静脉对之间的薄而半透明的膜。记录外置开始时间，并设置20分钟计时器。在靠近肠道的脂肪区域，用无菌7-0缝线标记两个位于中央位置的肠系膜窗。

使用无菌的5毫升注射器间歇性地补充培养皿中的生理盐水，以确保组织保持浸没和湿润状态。在腹腔外暴露时间结束后，将肠系膜复位至腹腔内。用5-0单股缝线以间断缝合方式关闭腹肌。

然后使用4-0单股缝线以间断缝合方式闭合皮肤，用浸有70%异丙醇的无菌纱布交替擦拭缝合区域，并用碘伏消毒。在大鼠双眼涂抹润滑凝胶，将其放回笼中恢复。在刺激后的目标时间点，根据机构指南对大鼠实施麻醉和安乐死。随后重新打开腹腔，用一块塑料薄膜覆盖腹部区域。现在用镊子和显微剪刀轻轻拉出小肠，并找到之前标记的两个观察窗。

切除每个外翻的肠系膜窗，包括周围的一圈脂肪组织。应尽量避免切到脂肪边缘内的动静脉配对结构，以最大限度减少肠系膜窗内可能发生的血液积聚。同时应尽量避免切破肠壁，防止肠内容物溢出。

接触窗片后立即将每片窗片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后使用镊子将组织铺在带正电荷的显微镜载玻片上，每张载玻片放置两个组织样本。待组织部分干燥后，用手术刀片去除多余的脂肪组织。

将样本置于甲醇中，在负20摄氏度下固定30分钟，即将其放入冷冻机中。真空干燥载玻片以去除多余的缓冲液。此外，使用蜡笔在组织周围划线，以防止抗体溶液不受控制地流离组织区域。

现在滴加约 200 微升稀释的一抗溶液，以覆盖整个组织。室温孵育 1 小时，用含 0.1% 吐温 20 的 PBS 洗涤组织，更换缓冲液三次。接着加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温孵育 1 小时，再经过三次洗涤后，将样品置于 Vector Nova Red 溶液中孵育 15 分钟。

用清水冲洗以封片。在95%乙醇中浸洗10次，随后进行逐级脱水。待玻片干燥后，用薄层封片剂覆盖组织，真空干燥并标记后，盖上盖玻片。

载玻片。用稀释的一抗溶液覆盖组织样本，在室温下孵育一小时。

用含0.1%皂苷的PBS洗涤三次，每次10分钟。然后加入二抗，孵育一小时。用含0.1%皂苷的PBS进行洗涤，将切片封片于含甘油的PBS中，并用指甲油封固。

本文详细介绍了对常用培养皿进行改造，以用作手术平台的方法。使用黄色油泥为肠系膜提供一个光滑的表面，使其能够通过预先切好的孔洞。再次说明，在外置期间，图中手术台上所示的肠系膜窗是指此处为肠道供血的动静脉对之间的薄而半透明的膜状结构。

PCAM 标记可识别在体外化后特定时间点微血管网络重塑过程中的所有血管类型。这些图像可用于量化特定时间点的血管生成指标。刺激后。

PCAM 标记可用于区分动脉与静脉。请注意，供血动脉通常比配对的静脉具有更小的管径和更长的内皮细胞形态。重塑血管网络的典型特征包括血管化区域、毛细血管出芽和血管密度。

对这些不同血管生成指标的定量分析可表征血管网络生长的时间进程。在我们实验室中，已有血管的毛细血管出芽在第3至第5天之间达到峰值，并在第10天时恢复至未刺激水平。这种短暂的出芽增加随后伴随着血管化面积和血管密度的上升。

该模型系统已被用于识别此重塑过程中特定时间点的新型细胞表型变化。免疫荧光PCA标记将内皮细胞染成红色，而III类β微管蛋白标记则将血管新生过程中血管周围的神经和寄生虫染成绿色。有趣的是，在未受刺激的组织中，III类β微管蛋白的表达具有神经特异性。

相比之下，在毛细血管出芽的高峰期，血管周围细胞会表达 III 类 β 微管蛋白。这类结果凸显了该简单且稳健的血管生成模型在鉴定参与血管生成过程的新型细胞类型方面的应用价值。到第 10 天时，III 类 β 微管蛋白的表达模式开始恢复至未受刺激的状态。

该模型还可用于细胞谱系研究。这些初步研究支持了细胞整合到重塑的肠系膜组织中的可行性，研究中在肠系膜窗暴露体外的20分钟期间，将预先标记的骨髓细胞或间充质干细胞叠加融合于肠系膜窗上。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用我们的大鼠肠系膜内移模型来研究微血管网络生长过程中的细胞动态变化。

这种简单的技术操作大约需要45分钟至1小时。请记住，在手术后必须轻柔地处理肠系膜，避免刺破任何血管。可通过免疫标记来鉴定血管沿线的多种细胞类型。

您还可以对淋巴管和神经进行标记。这使我们不仅能够研究血管生成过程中涉及的细胞表型变化，还能研究血管生成、神经生成和淋巴管生成之间的协调关系。