Name: 大鼠肠系膜外化:调查涉及在血管生成细胞动力学模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 了解大鼠肠系膜外化模型用于血管生成研究，通过短暂外化刺激微血管网络生长，结合免疫组织化学标记实现单细胞水平的动态可视化与定量分析。

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本研究工作得到了路易斯安那州立大学理事会LEQSF(2009-12)-RD-A-19（项目负责人：W.L. Murfee）以及美国国立卫生研究院资助项目P20RR017659-08（项目负责人：L. Gabriel Navar）支持的杜兰大学高血压与肾脏卓越中心的资助。

1. 手术操作设置说明
<ol>
	<li>手术前对所有手术用品和器械进行灭菌。每只大鼠无菌手术所需的用品包括：1 块用于铺设无菌操作台面的手术巾，1 块中央带有约 0.5 英寸 × 1.5 英寸预切孔的手术巾（用于覆盖大鼠体表，其孔位与大鼠切口位置对齐），以及纱布。手术所需器械包括：1 把标准剪刀（用于剪断缝线材料）、两把镊子、一把精细持针器（用于操作和夹持缝线），以及带刀片的手术刀。本实验室常用的手术材料和工具列于“特定手术材料与工具表”中。然而，最终工具的选择取决于实验人员的偏好。</li>
	<li>准备手术区域。将 100 mL 的 0.9% 无菌生理盐水袋置于加热垫下，确保与肠系膜组织接触的生理盐水预热至约 37 °C。除生理盐水外，也可使用林格氏液或其他生理缓冲液。将已灭菌的手术器械和用品放置于无菌手术巾上，以便在组织外置操作过程中方便取用。此外，还需准备无菌棉签及三种合适的缝线（4-0、5-0 和 7-0），确保包装已预先打开，以便无菌操作时取用。最后，将经过改装的塑料载物台浸入 100% 乙醇中至少 5 分钟进行消毒。该载物台为一个直径 100 mm 的培养皿，其中央切割出一个椭圆形孔（图 1）。可使用 Dremel 工具初步开孔，必要时扩大孔径。开孔后，使用不同粒度的砂纸将塑料边缘打磨光滑。随后清洗载物台，并在孔边缘涂覆惰性油泥（购自本地手工用品店）或硅胶，以形成隆起且光滑的支撑面。在接触组织前，需用无菌生理盐水充分冲洗该载物台。</li>
	<li>在本血管生成模型中，通常使用成年雄性 Wistar 大鼠（350 ± 25 g）。也可选用其他品系或年龄的大鼠。在本实验室中，大鼠通过肌内注射给予氯胺酮（80 mg/kg 体重）、赛拉嗪（8 mg/kg 体重）和阿托品（0.08 mg/kg 体重）进行麻醉。注射约 5 分钟后确认麻醉效果，并剃除大鼠腹部皮肤的毛发。</li>
</ol>
2. 大鼠肠系膜外翻模型
<ol>
	<li>将麻醉后的大鼠仰卧于加热垫上以维持其体温。手术过程中采用无菌技术。佩戴无菌手套，避免器械和用品接触除大鼠组织以外的非无菌表面。</li>
	<li>使用浸有70%异丙醇和碘液的无菌纱布交替擦拭腹部区域进行清洁。</li>
	<li>使用手术刀片沿皮肤做一小段（约0.75英寸）纵向切口，然后在胸骨下方约1英寸处切开腹白线。</li>
	<li>将预先裁剪好的手术巾覆盖在腹部区域，使开口与切口对齐。</li>
	<li>在切口周围轻轻施加压力。通常可使小肠部分外露，便于识别。</li>
	<li>使用棉签轻轻拉出一段小肠并定位回肠。当肠系膜被拉出时，应将其轻轻展开并平铺在塑料培养皿中（图2）。</li>
	<li>识别6–8个有血管分布的肠系膜窗。肠系膜窗定义为供应小肠的动静脉对之间的薄而半透明的膜（图2）。</li>
	<li>记录外置开始时间。将肠系膜部分外置于体外20分钟。在此期间，使用无菌注射器（5 mL）间歇性地向培养皿中补充生理盐水，以确保组织始终浸没，防止干燥。</li>
	<li>在20分钟暴露期间，用无菌7-0缝线标记2个位于中央的肠系膜窗。标记应位于靠近肠道的脂肪区域。</li>
	<li>将外置的肠系膜区域复位回腹腔内。</li>
	<li>使用5-0单股缝线以间断缝合法关闭腹肌。</li>
	<li>使用4-0单股缝线以间断缝合法关闭皮肤。</li>
	<li>使用浸有70%异丙醇和碘液的无菌纱布交替擦拭缝合区域。</li>
	<li>在大鼠双眼上涂抹眼用润滑凝胶。润滑眼睛的目的是防止在手术过程和恢复期间角膜干燥。应在手术干预开始前即涂抹眼用润滑剂。必要时，在将大鼠放回笼中恢复前可再次涂抹。</li>
</ol>
3. 组织采集与固定
<ol>
	<li>在刺激后的目标时间点，对大鼠实施麻醉并处死。在本实验室中，通过肌内注射给予氯胺酮（80 mg/kg 体重）、赛拉嗪（8 mg/kg 体重）和阿托品（0.8 mg/kg 体重）进行麻醉，随后通过心内注射戊巴比妥钠/苯妥英溶液（Beuthanasia）实施安乐死。Beuthanasia 是一种可用于快速且无痛安乐死的戊巴比妥钠/苯妥英溶液。每只大鼠通常注射 0.1–0.2 ml。</li>
	<li>重新打开腹腔，小心取出小肠，并定位两个已标记的窗区。</li>
	<li>使用镊子和显微剪刀将外翻的肠系膜窗逐一剪下。每个窗区保留一圈脂肪边缘有利于后续在显微镜载玻片上的组织铺展。立即把每个窗区浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。剪取时应尽量避免剪断窗区脂肪边缘内的动静脉对，以减少窗区可能发生的血液充盈；同时应尽量避免剪破肠管，防止肠内容物接触窗区组织。</li>
	<li>用镊子将组织铺展在带正电荷的显微镜载玻片上。每张载玻片可放置两个组织样本。</li>
	<li>让组织部分干燥，然后使用手术刀片去除多余的脂肪组织。</li>
	<li>此时组织已准备好进行固定。可采用常规的固定方法。在本实验室中，通常将载玻片置于甲醇（-20 °C）中固定 30 分钟。未固定的组织也可成功进行标记。固定方法可能需根据所选用的抗体进行优化。</li>
</ol>
4. 组织免疫标记
<ol>
	<li>现在通常可以根据每种抗体的说明对组织进行免疫组织化学染色。鉴于我们关注的是血管周细胞在血管生成过程中的作用，本实验室通常对内皮细胞和血管周细胞进行标记10, 12, 13。用于识别微血管网络不同层级内皮细胞的有效标记物包括抗PECAM抗体或BSI-凝集素。本组织中使用的血管周细胞标记物包括NG2、结蛋白（desmin）、平滑肌α-肌动蛋白（SM-α actin）、血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）以及III类β-微管蛋白（class III β-tubulin）。下文第3.3节中，我们列出了比色法和荧光法PECAM免疫标记的实验方案。</li>
	<li>在首次加入一抗之前，需将载玻片进行真空干燥，以去除多余的缓冲液。此外，需先用蜡笔在组织周围划线，防止抗体溶液不受控制地扩散至组织外。最后，所有标记步骤之后均需进行洗涤步骤。洗涤时，将载玻片置于染色缸中，并在洗涤期间更换缓冲液三次。</li>
	<li>内皮细胞抗体标记操作流程：
		 PECAM比色法标记
		<ol>
			<li>一抗孵育：在每份组织上滴加约100–200 mL一抗溶液（将1:200稀释的小鼠单克隆生物素化CD31抗体溶于抗体稀释液中（含0.1%皂苷的PBS + 2% BSA）），确保整个组织被抗体溶液覆盖。室温孵育1小时。</li>
			<li>用含0.1%皂苷的PBS缓冲液洗涤组织30分钟。</li>
			<li>二抗孵育：在组织上滴加二抗溶液（Vector Laboratories公司的VECTASTAIN Elite ABC试剂，即链霉亲和素-过氧化物酶二抗溶液）。室温孵育1小时。</li>
			<li>用含0.1%皂苷的PBS缓冲液洗涤组织30分钟。</li>
			<li>用Vector Nova Red溶液孵育组织15分钟，随后用清水冲洗组织。</li>
			<li>封片：将载玻片在95%乙醇中浸洗10次，随后依次浸入两份100%乙醇溶液中，每次2分钟。然后将载玻片连续浸入两份100%二甲苯溶液中，每次2分钟。待其自然干燥后，在组织上覆盖一层薄薄的VectaMount封片剂，并加盖盖玻片。</li>
		</ol>
		 PECAM荧光标记
		<ol>
			<li>一抗孵育：在每份组织上滴加约100–200 mL一抗溶液（将1:200稀释的小鼠单克隆生物素化CD31抗体溶于抗体稀释液中（含0.1%皂苷的PBS + 2% BSA）），确保整个组织被抗体溶液覆盖。室温孵育1小时。</li>
			<li>用含0.1%皂苷的PBS缓冲液洗涤组织30分钟。</li>
			<li>二抗孵育：在组织上滴加二抗溶液（将1:100稀释的Streptavidin-CY3溶于抗体稀释液中（含0.1%皂苷的PBS + 2% BSA））。室温孵育1小时。</li>
			<li>用含0.1%皂苷的PBS缓冲液洗涤组织30分钟。</li>
			<li>封片：在组织上滴加等体积混合的PBS-甘油（50:50）溶液，加盖盖玻片，然后用指甲油密封盖玻片与载玻片之间的缝隙。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
5. 代表性结果
代表性大鼠肠系膜组织经PECAM免疫组织化学标记后的图像如图所示 图3. PECAM 标记可识别微血管网络重塑过程中各级血管的所有类型，并可用于量化刺激后特定时间点的血管生成指标。PECAM 标记还可用于区分小动脉与小静脉。供血小动脉通常比配对的小静脉具有更小的直径和更长的内皮细胞形态。图4）。根据血管直径及其在网络中的相对位置，可识别毛细血管和毛细血管出芽。重塑网络的典型特征包括毛细血管出芽增加、血管密度增高、血管化面积扩大以及小静脉扭曲度增加。对多种血管生成指标进行定量分析，可揭示网络生长的时间进程。图5毛细血管从已存在的血管中出芽，在第3至第5天达到高峰，并在第10天恢复至未刺激水平。这种短暂的出芽增加随后伴随着血管密度和血管化区域的增加。作为该模型中较大血管重塑的证据，小动脉和小静脉节段的数量也随时间推移而增加。
在我们的实验室中，该模型已被用于识别此重塑过程中特定时间点的细胞表型变化10, 11。例如，III型β-微管蛋白可标记血管新生过程中血管周围的周细胞（图6）。在未受刺激的组织中，III型β-微管蛋白的表达具有神经特异性；而在毛细血管出芽高峰期，该蛋白则由血管周围细胞表达。此类结果凸显了这一简单且稳健的血管生成模型在鉴定参与血管生成过程的新型细胞类型方面的应用价值。
<img alt="培养皿实验；油灰改性；改性前后；椭圆形孔。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
	图 1. 塑料载物台改性前后的图像。未改性的载物台为一个直径100 mm的培养皿。改性包括在中央切割出一个椭圆形孔，并在孔的边缘添加油灰或硅胶，以形成一个抬高且光滑的表面。该表面提供了一个内侧边界，便于对外翻的肠系膜窗进行灌流。比例尺为1 cm。
<img alt="肠系膜窗示意图；培养皿中肠道结构的解剖学研究。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
	图 2. 外翻肠系膜区域的图像。肠系膜窗定义为供应小肠的动静脉对之间的薄而半透明的膜。在组织外翻期间，肠系膜区域被展开并浸没于改良的培养皿内的生理盐水中。惰性黄色油泥为肠系膜穿过预先切好的孔洞提供了平滑的表面。比例尺为 1 cm。
<img alt="血管生长示意图，未刺激状态与第3天和第10天，随时间推移的血管变化。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
	图3. 来自未刺激组织以及肠系膜外翻术后第3天和第10天组织的肠系膜微血管网络代表性图像。PECAM标记显示了微血管网络的层级结构，包括小动脉（A）、小静脉（V）和毛细血管（C）。刺激后，微血管网络表现出毛细血管出芽（箭头）增加和血管密度升高。比例尺为100 μm。
<img alt="显示组织样本分析中动脉（A）和静脉（V）结构的组织学示意图。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
	图 4. 成年大鼠肠系膜微血管网络中微动脉/微静脉配对的代表性图像。在两幅图像中，微动脉（A）与微静脉（V）可通过相对较小的直径和拉长的内皮细胞形态加以区分。比例尺为 20 μm。
<img alt="血管生长分析，柱状图显示随时间变化的组织面积、毛细血管出芽数量和长度。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
	图5. 肠系膜外翻后微血管生长过程中血管生成指标随时间变化的代表性定量结果。A) 每单位组织面积的血管面积。B) 每单位血管面积的毛细血管出芽数量。C) 每单位血管面积的总血管长度。*表示与未刺激组相比具有显著差异。统计学比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），随后进行Dunn检验（p &lt; 0.05）。UN代表未刺激组。
<img alt="随时间变化的细胞生长荧光显微镜图像；未刺激、第3天和第10天的神经突生长情况。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
	图6. 未刺激组织及肠系膜外翻后第3天和第10天组织中肠系膜微血管网络的代表性荧光图像。免疫荧光标记的PECAM（红色）用于识别内皮细胞，III型β-微管蛋白（绿色）用于识别神经（箭头头）和血管周围细胞（箭头）。在毛细血管出芽过程中，血管周围细胞短暂上调III型β-微管蛋白的表达。在未刺激的微血管网络中，III型β-微管蛋白特异性表达于神经，不标记血管周围细胞。刺激后第3天，III型β-微管蛋白在微血管周围的血管周围细胞中呈阳性标记。至第10天，III型β-微管蛋白的表达模式开始恢复至未刺激状态。比例尺为50 μm。
<img alt="神经元网络的荧光显微图像，突触连接以红色和绿色突出显示。" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
	图 7. 图像支持在由肠系膜外翻刺激的微血管网络生长过程中追踪预先标记并局部施加细胞的可行性。在20分钟的外翻期间，将细胞灌流至肠系膜窗区域。术后第1天，在同一焦平面观察到DiI标记的细胞（红色）与PECAM阳性的微血管（绿色）。A, B) DiI标记的骨髓细胞呈现圆形和伸长形态的示例。在某些情况下（箭头），细胞沿微血管伸长排列。C) 在毛细血管芽尖端附近（箭头）的一簇DiI标记的间充质干细胞示例。比例尺为50 μm（A），20 μm（B, C）。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

该外翻模型于2006年首次报道，源自先前用于血管生成研究的大鼠肠系膜机械性损伤模型4-7，其结果与成熟的腹腔注射模型相当，后者同样利用大鼠肠系膜进行研究9。20分钟的外翻时间经实验确定可产生显著的血管生成反应。尽管该时间可作调整，但此设定允许局部应用血管生成抑制剂4以进行机制研究，也可直接施加外源性细胞用于细胞谱系分析。将细胞整合入重塑中的肠系膜组织的可行性，已由本实验室使用预标记的骨髓细胞和间充质干细胞的初步研究结果支持（图7），同时也得到腹腔注射人脂肪来源基质细胞后对其命运进行追踪的成功研究的支持14。在本实验室中，我们已利用该模型鉴定了血管生成反应过程中周细胞表型的动态变化10，并评估了在高血压等病理状态下血管生成的潜力12。与此模型相关的血管生成反应及细胞表型变化，也可在其他大鼠肠系膜血管生成模型中观察到，包括慢性低氧暴露模型10, 11。
外置模型的一个局限性在于，血管生成的确切触发机制尚不清楚。已有研究将肠系膜外置与肥大细胞脱颗粒以及组胺水平升高相关联6，但仍需进一步研究以深入理解其机制。血管生成刺激无疑是多因素共同作用的结果，可在微血管网络的各个层级中引发显著的重塑反应。尽管未知机制仍是该模型受到的主要批评之一，但其可重复性和操作简便性使其成为研究固有复杂毛细血管出芽过程中涉及的细胞动态的理想选择。本实验室先前发表的研究表明，在不同大鼠品系（雄性Wistar大鼠和雌性Sprague-Dawley大鼠）中，微血管网络生长过程中的血管生成指标具有可比性，支持了该模型的可重复性10, 12。由于大多数成年大鼠肠系膜组织均已具备血管化，该模型还允许在单只动物中检测多个组织样本。然而，该模型在遗传性小鼠模型中的应用并不明显，因为小鼠肠系膜窗的天然血管化程度较低，且根据我们的经验，通常缺乏可观测的分支网络。未来的研究方向包括利用活体显微镜在特定时间点研究血管生成过程中的血管功能，以及探究与淋巴管生成和神经发生相关的细胞动态过程。尽管每个肠系膜窗的天然血管化程度似乎大致与年龄成正比，但我们已在低至4–5周龄的雄性Wistar大鼠中观察到分支状微血管网络。这些观察结果提示，外置模型也可用于比较不同年龄阶段的血管生成差异。

<table><tbody><tr><td>手术巾</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&quot;x12&quot; Bio-Shield 常规灭菌包装材料</td></tr><tr><td>诺伊斯显微剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5677</td><td>诺伊斯显微解剖弹簧剪刀；&lt;br/&gt; 直头，尖端锐-钝；13mm 刃口长度；0.25mm 尖端宽度；总长 4 1/2&quot;</td></tr><tr><td>格拉费镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td>显微解剖镊；带齿；轻微弯曲；0.8mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td></tr><tr><td>格拉费镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>显微解剖镊；带齿，直头；0.8mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td></tr><tr><td>4-0 缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>699G</td><td>（1.5 公制）ETHILON 尼龙缝线 黑色单丝</td></tr><tr><td>5-0 缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8556</td><td>（1.0 公制）PROLENE 聚丙烯缝线 蓝色单丝</td></tr><tr><td>7-0 缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1647G</td><td>（0.5 公制）ETHILON 尼龙缝线 黑色单丝</td></tr><tr><td>卡斯特罗维霍显微持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-02</td><td>尖端宽度：0.6mm&lt;br/&gt; 夹持长度：5mm&lt;br/&gt; 长度：9cm&lt;br/&gt; 直头尖端</td></tr><tr><td>卡斯特罗维霍持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td>尖端形状：直头&lt;br/&gt; 尖端宽度：1.5mm&lt;br/&gt; 夹持长度：10mm&lt;br/&gt; 剪刀功能：无&lt;br/&gt; 锁定功能：有&lt;br/&gt; 长度：14cm&lt;br/&gt; 带齿：有</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9843</td><td>手术刀柄，#3；实心；4&quot; 长度</td></tr><tr><td>无菌外科刀片</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>不锈钢；10号规格</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td>斜边，可叠放</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;特定手术材料与工具表&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Merck &amp; Co.</td><td>MWI #: 011168</td><td>活性成分：每100mL含戊巴比妥钠390 mg，苯妥英钠50 mg</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/ml</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>MWI #: 009307</td><td>Anased 100 mg/ml（从MWI Veterinary Supply订购）</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Hospira Inc.</td><td>94-217-JT</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>011M8207</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBB4080</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-CY3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>096555</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Vector Nova Red</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;特定试剂表&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

大鼠肠系膜外翻：研究血管生成过程中细胞动态变化的模型

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

微血管网络的生长与重塑是伤口愈合、炎症、糖尿病性视网膜病变、肿瘤生长及其他疾病状态中的关键环节1, 2。网络生长通常归因于血管生成，即从已有血管中形成新血管的过程。血管生成过程还直接关联动脉生成，后者定义为毛细血管获得血管周细胞包覆并发生管腔扩大的过程。毋庸置疑，血管生成过程十分复杂，涉及细胞和分子水平上的多种因素3。要理解微血管网络如何生长，必须明确在血管生成过程中，网络层级结构在时间和空间上的动态变化。这些信息对于开发旨在调控血管生长的治疗策略至关重要。
本文所述的外置模型为刺激大鼠肠系膜血管生成提供了一种简单且可重复的模型。该模型改编自大鼠肠系膜的伤口愈合模型4-7，是通过腹腔注射促血管生成因子来诱导肠系膜血管生成的替代方法8, 9。外置模型的优势在于其仅需最小程度的外科干预，并可在相对较短的时间内，在允许对整个微血管网络进行二维观察至单细胞水平的组织中，显著且可重复地增加毛细血管出芽、血管面积和血管密度。所诱导的血管生长反映了生理环境中自然的血管生成反应，且不受外源性促血管生成分子的干扰。通过免疫组织化学标记方法，该模型已被证实对于识别血管生成过程中涉及的新细胞事件极为有用。研究人员可轻松将重塑过程中的血管生成指标与特定时间点的动态变化（如细胞表型改变或细胞间相互作用）进行关联分析4, 5, 7, 10, 11。

本文介绍了一种用于刺激大鼠肠系膜血管生成的简单模型。该模型可在相对较短的时间内显著促进毛细血管出芽、增加血管面积和血管密度，且所用组织可实现整个微血管网络的正面对观察，观察精度可达单细胞水平。

微血管网络的生长与重塑是伤口愈合、炎症、糖尿病视网膜病变、肿瘤生长及其他疾病过程中的关键环节……

以下实验的目的是确定血管生成过程中的空间和时间细胞动力学，血管生成定义为从已有血管生长出新血管的过程。通过使用一种简单且可重复的模型，首先通过短暂暴露大鼠肠系膜来诱导血管生成，并在刺激后的不同时间点采集肠系膜组织。接着对组织切片进行免疫标记。例如，使用内皮细胞标记物来可视化组织内完整的重塑血管系统，并生成生长中的微血管网络的关键二维图像。该模型具有吸引力，因为综合来看，在相对较短的时间内，多种血管生成指标均显著增加。在单细胞水平上可视化血管网络，并将这些指标与多细胞标记相关联，已被证明在鉴定涉及毛细血管出芽的新型细胞表型方面极为有用。该方法有助于解答关于微血管网络生长过程中所涉及的细胞动态的关键问题，包括特定细胞在毛细血管出芽过程中的出现时间与位置。该方法的主要优点在于操作简便、所需外科干预极少，并且在相对较短的时间内即可产生显著的血管生成反应。此外，该方法利用了大网膜组织，这种组织可实现对完整网络直至单细胞水平的观察。根据我们的经验，该技术非常易于学习，因而可在不同研究人员之间稳定重复，以下将由本实验室的研究生 Peter Stapler 演示该操作流程。手术前准备步骤详见随附文本。剃除大鼠腹部区域的毛发后，将麻醉后的大鼠仰卧于加热垫上以维持体温，用浸有70%异丙醇的无菌纱布交替擦拭腹部区域，并用碘酒消毒。在胸骨下方约一英寸处，沿皮肤做一小段纵向切口，随后切开白线。将预先裁剪好的手术巾覆盖在腹部切口区域，使开口与切口对齐。轻轻按压切口周围以暴露小肠。使用棉签轻轻拉出一段小肠，将肠系膜平铺在含有无菌生理盐水的塑料载片上，并定位回肠部位。识别6至8个有血管分布的肠系膜窗，即为供应小肠的动静脉对之间的薄而半透明的膜。记录外置开始时间，并设置20分钟计时器。在靠近肠道的脂肪区域，用无菌7-0缝线标记两个位于中央位置的肠系膜窗。使用无菌的5毫升注射器间歇性地补充培养皿中的生理盐水，以确保组织保持浸没和湿润状态。在腹腔外暴露时间结束后，将肠系膜复位至腹腔内。用5-0单股缝线以间断缝合方式关闭腹肌。然后使用4-0单股缝线以间断缝合方式闭合皮肤，用浸有70%异丙醇的无菌纱布交替擦拭缝合区域，并用碘伏消毒。在大鼠双眼涂抹润滑凝胶，将其放回笼中恢复。在刺激后的目标时间点，根据机构指南对大鼠实施麻醉和安乐死。随后重新打开腹腔，用一块塑料薄膜覆盖腹部区域。现在用镊子和显微剪刀轻轻拉出小肠，并找到之前标记的两个观察窗。切除每个外翻的肠系膜窗，包括周围的一圈脂肪组织。应尽量避免切到脂肪边缘内的动静脉配对结构，以最大限度减少肠系膜窗内可能发生的血液积聚。同时应尽量避免切破肠壁，防止肠内容物溢出。接触窗片后立即将每片窗片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后使用镊子将组织铺在带正电荷的显微镜载玻片上，每张载玻片放置两个组织样本。待组织部分干燥后，用手术刀片去除多余的脂肪组织。将样本置于甲醇中，在负20摄氏度下固定30分钟，即将其放入冷冻机中。真空干燥载玻片以去除多余的缓冲液。此外，使用蜡笔在组织周围划线，以防止抗体溶液不受控制地流离组织区域。现在滴加约 200 微升稀释的一抗溶液，以覆盖整个组织。室温孵育 1 小时，用含 0.1% 吐温 20 的 PBS 洗涤组织，更换缓冲液三次。接着加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温孵育 1 小时，再经过三次洗涤后，将样品置于 Vector Nova Red 溶液中孵育 15 分钟。用清水冲洗以封片。在95%乙醇中浸洗10次，随后进行逐级脱水。待玻片干燥后，用薄层封片剂覆盖组织，真空干燥并标记后，盖上盖玻片。载玻片。用稀释的一抗溶液覆盖组织样本，在室温下孵育一小时。用含0.1%皂苷的PBS洗涤三次，每次10分钟。然后加入二抗，孵育一小时。用含0.1%皂苷的PBS进行洗涤，将切片封片于含甘油的PBS中，并用指甲油封固。本文详细介绍了对常用培养皿进行改造，以用作手术平台的方法。使用黄色油泥为肠系膜提供一个光滑的表面，使其能够通过预先切好的孔洞。再次说明，在外置期间，图中手术台上所示的肠系膜窗是指此处为肠道供血的动静脉对之间的薄而半透明的膜状结构。PCAM 标记可识别在体外化后特定时间点微血管网络重塑过程中的所有血管类型。这些图像可用于量化特定时间点的血管生成指标。刺激后。PCAM 标记可用于区分动脉与静脉。请注意，供血动脉通常比配对的静脉具有更小的管径和更长的内皮细胞形态。重塑血管网络的典型特征包括血管化区域、毛细血管出芽和血管密度。对这些不同血管生成指标的定量分析可表征血管网络生长的时间进程。在我们实验室中，已有血管的毛细血管出芽在第3至第5天之间达到峰值，并在第10天时恢复至未刺激水平。这种短暂的出芽增加随后伴随着血管化面积和血管密度的上升。该模型系统已被用于识别此重塑过程中特定时间点的新型细胞表型变化。免疫荧光PCA标记将内皮细胞染成红色，而III类β微管蛋白标记则将血管新生过程中血管周围的神经和寄生虫染成绿色。有趣的是，在未受刺激的组织中，III类β微管蛋白的表达具有神经特异性。相比之下，在毛细血管出芽的高峰期，血管周围细胞会表达 III 类 β 微管蛋白。这类结果凸显了该简单且稳健的血管生成模型在鉴定参与血管生成过程的新型细胞类型方面的应用价值。到第 10 天时，III 类 β 微管蛋白的表达模式开始恢复至未受刺激的状态。该模型还可用于细胞谱系研究。这些初步研究支持了细胞整合到重塑的肠系膜组织中的可行性，研究中在肠系膜窗暴露体外的20分钟期间，将预先标记的骨髓细胞或间充质干细胞叠加融合于肠系膜窗上。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用我们的大鼠肠系膜内移模型来研究微血管网络生长过程中的细胞动态变化。这种简单的技术操作大约需要45分钟至1小时。请记住，在手术后必须轻柔地处理肠系膜，避免刺破任何血管。可通过免疫标记来鉴定血管沿线的多种细胞类型。您还可以对淋巴管和神经进行标记。这使我们不仅能够研究血管生成过程中涉及的细胞表型变化，还能研究血管生成、神经生成和淋巴管生成之间的协调关系。

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

大鼠肠系膜外化：调查涉及在血管生成细胞动力学模型

用于研究以下两方面的正常成年哺乳动物血管化组织：该组织不具有生理性血管生成，且未接受过外科干预；（i）在腹腔内给予试验物质后，血管生成的启动与发展过程；（ii）在系统性给予选定试验物质后，对血管生成的调控作用。...

大鼠肠系膜血管生成实验

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。...

对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

本方案描述了在小鼠中建立的角膜微囊实验方法。...

角膜微囊实验：小鼠眼部血管生成模型

我们描述了一种Matrigel栓塞实验，通过两种互补的成像方式——超声成像和内窥显微成像，来展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜能。Matrigel是一种模拟细胞外基质（ECM）的凝胶，可用于将癌细胞分泌至条件培养基（C.M.）中的促血管生成因子引入宿主（小鼠）体内。...

监测由快速生长的肿瘤形成细胞分泌因子招募的血管系统的功能与形态

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。...

一个 离体 延时成像培养大鼠肠系膜微血管网络的方法

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in...

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

血管新生是发育和疾病中的基本过程，涉及复杂的分子和力学机制。本文介绍一种多功能的2.5D ex vivo...

2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

Christopher Hughes：血管生成研究的体外模型（访谈）

了解大鼠肠系膜外化模型用于血管生成研究，通过短暂外化刺激微血管网络生长，结合免疫组织化学标记实现单细胞水平的动态可视化与定量分析。

大鼠肠系膜外翻：研究血管生成过程中细胞动态变化的模型

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