Name: 挑战的药理功能磁共振成像:在临床前研究使用的5 - 羟色胺系统中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 了解药理学功能磁共振成像技术，用于在自由呼吸的活体动物中评估5-羟色胺神经递质功能。该方法结合氟西汀静脉给药挑战，可视化大脑血流动力学反应，为转化医学研究提供非侵入性成像手段。

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本工作由荷兰科学研究组织（NWO）（Veni 项目编号 916.86.125）资助，授予 L. Reneman。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。不存在利益冲突。

准备实验动物 体内 MRI成像
1. 外科套管术
<ol>
	<li>使用异氟烷（5%用于诱导，随后降低至1.5–2%以维持麻醉，期间给予医用空气（21% O2，BOC UK））对大鼠（雄性Wistar大鼠，200–300 g）进行麻醉。确保动物已充分麻醉，对脚趾夹捏无反应。分别对股动脉和股静脉进行插管，用于血气与血压测量以及药物干预给药。在手术过程中，通过直肠探头和加热毯（Harvard apparatus）监测并维持动物体温。</li>
	<li>将麻醉后的大鼠仰卧位置于解剖显微镜下的保温垫上。剃除大腿中部区域的毛发，并用酒精擦拭皮肤。沿腹部与右大腿交界处做一条长约2 cm的皮肤切口。钝性分离内收肌以暴露股动脉、股静脉及股神经。仔细分离血管。</li>
	<li>在血管远端轻轻用丝线完全结扎，并在近端位置打一半结，松松固定。牵拉两端结扎线，以阻断两结扎点之间暴露血管段的血流。在此段血管上做一小切口，切口大小约为血管周长的三分之一，以便插入PE-50导管（成年雄性大鼠使用内径0.54 mm、外径0.96 mm的导管；其他情况使用内径0.40 mm、外径0.80 mm的导管）。</li>
	<li>导管应插入血管数毫米（至少5 mm）。插入管腔后，通过导管灌注少量肝素化生理盐水（15 UI/ml），以防血栓形成。随后将近端丝线完全结扎，以固定导管。对第二根血管重复此操作。待两根导管均放置到位后，使用Vetbond组织粘合剂（3M UK plc, Bracknell, UK）将皮肤粘合。导管确切位置参见图1。</li>
	<li>将动物俯卧位置于磁共振兼容的立体定位床（m2m Imaging Corp., USA）中。通过耳杆和门齿杆固定动物头部。此时可将动物送入MRI扫描仪进行成像。整个成像过程中，动物保持麻醉状态并自主呼吸。</li>
</ol>
2. 监测
在整个成像过程中，应持续监测并尽可能保持多种生理反应的稳定。这一点至关重要，因为这些生理反应的变化时间窗可能与药理磁共振成像（phMRI）信号的时间窗相同，并且会影响目标信号。此外，由于动物将被置于磁体内部，无法直接观察，无法进行常规的麻醉深度评估（例如脚趾夹捏测试），因此持续监测有助于确保麻醉深度适宜。同时，鉴于许多药物会改变心血管参数（如血压），测量这些参数对于在phMRI数据分析中充分考虑药物作用引起的全身生理效应尤为关键。有关5 mg/kg氟西汀输注的基线值及预期生理反应，请参见第4节。
<ol>
	<li>使用暖空气加热系统（SA Instruments，纽约，美国）将体温维持在 37 ± 1.5 °C。请注意，磁共振成像可能影响温度测量，需使用您自己的系统进行验证。</li>
	<li>使用连接至压力传感器的呼吸监测带（SA Instruments，纽约，美国）监测并记录动物的呼吸频率。</li>
	<li>通过压力换能器（TSD104A，Biopac Systems Corp.，美国）记录有创动脉血压，并在成像期间经插管的股动脉定期采集并分析动脉血气样本（RapidLab，西门子诊断），以监测动脉血二氧化碳分压（pCO2）和氧分压（pO2）。</li>
	<li>将插管的股静脉作为药理学干预（氟西汀溶液（氟西汀盐酸盐，购自 Sigma-Aldrich，英国），5 mg/kg，溶于生理盐水）的主要输注通路。</li>
</ol>
体内成像
功能磁共振成像实验设置的示意图如图2所示。
3. 成像参数
<ol>
	<li>当动物被放入扫描仪后，若其生理反应持续稳定，即可开始成像。在我们的研究中，使用了一台4.7 T的小动物MRI系统（Agilent technologies），配备内径为72 mm的圆柱形正交发射/接收射频线圈（m2m Imaging Corp., USA）。获取三平面定位像，以将脑部准确置于MRI视野中心，并使用局部匀场校正（fastmap序列）提高脑区磁场的均匀性。</li>
	<li>对每只动物，首先采集T2加权的解剖图像体积数据，用于后续配准和分割。我们采用快速自旋回波序列，回波链长度 = 8；矩阵大小 = 256 × 256；视野（FOV）= 50 × 50 mm2；以交错方式采集30层连续的冠状面切片，层厚1 mm，中心位于嗅球后缘尾侧8 mm处；信号平均次数 = 4；TR/TE = 5112/60 ms。</li>
	<li>在开始药理学功能磁共振成像（phMRI）扫描前，确保动物的生理反应保持稳定。对于时间序列采集，我们使用相同的T2加权快速自旋回波序列，回波链长度 = 16；矩阵大小 = 128 × 128；以交错方式采集20层连续切片，层厚1 mm，中心位置与前述一致；TR/TE = 4915/60 ms。总共采集32个时间点，每个时间序列体积的采集时间为158秒，总扫描时间为84分钟。第一个体积数据作为“伪扫描”以消除T1饱和效应，在数据分析中不予使用。也可采用其他fMRI序列，如梯度回波或回波平面成像（EPI）序列。在实验开始前，务必评估所选序列的信号稳定性。</li>
	<li>在给予刺激性药物之前，需采集一定数量的基线体积数据。我们建议在稳定条件下至少采集10分钟的基线数据。所有动物的输注应严格在同一时间点开始。在本实验方案中，我们在第9个体积数据采集开始时启动给药（约基线扫描21分钟后）。输注结束后，继续成像60分钟（共采集32个体积数据）。请确保输注后的观察期足够长，以便观察信号变化，并根据研究问题及所选药物挑战的性质，达到稳态或信号恢复。</li>
	<li>图像采集完成后，将动物从扫描仪中移出。进行最终的血气测量，以确认血气参数的稳定性，并评估药物对基础生理功能的影响。</li>
</ol>
数据处理
4. 生理反应
对刺激的预期生理反应取决于所选用的药物。以下列出的是公认的大鼠成年雄性个体的基础值，以及静脉输注5 mg/kg氟西汀后的预期反应。
<ol>
	<li>呼吸频率应稳定在每分钟45-75次。使用氟西汀进行药理学刺激后，呼吸频率会出现短暂升高（15-20%）。</li>
	<li>血压应保持恒定，介于100-150 mmHg之间（Biopac Systems Corp., Goweta, USA）。氟西汀刺激会引起动脉血压短暂但急剧下降约20%，应在5-10分钟内恢复。如图3所示。</li>
	<li>开始phMRI扫描前，应至少两次测量血气值，确保其稳定并处于以下范围：pCO2为35-45 mmHg；pO2为80-130 mmHg；pH为7.35-7.45。扫描结束后应再次检查这些数值，以确认动物生理状态的稳定性，并评估药物对基础生理功能的影响。过高的pCO2值会引起血管扩张，从而掩盖BOLD信号的变化。</li>
	<li>在开始phMRI扫描前，必须确保动物处于持续且稳定的麻醉水平（2±0.25%；麻醉过深可抑制脑血管反应性，过浅则可能导致麻醉不足和动物移动）。尤其重要的是，在功能图像采集期间避免对麻醉方案进行任何调整（例如异氟烷浓度和/或气体流速），因为这些变化也可能影响BOLD信号。</li>
</ol>
5. 预处理 MRI 数据
本文介绍了磁共振数据预处理的若干步骤，旨在优化数据以用于统计分析。我们提及了本实验室所使用的工具，但也有许多其他不同的工具可供选择。
5.1 数据准备
<ol>
	<li>将原始图像转换为所选 MRI 分析软件支持的正确文件格式（如 FSL 程序使用的 NIfTI1.1 或 Analyze7.5 格式）。目前网上可获取多种免费的文件转换程序。根据所用扫描仪的不同，可能需要先将所有独立的二维切片重建为三维（解剖扫描）或四维（药理功能磁共振成像扫描）图像。此步骤可使用图像处理程序（如 ImageJ1）完成。</li>
	<li>为确保与专为人类数据设计的分析算法（例如 FSL 程序）兼容，需将体素尺寸放大 10 倍（此操作也可通过 ImageJ 等工具实现）。在本研究中，最终得到的体素尺寸为 3.91 x 3.91 x 10 mm3。</li>
	<li>目视检查图像是否存在方向异常、伪影或运动。分析时应避免使用存在明显伪影或过度运动的扫描图像，因其会扭曲分析结果。</li>
	<li>所有扫描图像的方向应在解剖图像与功能图像之间保持一致，并与所用参考脑图谱一致。在本研究中，我们采用了 Schwarz14 描述的立体定位大鼠脑图谱模板。可使用 FSL 命令 fslswapdim 进行图像重定向。</li>
</ol>
5.2 运动校正
<ol>
	<li>为了校正4D时间序列中可能存在的运动伪影，我们使用了运动校正工具McFlirt（基于FMRIB线性图像配准工具的运动校正，属于FMRIB软件库，<a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl" target="_blank">www.fmrib.ox.ac.uk/fsl</a>）。MCFLIRT是一种专为fMRI时间序列设计的模态内运动校正工具，其基础是FLIRT所采用的优化与配准技术；FLIRT是一种用于模态间脑图像线性（仿射）配准的全自动工具。每次运行后务必检查结果是否满意。</li>
</ol>
5.3 脑部分割
<ol>
	<li>对4D时间序列和3D解剖图像的整个头部图像，删除所有非脑组织。我们使用FSL工具BET（Brain Extraction Tool v. 2.1，FMRIB软件库的一部分，<a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl" target="_blank">www.fmrib.ox.ac.uk/fsl</a>）完成此步骤。默认参数是为人类大脑设计的，因此不适用于大鼠脑。我们使用的参数如下：信号强度分数阈值 f = 1.0；信号强度分数阈值的垂直梯度 g = 0.1；大多数动物的头半径（单位：mm）r = 175。如有必要，可针对每个个体优化这些参数值。</li>
</ol>
6. 数据分析
对磁共振（MR）数据进行统计分析的目标，是以具有统计学稳健性的方式确定那些因药物干预而表现出额外变异的体素。针对这一目标，存在多种方法学途径，以及数量众多的软件包可供选择。具体方法的选择取决于实验室中软件的可及性、研究人员的知识与经验，以及特定的研究问题。本文介绍了我们实验室所采用的一种推荐方法。
6.1
<ol>
	<li>在分析 MRI 数据之前，确定一个将用于拟合数据的一般线性模型（GLM）。该模型可以是一个简单的方块开关模型（给药前为“关”，给药后为“开”），也可以是基于数据构建的特定模型。我们曾使用程序 Stimulate21 来确定基于数据的 GLM 模型。</li>
	<li>对所有基线扫描数据与所有刺激后扫描数据进行双样本 T 检验（例如在 Stimulate 中进行）。可选地，可排除第一个或前几个扫描体积以及给予刺激时的扫描体积，因为这些数据可能未达到稳态成像状态。随后，筛选出相对于基线变化超过某一百分比的所有体素。我们采用了变化超过 1% 的所有体素。</li>
	<li>接下来，对这些体素中的时间过程进行平均，这已经可以初步反映模型的形态特征。通过此方法可判断刺激是否：1）产生即时或延迟效应；2）效应是否达到平台期和/或峰值，以及达到的时间；3）在扫描的时间过程中，效应是否再次下降。示例见图 4A 和 4B。</li>
</ol>
6.2
接下来，需要针对先前建立的 GLM 模型，对每只动物的原始 4D 时间序列图像进行统计检验。为此，我们使用了 FSL 软件中的 FEAT 程序（FMRI Expert Analysis Tool，v5.98）17,24。然而，也可使用其他 fMRI 分析工具。在分析工具中，需设置一级分析，具体包括以下步骤：
<ol>
	<li>确保对每只动物使用相同的设置。在分析前，可以选择删除前（两）个时间点的数据，因为此时可能尚未达到稳态成像。设置TR（重复时间）；这是每个连续扫描体积开始之间的时间间隔（单位为秒）。由于您所关注的效应可能持续整个扫描过程，因此无需设置高通或低通滤波器。</li>
	<li>对数据进行空间平滑处理，以降低噪声并提高信噪比（SNR）。我们选择使用8 mm的半高全宽（FWHM）核。</li>
	<li>现在在您的数据上运行所需的广义线性模型（GLM）。这是您的主要解释变量（EV），即您用于检验数据的波形。基于我们自身数据确定的GLM如图4C所示。您还可以添加其他可能的混杂解释变量（EV），例如运动参数、低频噪声（扫描仪漂移），甚至生理参数（如血压），以消除一般的生理药物效应。 
	在FEAT中：使用FILM预白化方法，添加时间导数。在“Contrasts &amp; F-tests”选项卡中设置对比。若要将单个EV转换为Z统计图，将其对比值设为1，这将显示所有时间进程可被GLM显著解释的体素。将该值设为-1则得到负激活结果。 </li>
	<li>完成初步统计检验后，需要对所得统计图进行阈值处理，以显示在特定显著性水平下哪些体素或体素簇被激活。由于测试的脑体素数量庞大，必须进行多重比较校正。FSL程序FEAT采用基于高斯随机场（GRF）理论的自动化基于簇的多重比较校正方法25。</li>
	<li>最后，应将数据空间标准化至参考图像，以便进行组水平统计分析。首先将功能数据配准至动物的脑组织提取后的解剖图像，再配准至参考图像。我们使用Schwarz14描述的立体定位大鼠脑模板作为参考脑。</li>
	<li>此后，可将所有动物的一级分析结果合并，进行更高级别（组水平）的统计分析。具体方法高度依赖于您自身的研究设计和科学问题。</li>
</ol>
6.3
此后，所有动物的一级分析结果可合并进行更高层次（组别）的统计分析。这在很大程度上取决于您自身的研究设计和科学问题。
6.4
如有需要，可将生理药物反应与MR信号进行关联或相关分析。另请参见关于添加混杂回归变量（confound EV's）的6.2.3节。
7. 典型结果
当给予难治性药物（5 mg/kg，静脉注射氟西汀）进入循环系统后，应可观察到呼吸频率（升高）和血压（降低）出现明显的生理反应。这些反应平均在5-10分钟内恢复正常。在图3中，血压的下降情况清晰可见。
平均信号时间过程应显示相对稳定的基线以及刺激任务的明显效应。理想情况下，信号不应出现与刺激无关的漂移。平均信号时间过程的代表性示例如图5A所示。伪迹（如呼吸抑制/衰竭或麻醉状态变化）通常在信号中清晰可见。呼吸抑制将对全脑信号产生负面影响，如图5B所示。 
一级分析后，激活模式预期主要为正性激活，且仅位于特定区域（即皮层区域、海马、下丘脑和丘脑；见图6A）。如果全脑均呈现去激活状态，通常提示麻醉过深和/或扫描期间缺氧。图6B展示了此种情况的一个示例。
<img alt="股动脉和股静脉解剖示意图；包含膝部附近的神经；解剖学研究设置。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 股动脉和股静脉中导管放置位置。
<img alt="磁共振成像（MRI）系统示意图，包含心电图、呼吸和温度监测。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. MRI 实验装置的示意图；所有设备均需为非铁磁性材料，并连接至一个模块化系统，以实现图像的门控采集，避免因呼吸和/或心跳引起的运动干扰。通过加热模块调节动物体温，以在成像过程中监测和控制动物体温。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3956/3956fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。

<img alt="血压随时间变化的曲线图；输注和导管阻塞的影响；心血管研究。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 血压数据的代表性示例。在输注开始后（红色条），血压明显下降。给药刺激后 10 分钟内恢复至正常水平。
<img alt="使用信号强度图和相关性图表进行MRI分析，分析神经活动变化。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. A) 使用MRI分析程序Stimulate预测的激活模式（红色表示正向激活，蓝色表示负向激活）。B) 所有动物中所有激活体素（相对于基线变化≥1%）的平均时间进程。C) FSL/FEAT中生成的GLM模型示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3956/3956fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="MRI时间序列分析示意图，显示脑部扫描数据及其对应的时间变化图形结果。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 
<ol class="ualpha">
	<li>正向激活示例。激活体素（红色）的时间进程大致符合一般线性模型（GLM）的形状。药物输注大约在第8个时间点开始。</li>
	<li>麻醉过深后全脑出现负向激活的示例。负向激活体素（蓝色）的时间进程显示信号普遍下降，且无法观察到刺激任务产生的任何效应。</li>
</ol>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3956/3956fig5large.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>。
<img alt="显示激活模式的脑部MRI扫描；热图分析；神经科学研究数据。" src="/files/ftp_upload/3956/3956fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 
<ol class="ualpha">
	<li>一级分析后的预期激活模式。仅在特定脑区出现体素簇的激活（红色至黄色）。</li>
	<li>“不良”激活模式示例。同一动物中全脑负激活（蓝色），见图 5B。</li>
</ol>

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<li>Stark, J. A., Davies, K. E., Williams, S. R., Luckman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+magnetic+resonance+imaging+and+c-Fos+mapping+in+rats+following+an+anorectic+dose+of+m-chlorophenylpiperazine%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Functional magnetic resonance imaging and c-Fos mapping in rats following an anorectic dose of m-chlorophenylpiperazine.</a> NeuroImage. 31, 1228-1237 (2006).</li>
<li>Steward, C. A., Marsden, C. A., Prior, M. J., Morris, P. G., Shah, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+in+rat+brain+BOLD+contrast+pharmacological+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations in rat brain BOLD contrast pharmacological MRI.</a> Psychopharmacology (Berl). 180, 687-704 (2005).</li>
<li>Strupp, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulate%3A+A+GUI+based+fMRI+Analysis+Software+Package%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Stimulate: A GUI based fMRI Analysis Software Package.</a> NeuroImage. 3, S607(1996).</li>
<li>Tomasi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylphenidate+enhances+brain+activation+and+deactivation+responses+to+visual+attention+and+working+memory+tasks+in+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Methylphenidate enhances brain activation and deactivation responses to visual attention and working memory tasks in healthy controls.</a> Neuroimage. 54, 3101-3110 (2011).</li>
<li>Woolrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+analysis+of+neuroimaging+data+in+FSL%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bayesian analysis of neuroimaging data in FSL.</a> NeuroImage. 45, S173-S186 (2009).</li>
<li>Worsley, K. J. Statistical analysis of activation images. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorsley%2C+KJ+%22Functional+MRI%3A+An+Introduction+to+Methods%22">Functional MRI: An Introduction to Methods</a>. Jezzard, P., Matthews, P. M., Smith, S. M. , OUP. (2001).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

5-HT phMRI 是一种有前景的工具，可用于在活体动物中评估神经递质功能。in vivo条件下，该技术通过功能磁共振成像可视化大脑对5-HT刺激的反应。磁共振成像具有高空间分辨率的显著优势，且无需注射对比剂或放射性标记分子，从而避免了反复暴露于电离辐射。该技术适用于人类和动物受试者，因此非常适用于神经递质系统及精神疾病领域的转化研究。该方法的应用当然不仅限于5-HT通路，已广泛用于评估多巴胺能药物在动物5,15和人类22中的作用。
然而，小动物phMRI仍具有挑战性，正如Martin和Sibson在综述文章中已指出的那样11 和 Steward20其中一个挑战是在图像采集过程中维持稳定的生理参数。大多数麻醉剂可能改变心血管功能，而由于药理学磁共振成像（phMRI）高度依赖于心血管/血流动力学参数，因此必须确保任何血流动力学变化仅归因于所给予的药物干预。因此，维持pCO₂在正常生理范围至关重要。2 在基线数据采集期间，各项指标保持恒定。机械通气有助于维持生理稳定性，常被用于此类实验。然而，我们选择采用自由呼吸的动物模型，以便为未来开展纵向研究保留可能性。取而代之的是，我们对呼吸频率和血气值进行了广泛监测（并进行调节），以确保在功能扫描开始前各项生理参数处于正常范围内，从而维持稳定的血管反应性及T2*/T2信号。关于全身麻醉剂对脑血流动力学和代谢影响的文献十分丰富。20 且超出本论文的范围。我们选择使用气体麻醉 &plusmn;2% 异氟烷，因为吸入性麻醉剂可以快速且方便地控制麻醉深度。这一点在我们的实验设置中非常重要，以确保 pCO₂ 处于正常稳定范围2 在开始图像采集之前调整麻醉水平。异氟烷是目前最常用的吸入性麻醉剂，可实现快速诱导和苏醒，这对于纵向研究尤为重要。此外，异氟烷对心血管和呼吸系统的抑制作用最小，并能有效松弛骨骼肌。
其次，在小型动物中静脉给予挑战性药物比在人类中更为复杂。股动脉和股静脉插管手术需要经过良好培训且经验丰富的人员操作。由于这些侵入性操作，目前该方法主要应用于终末性实验。然而，非侵入性的血液稳态监测结合尾静脉注射可用于纵向研究23。
此外，该技术还存在一些更为普遍的局限性，这些局限性并非动物phMRI所特有。另外，正如Martin和Sibson11所指出的，所有fMRI研究的一个潜在混杂因素是，通常假设由刺激引发的脑活动变化反映的是神经元活动的变化，而非外周系统性效应。尤其是在深部脑区，目前对神经血管耦合（即神经元活动变化与血流动力学变化之间的关系）的理解仍然相对有限。类似于Logothetis10在皮层中开展的用于确定神经血管耦合关系的研究，尚未在脑的其他区域进行。因此，我们尚不清楚在纹状体或杏仁核等重要结构中BOLD信号的增强究竟反映了怎样的神经元活动变化。目前我们最多只能认为，该脑区对给定刺激产生了反应，并且根据不同的处理方式和/或实验条件，我们可以监测到脑反应性的显著变化。这一点可通过同时分析MRI数据和生理反应在很大程度上得到验证。脑激活的一般模式应具有区域特异性，并局限于具有高5-HT神经支配的区域，而不是广泛的血管反应。此外，血管变化与血流动力学变化之间预期存在不同的时间特征。尽管血压变化通常在数分钟内恢复至基线水平，但药物对BOLD信号激活的影响（以氟西汀为例）可持续至图像采集结束，这与该药物已知的药代动力学特性相符。最后，为了进行个体间的比较，所有动物的生理反应应尽可能相似。然而，已知5-HT存在对局部血流的神经源性调节作用4。因此，不能排除BOLD信号的局部变化可能源于血管附近5-HT释放所导致的血管变化。尽管这些效应并非源于局部神经元激活，因而可能被视为假阳性结果，但它们同时也反映了5-HT系统整体特异性功能的一个指标（另见3）。
因此，该技术的关键步骤是广泛监测生理反应，并确保动物在图像采集前和采集期间的生理状况保持稳定。同时，扫描仪的条件也应尽可能稳定，并且每只动物的扫描条件必须完全相同。在实验开始前，应检查并确认所用序列的信号稳定性。此外，即使受试动物数量较少，也务必确保具有足够大的统计效能。有关动物药理学功能磁共振成像（phMRI）实验设计的全面综述，可参见 Steward 20；关于大鼠和小鼠药理学功能磁共振成像的另一个实验方案示例，可参见 Ferrari5。
此处所述技术的可能改进方法有很多。可以：
<ol>
	<li>使用不同的药物进行5-HT激发，例如其他SSRIs或5-HT受体（拮）抗剂16,13,18,7，甚至采用双重激发以揭示药物作用的潜在机制6,19；</li>
	<li>采用不同的实验设置，例如更换麻醉方案、使用机械通气、以血池对比剂替代BOLD15、进行纵向研究（需保持动物存活，因此无法进行有创血压/血气检测和/或机械通气），或与其他（有创）方法联用，例如使用MR兼容电极记录神经元活动10或进行PET/SPECT研究4；</li>
	<li>采用不同的MRI数据分析方法，例如McKie提出的“p-区组”法12或功能连接性分析15。</li>
</ol>
实验设计中的选择在很大程度上取决于您所在实验室的条件和/或经验，以及您希望回答的研究问题类型。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td><a href="http://www.abbott.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Abbott Laboratories</a></td><td>No B506</td><td>与医用空气混合使用</td></tr><tr><td>医用空气</td><td><a href="http://www.bochealthcare.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BOC Healthcare</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td><a href="http://www.harvardapparatus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Harvard Apparatus</a></td><td>507223F &lt;a href="http://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11555_39108_-1_HAUK_ProductDetail_N_37610_37611_37613" target="_blank"&gt;带柔性探头的完整恒温毯系统，中号，230 VAC，50 Hz&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>丝线结扎线</td><td><a href="http://www.harvardapparatus.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Harvard Apparatus</a></td><td>&lt;a href="http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_43051_-1_HAI_ProductDetail" target="_blank"&gt;2-0黑色编织丝线，不可吸收&lt;/a&gt; 货号 51-7631</td><td></td></tr><tr><td>PE-50导管</td><td><a href="http://www.scientificlabs.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Laboratory Supplies LTD</a></td><td>&lt;a href="http://www.scientificlabs.co.uk/product/TUB3662" target="_blank"&gt;Portex管材 PE 0.58×0.96 mm&lt;/a&gt;</td><td>内径0.58 mm，外径0.96 mm</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td><a href="http://www.leo-pharma.com/Home/Products/List-of-LEO-Pharma-products.aspx" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leo Laboratories</a></td><td>肝素钠 1000 IU/mL</td><td>15 U/mL</td></tr><tr><td> Vetbond 组织粘合剂</td><td><a href="http://solutions.3m.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 3M</a></td><td>&lt;a href="http://solutions.3m.co.uk/wps/portal/3M/en_GB/HealthCare/Home/ProdInfo/VetProducts/" target="_blank"&gt;MVetbond 组织粘合剂&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>监测系统</td><td><a href="http://www.i4sa.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SA Instruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.i4sa.com" target="_blank"&gt;http://www.i4sa.com&lt;/a&gt; &lt;a href="http://69.20.42.253/web_app/main/defaultProduct.aspx?ID=16&amp;amp;PT=3" target="_blank"&gt;Model 1025L 监测系统&lt;/a&gt;</td><td>监测呼吸和体温</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td><a href="http://www.biopac.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biopac Systems, Inc.</a></td><td>&lt;a href="http://www.biopac.com/blood-pressure-transducer" target="_blank"&gt;血压传感器 - TSD104A&lt;/a&gt; &lt;a href="http://www.biopac.com/data-acquisition-analysis-system-mp150-system-windows" target="_blank"&gt;MP150 数据采集系统 - WIN - MP150WSW&lt;/a&gt;</td><td>监测血压</td></tr><tr><td>RapidLab 血气分析仪</td><td><a href="http://www.medical.siemens.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Siemens AG</a></td><td>&lt;a href="http://www.medical.siemens.com/webapp/wcs/stores/servlet/ProductDisplay%7Eq_catalogId%7Ee_-111%7Ea_catTree%7Ee_100001,1023069,1016115%7Ea_langId%7Ee_-111%7Ea_productId%7Ee_172940%7Ea_storeId%7Ee_10001.htm" target="_blank"&gt;RAPIDLab 248/348 系统&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>4.7T 动物扫描仪</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>4.7T 频率 199.845 MHz</td></tr><tr><td>磁共振兼容立体定位床</td><td><a href="http://www.m2mimaging.com/products/preclinical.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> m2m Imaging Corp</a></td><td>大鼠床：PA 多元件 AHS 50-72-1003/100</td><td></td></tr><tr><td>线圈</td><td><a href="http://www.m2mimaging.com/products/preclinical.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> m2m Imaging Corp</a></td><td>体积 TH/Rx RQD1 72/112 200</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氟西汀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-132</td><td>5 mg/kg 溶于生理盐水</td></tr></tbody></table>

药理学挑战fmri在临床前研究中的应用：以5-ht系统为例

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

药理学磁共振成像（phMRI）是一种研究物质对脑功能影响的新兴且具有前景的方法，最终可用于揭示药物作用以及与神经递质相关疾病（如抑郁症和注意缺陷多动障碍，ADHD）背后的神经生物学机制。与大多数成像方法（PET、SPECT、CT）类似，它在以非侵入性方式研究脑部疾病及相关神经递质通路功能方面取得了进展，同时保持了对整体神经元连接性的尊重。此外，它还为向临床研究转化提供了理想工具。尽管在分子成像策略方面，MRI目前仍落后于PET和SPECT，但其具有空间分辨率高、无需注射对比剂或放射性标记分子的显著优势，从而避免了反复暴露于电离辐射。功能磁共振成像（fMRI）已在科研和临床环境中广泛应用，通常与心理运动任务结合使用。phMRI是fMRI的一种改进形式，能够在生理或病理条件下，通过给予特定的激发药物激活后，对特定神经递质系统（如5-羟色胺（5-HT）系统）进行研究。
本文所述方法的目的是评估自由呼吸动物的脑内5-HT功能。通过在持续采集随时间变化的功能性磁共振图像的同时对5-HT系统进行干预刺激，可以可视化大脑对此刺激的反应。已有多个动物研究表明，药物诱导引起的细胞外5-HT水平升高（如释放剂、选择性再摄取抑制剂等）可引发脑区特异性的血氧水平依赖（BOLD）MRI信号变化（该信号源于脑激活过程中，为满足神经元对氧气和葡萄糖的需求而增加血供，导致氧合与脱氧血红蛋白水平改变），从而提供一种神经递质功能的指标。此外，研究也表明，这些效应可通过降低5-HT可用性的干预措施而逆转16,13,18,7。在成年大鼠中，急性给予SSRI后已在多个与5-HT相关的脑区观察到BOLD信号的变化，例如皮层区域、海马、下丘脑和丘脑9,16,15。因此，对5-HT系统的刺激及其对刺激的反应可作为评估其在动物和人类中功能状态的一种指标2,11。

该技术的目的是利用药理学磁共振成像（phMRI）结合静脉注射选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）氟西汀，评估活体且自由呼吸动物中5-羟色胺（5-HT）神经递质的功能。

药理学挑战fMRI在临床前研究中的应用：以5-HT系统为例

药理学磁共振成像（phMRI）是一种研究物质对脑功能影响的新兴且具有前景的方法，最终可用于揭示……

以下实验的总体目标是通过药理学磁共振成像结合静脉注射选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀，评估自由呼吸动物体内5-羟色胺（即5-HT神经递质）的功能。该方法通过在初始基线测量后，将功能性磁共振成像（fMRI）与药物激发相结合，用于可视化特定药物在实验开始前及进行过程中引发的脑血流动力学反应。为确保fMRI所观察到的脑部反应完全归因于给予的药理学刺激，必须对动物的生理反应进行广泛监测与维持。最后，对 MRI 数据进行统计学分析，以确定大脑中信号相对于基线值发生变化的体素，这些变化可归因于5-羟色胺能刺激。由此获得的结果可基于功能磁共振成像所测量的大脑对5-羟色胺能刺激的反应，反映大脑5-羟色胺功能状况。该技术相较于现有的成像方法（如 PET 或 SPECT）的主要优势在于其侵入性更小，因为无需使用放射性示踪剂。因此，该技术非常适合用于转化研究，因为它也可应用于儿童或患者等脆弱人群。尽管该方法可提供关于5-羟色胺系统功能的信息，但在使用不同药物激发时，也可应用于其他神经递质系统，例如使用苯丙胺激发来研究多巴胺能系统。开始本实验时，首先将大鼠完全麻醉，然后分离股动脉和股静脉，用于血气和血压监测以及激发药物的给药。手术完成后，将麻醉水平降至2%以维持麻醉状态。根据动脉血气值进行调整。使用暖风加热系统将体温维持在37摄氏度的±1.5摄氏度范围内，并注意磁共振成像（MR Imaging）可能对体温产生影响。也可在立体定位床内放置温水垫。接下来，将动物以俯卧位置于与磁共振兼容的立体定位床中，并使用耳杆和门齿固定器以维持头部位置。将连接至压力传感器的呼吸监测环置于动物下方，以监测并记录动物的呼吸频率。在成像过程中。同时将动脉导管连接至压力传感器，以监测动脉血压。此处使用一台4.7特斯拉的小动物MRI系统，配备内径为72毫米的圆柱形四通道射频发射/接收线圈。然后将床体置入MRI扫描仪的孔洞中。将动物放入扫描仪后，应持续监测其生理反应，以确保动物在整个过程中保持稳定、完全麻醉且自由呼吸。对于活体成像，重要的是在pH MRI扫描期间避免对麻醉方案进行任何调整，因为这可能会影响MR信号，动脉血气值应保持稳定，并处于此处显示的范围内。开始pH MRI扫描前，若有必要，可轻微调整麻醉水平以调节呼吸深度，并检查各项数值。片刻之后，呼吸频率应稳定在每分钟45至75次，血压应保持恒定，介于100至150毫米汞柱之间。药理学刺激将引起上述指标的变化，具体如所述。在后续的实验流程中，首先获取三平面定位像，以将大脑正确置于磁共振成像视野的中心位置。然后使用局部匀场校正以提高磁场均匀性。接下来，采集T2加权的解剖图像体积数据，用于配准和分割。建议获取以嗅球后缘为中心、厚度为一毫米的30个冠状切片。有关确保所有生理反应保持恒定的具体成像参数，请参见原文。继续在此处进行pH MRI扫描。采用T2加权快速自旋回波序列，采集32个体积数据，总扫描时间为84分钟。在给予激发药物之前，需采集至少10分钟的基线期体积数据。务必确保在同一批实验动物中，输注开始时间完全一致。在本方案中，给药是在基线扫描约21分钟后、第九个体积扫描开始时进行。需注意，使用氟西汀进行药理学干预将引起呼吸频率短暂升高15%至20%，以及动脉血压短暂但急剧下降约20%。这应在5到10分钟内恢复。确保输注后的成像时间足够长，以观察信号变化，并根据研究问题和药物干预的选择，达到磁共振信号的稳态或恢复状态。成像结束后，将动物从扫描仪中取出，并进行最终的血气测量，以确保在图像采集过程中血气参数的稳定性。以下是磁共振数据预处理的几个步骤，旨在优化数据以用于统计分析。文中提到的工具仅为建议，实际上有许多不同的工具可供选择。首先，将所有原始图像转换为与所使用的磁共振成像分析软件兼容的文件格式。然后，为了确保与专为人类数据设计的分析算法兼容，应将狐洞大小乘以10倍。务必目视检查图像是否存在异常和方向伪影、信噪比情况，并舍弃存在明显伪影或过度运动的扫描数据，因为这些因素会扭曲您的结果。所有扫描数据的方向在解剖像和功能像之间应保持一致，并与所使用的参考脑模板相匹配以进行校正。针对四维时间序列中出现的任何运动伪影，使用运动校正工具（如 FSL 的 FLIRT），该工具采用精细的模态间脑图像配准方法。接下来，对四维时间序列和三维解剖图像均进行脑部分割。对此，可使用 FSL 工具 BET。默认设置适用于人脑。因此，务必针对大鼠脑优化参数值。统计分析的目标是确定那些因药物干预而表现出额外变异的体素。有多种方法和软件包可用于此目的。此处提供一种在分析前建议采用的方法。首先必须确定一个可用来检验数据的通用线性模型。这可以是一个简单的开关方波模型，也可以是基于数据的特定模型。对于数据驱动模型，对所有基线期体积与所有刺激后体积进行双样本T检验。第一个体积以及给予刺激时的体积应予以排除，因为它们可能无法代表稳态成像；随后筛选出与基线相比变化超过某一特定百分比（例如平均变化1%）的所有体素，并对这些筛选出的体素的时间过程进行平均，以获得模型形态的大致特征。这可以判断该干预是否产生了即时或延迟效应，效应是否达到平台期或峰值，以及在扫描的时间过程中效应是否再次下降。可对所有动物进行此分析，然后再次取平均值，以获得所有动物的平均信号变化。这将作为您数据驱动的广义线性模型（GLM）的基础。接下来，在分析工具中必须设置一级分析。设置 TR，并注意无需设置高通或低通滤波器，使用半高全宽为八毫米的核对数据进行空间平滑。现在，将每只动物的原始四维时间序列图像与先前建立的一般线性模型进行统计检验。这是您的解释变量，即与数据进行比对的波形或设计矩阵。接下来，对所得的统计图像应用一个阈值，以标示在特定显著性水平下哪些体素或体素簇被激活。由于所检验的体素数量庞大，应使用多重比较校正方法。最后，将数据进行空间标准化处理，以参考图像为基准，从而进行组水平统计分析。首先，将功能数据配准到该动物脑组织提取后的解剖图像，然后再配准到参考图像。随后点击“go”运行分析，并检查结果。此后，所有动物的一级分析结果可合并用于更高水平的统计分析。具体方法高度取决于您自身研究的设计与科学问题。如有需要，记录的生理反应也可与MR信号进行关联分析。当这种具有挑战性的药物进入血管系统后，应能观察到明确的生理反应。氟西汀会导致呼吸频率增加以及血压下降。这些反应通常在5到10分钟内平均恢复正常。此处，血压的下降清晰可见。这里可以清楚看到一个激活体素的阳性示例及其对应的信号时间过程。在激活体素中的平均信号时间过程应显示出相对稳定的基线，以及刺激任务引起的明显变化。理想情况下，信号伪影中的依赖性漂移不应构成干扰，例如呼吸抑制、麻醉减退或麻醉状态改变等情况通常在信号中清晰可见。此处显示的是经过一级分析后，因呼吸抑制导致总体信号丢失的一个示例。激活模式预期主要为阳性，且仅局限于特定的与5-羟色胺相关的脑区，例如皮层区域、海马、下丘脑和丘脑。如果整个大脑显示出磁共振信号的线性下降，这通常提示存在更广泛的系统性效应。例如，深度麻醉或呼吸抑制也会导致类似现象。您还应充分理解如何利用药理学磁共振成像技术结合静脉注射选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，来评估清醒且自由呼吸动物体内5-羟色胺神经递质功能。请注意，高磁场环境可能具有极高的危险性，在进行此操作时，必须始终采取预防措施，避免任何磁性金属物体进入磁场区域。这意味着在图像采集过程中用于监测动物的所有设备都应具备更高的兼容性。

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