Name: 确定土壤传播的蠕虫感染状况和体质的学龄儿童 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解如何使用Kato-Katz法和Erman法诊断学龄儿童的土源性蠕虫感染，并通过20米往返跑测试评估其体能状况。该方法有助于研究寄生虫感染对儿童健康的影响。

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作者感谢中国云南省和科特迪瓦阿博维尔的社区参与上述研究。我们感谢当地现场团队在检测和执行方案过程中提供的协助。我们特别感谢来自瑞士热带与公共卫生研究所的以下同事：Yvette Endriss 提供显微图像，Hanspeter Marti 及其团队提供实验室支持，Stefanie Krauth 在视频拍摄期间给予协助。最后，我们感谢两位匿名审稿人提出的系列有益意见。

1. 柯托-卡茨法
<ol>
 <li>将一个标准的Kato-Katz模板（孔洞可容纳41.7毫克（mg）粪便）放置在显微镜载玻片上。</li>
 <li>用小勺取2-3克（g）新鲜粪便样本置于报纸或铝箔纸上，将一块金属丝网或塑料筛网压在样本上进行过筛。</li>
 <li>使用小型塑料刮刀将筛过的材料从筛网上刮下，并完全填满Kato-Katz模板上的孔洞。用刮刀刮平孔洞表面，去除多余的粪便材料。</li>
 <li>垂直取下模板，避免扰动已粘附在显微镜载玻片上的粪便样本。模板和刮刀可用含洗涤剂的水清洗后重复使用。</li>
 <li>将一片预先在甘油-孔雀绿溶液中浸泡至少24小时（hr）的透明纸覆盖在载玻片上的粪便样本上。</li>
 <li>为将粪便材料涂布成厚涂片，用另一块干净的载玻片轻轻按压样本载玻片，使材料均匀展开，形成一个直径略小于载玻片宽度的圆形涂片。</li>
 <li>将载玻片静置透明化30-60分钟（min），期间须避免阳光直射。随后在光学显微镜下（40-100倍放大）系统性地检查厚涂片，计数土壤传播蠕虫（STH）虫卵数量，并按虫种分类（即 A.lumbricoides、T.trichiura 和钩虫）。需要注意的是，该方法也可检测其他蠕虫卵（如 Schistosoma mansoni），应单独计数并记录。</li>
 <li>为获得标准化的感染强度估计值（通常以每克粪便虫卵数（EPG）表示），将虫卵计数乘以24（24 × 41.7 mg ≈ 1 g）。</li>
</ol>
2. 贝尔曼法
<ol>
 <li>架设一个能够固定玻璃漏斗的支架，并在漏斗底部连接一根带有夹子的橡胶管。</li>
 <li>将一个筛子或锥形金属网筛放入漏斗中，并在其上铺一层医用纱布。</li>
 <li>用自来水注满漏斗，确保整个装置无泄漏。</li>
 <li>取 20–30 g 新鲜粪便样本，置于医用纱布中央，并确保其完全浸没于水中；必要时可添加更多水。将医用纱布包裹住样本并折叠封好。</li>
 <li>从下方用人工光源照射漏斗，持续 2 小时。</li>
 <li>轻轻松开橡胶管上的夹子，将漏斗中下部 50 毫升（ml）水样缓缓排入离心管中。</li>
 <li>以 600 × g（相对离心力）离心 5 分钟，小心倾去上清液，注意不要扰动沉淀物，保留管底最后几滴液体。</li>
 <li>将沉淀物重新悬浮，用移液器吸取 2 滴溶液滴加至显微镜载玻片上，使用光学显微镜观察（检测时采用 40 倍放大，种属鉴定时采用 100–400 倍放大）。粪类圆线虫（S. stercoralis）的一期幼虫（L1）在显微镜下呈活体状态并具有活跃运动能力。</li>
</ol>
3. 20米往返跑测试
<ol>
 <li>测量一段20米平坦且笔直的跑步路线，并用锥形标志物标记。</li>
 <li>协助测试参与者将心率监测仪佩戴在手腕上，并将相应的发射器绑在胸部18。该设备可用于测量参与者在测试前后的心率，从而监测其是否已达到最大努力程度。</li>
 <li>指导参与者根据预先录制的声音信号节奏在跑道上来回跑动，声音信号用于界定每20米一个的跑段。起始跑步速度为8.5千米每小时（km/hr），此后每分钟声音信号提示20米间隔的频率递增，相当于速度每分钟增加0.5 km/hr。</li>
 <li>确保参与者每次听到信号时开始新的20米跑段，并在下一个信号出现前完成该跑段。</li>
 <li>若参与者连续两次未能跟上节奏，则停止测试。</li>
 <li>记录参与者完整完成的最后一个跑段所对应的最大跑步速度，同时记录参与者的年龄和性别。</li>
 <li>确认测试结束时参与者达到的心率为其最大心率19。若未达到该心率，表明参与者可能未尽最大努力，因此应重复测试。</li>
 <li>使用Léger及其同事提出的一个公式估算参与者的最大有氧能力（VO2 max）：VO2 max = 31.025 + 3.238 * 速度（km/hr） - 3.248 * 年龄（岁） + 0.1536 * 速度（km/hr） * 年龄（岁）。</li>
</ol>
4. 典型结果
采用Kato-Katz技术诊断土源性线虫病时，不同蠕虫卵的独特特征可用于鉴定大多数虫种20。A.lumbricoides虫卵（长约45-75微米（μm），宽约35-50 μm，图1）的壳壁比T.trichiura（图2）和钩虫（图3）的虫卵更厚。A.lumbricoides的受精卵（图1）具有外层蛋白膜，使其呈金棕色，而非受精卵则缺乏该外层膜，形状略为细长，整体稍大。T.trichiura虫卵（长约50 μm，宽约22 μm，图2）呈细长形，具有明显的极塞结构。而钩虫虫卵（长约64-76 μm，宽约36-40 μm，图3）具有极薄的壳壁，其内围绕着虫卵中央致密的细胞团，可见一圈清晰的环状结构。
S.stercoralis L1 期幼虫（图4）长约 180–380 μm，口囊极短。可观察到明显的生殖原基（图4 中以蓝色箭头标示），幼虫尾部（图4 中以红色箭头标示）末端尖锐。
由于肠道寄生虫感染（STH）对儿童身体素质的真实影响仍在争论中13,14,15，目前尚无具有代表性的结论性结果。20米往返跑测试结果的解读方式有多种。可在年龄、性别、其他潜在相关健康状况、社会经济地位和文化习惯等方面相似的感染者与非感染者之间比较儿童的身体素质。这可通过横断面调查实现13,14,15，即在特定时间点评估感染与非感染儿童的STH感染状态和身体素质。若采用随机对照试验设计，对学龄儿童在驱虫药/安慰剂治疗前后的身体素质进行评估，从而实现短期和长期效果的双重评价，则所得证据的强度更高。研究还可进一步尝试确定STH感染强度与身体素质之间可能存在的剂量-反应关系，并将不同水平的多重寄生感染1与身体素质进行比较。Yap及其同事的研究15表明，与未感染T.trichiura的儿童相比，感染T.trichiura的儿童其VO2 max所反映的身体素质显著降低（图5）。
<img alt="显微镜下的花粉分析；对比图；微结构研究；图像比例尺 50 µm。" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. A.lumbricoides 虫卵的显微图像：受精卵（A）和未受精卵（B），放大倍数为 500 倍。比例尺 = 50 μm。
<img alt="50μm 下的蠕虫卵显微镜图像，突出显示形态学和寄生虫学研究。" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图 2. T.trichiura 卵在 500 倍放大下的显微图像。 比例尺 = 50 μm。
<img alt="寄生虫鉴定，显微镜图像，50 µm 比例尺，用于诊断研究的蠕虫卵。" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. 500倍放大下钩虫卵的显微图像。比例尺 = 50 μm。
<img alt="微生物生态学研究；显微镜下的土壤线虫；生物体鉴定与分析。" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. S. stercoralis L1 幼虫在 250 倍放大下的显微图像。箭头指示尾部（红色）和生殖原基（蓝色）。比例尺 = 100 μm。
<img alt="感染鞭虫与体能水平关系图；按年龄分组的儿童最大摄氧量，感染者与非感染者对比。" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 显示感染T. trichiura的儿童与未感染T. trichiura的儿童体能水平的对比图。

<ol><li>Steinmann, P., Utzinger, J., Du, Z. W., Zhou, X. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparasitism%3A+a+neglected+reality+on+global%2C+regional+and+local+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Multiparasitism: a neglected reality on global, regional and local scale.</a> Advances in Parasitology. 73, 21-50 (2010).</li>
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<li>Steinmann, P., Zhou, X. N., Du, Z. W., Jiang, J. Y., Wang, L. B., Wang, X. Z., Li, L. H., Marti, H., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurence+of+Strongyloides+stercoralis+in+Yunnan+province%2C+China%2C+and+comparison+of+diagnostic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Occurence of Strongyloides stercoralis in Yunnan province, China, and comparison of diagnostic methods.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 1, e75(2007).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的三种方案已在中华人民共和国云南省西南部的布朗族少数民族群体中21，以及非洲不同地区6,13,14进行了测试和实施。
Kato-Katz 技术有多种模板可供选择。每种不同孔径的模板会取用不同量的粪便样本。因此，在计算每克粪便虫卵数（EPG）时，必须明确模板的单位，以便将计数得到的虫卵数量乘以正确的换算系数，从而获得准确的 EPG 估计值。此外，当调查地区存在钩虫感染时，必须在制片后尽快读片（透明时间为 30 分钟，但最长不得超过 60 分钟）。主要原因是，在较高温度下，钩虫卵会迅速崩解22。从研究对象排便到样本检测之间的时间间隔也至关重要，若间隔达到 3 小时或更长，Kato-Katz 技术对钩虫诊断的敏感性可能降低 50%23。最后，为了提高 Kato-Katz 技术的诊断敏感性，特别是在土壤传播蠕虫感染强度较低的地区，应采集同一参与者的多份粪便样本，并对每份粪便样本制备双份或三份 Kato-Katz 厚涂片7,24。
<p class="jove_con...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">注：本列表中的材料为通用材料，可从不同来源获取。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Kato-Katz 试剂盒&lt;br/&gt; [400 个塑料模板，每个模板上有一个直径为 6 毫米（mm）、厚度为 1.5 mm 的孔；400 个塑料刮刀；20 米长、80 目尼龙筛网；20 米长、34 &amp;mu;m 厚的亲水性玻璃纸]</td><td>Vestergaard Frandsen</td><td></td><td>请注意，该试剂盒不包含甘油-孔雀绿溶液，需从任意化学试剂供应商处单独购买。</td></tr><tr><td>玻璃漏斗 [约 8 厘米（cm）宽，6 cm 深]</td><td></td><td></td><td>用于贝尔曼法（Baermann technique）的玻璃漏斗应能容纳约 60 mL 水。橡胶管和纱布的尺寸取决于所用玻璃漏斗的类型。</td></tr><tr><td>生物显微镜</td><td>Olympus</td><td>CX21LED/CX21</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>上海医疗器械集团</td><td>80 - 2T</td><td></td></tr><tr><td>预录制信号</td><td>Bitworks Design</td><td>Team Bleep 测试版本 1.3.1</td><td>iPhone 应用程序</td></tr><tr><td>心率监测仪</td><td>POLAR</td><td>FT1</td><td>手表和发射器</td></tr></tbody></table>

确定学龄儿童土壤传播性蠕虫感染状况与身体素质

Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

土壤传播的蠕虫（STH）感染十分常见。事实上，全球有超过10亿人受其影响，主要集中在贫困普遍、卫生习惯不良、供水和卫生设施常常不足的发展中国家1,2。Ascaris lumbricoides、Trichuris trichiura以及两种钩虫Ancylostoma duodenale和Necator americanus是最常见的STH种类3。据估计，钩虫病、蛔虫病和鞭虫病所导致的全球疾病负担分别为2210万、1050万和640万伤残调整生命年（DALYs）4。此外，约有3000万至1亿人感染了Strongyloides stercoralis，这是全球范围内最受忽视但具有重要意义的STH种类，其对公共卫生的影响不容忽视5,6。多种蠕虫共感染（即同一感染者体内同时存在不同种类的STH）十分普遍，且这些感染已被证实与劳动生产率下降相关，从而影响发展中国家的经济前景1,3。
对于常见土源性蠕虫病的诊断，世界卫生组织（WHO）推荐使用Kato-Katz法7,8，这是一种相对简便的方法，用于确定此类感染的流行率和感染强度。该方法有助于检测感染者粪便中排出的寄生虫虫卵。
关于S.stercoralis的诊断，目前尚无简单且准确的检测工具。巴曼法（Baermann technique）是目前应用最广泛的方法。该方法的原理是，由于S.stercoralis幼虫具有趋光性9，在光照条件下，活的幼虫会从新鲜粪便样本中迁移出来。与培养法和免疫学方法相比，该方法对实验设备的要求较低，且耗时更短5。
与土壤传播的蠕虫感染（STH）相关的疾病范围从腹痛、腹泻和瘙痒等常见但急性症状，到贫血、营养不良、体重不足以及认知功能障碍等慢性症状10。由于这些症状通常不具特异性且较为轻微，常被忽视，感染者可能将其视为正常状态，或误认为是其他在特定环境中更常见疾病的症状。因此，可以推断，依赖于个体自述症状和体征的评估工具往往会低估STH感染的真实疾病负担，而基于人群的调查通常正是采用此类方法。
20 世纪 80 年代末至 90 年代初，Stephenson 及其同事指出，土壤传播的蠕虫（STH）感染可能降低 6 至 12 岁男童的身体素质11,12。近年来，这一科学探索方向重新获得了关注13,14,15。20 米（m）往返跑测试由 Léger et al.16 开发并验证，目前在全球范围内用于评估儿童的有氧适能17。该测试易于标准化，只要有 20 米长且平坦的跑道以及音频播放设备即可实施，因此在资源有限的环境中具有较高的应用价值13。为了促进并标准化评估 STH 感染对学龄儿童身体素质影响的研究，我们提供了一系列简单易行、同时又能提供准确且可重复结果的方法，用于诊断 STH 感染或测量身体素质。这将有助于生成关于 STH 感染健康影响的新证据。

长期感染土源性蠕虫（STHs）会导致生长发育期儿童出现营养吸收不良、生长迟缓和消瘦。因此，这些感染也可能降低儿童的身体素质。本文展示了两种用于诊断土源性蠕虫感染的技术，以及用于评估儿童身体素质的20米往返跑测试。

土源性蠕虫（STH）感染十分常见，全球受感染人数超过10亿，主要集中在卫生条件较差、贫困普遍存在的发展中国家……

以下方法学的目的是促进并标准化对经传播的线虫感染状况的评估，以及评估此类传播的线虫感染是否影响学龄儿童的身体健康状况。通过采用加藤-卡茨法（Kato-Katz technique）来诊断常见的经土壤传播的蠕虫感染，主要包括蛔虫（Ascaris lumbricoides）、钩虫（hookworms）以及鞭虫（Trichuris trichiura）。第二步采用麦克马斯特法（McMaster technique），这是目前最广泛使用的粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）诊断方法。接下来，为了评估儿童的身体素质，进行20米往返跑测试。根据上述方法，获得的结果显示了感染蛔虫与未感染蛔虫儿童之间在身体素质水平上的差异。结合这些方法有助于回答一些关键问题，例如经由大豆传播的蛔虫感染是否会影响感染者身体素质，以及此类感染的真实负担究竟如何。采用Cato Catz技术有助于检测感染者粪便中排出的寄生虫卵。首先将标准的Cato CATT模板置于载玻片中央。该模板中间有一个孔，用于盛装41.7毫克粪便，操作时需佩戴手套。取两到三克新鲜粪便样本，置于一张报纸或铝箔纸上。然后将一块金属丝网或塑料网筛压在粪便上，以过滤样本。使用小型塑料刮刀刮取网筛上的过滤物，并将其完全填满Cato Kat模板中的打孔孔洞。使用刮刀将孔中的内容物刮平，以去除多余的粪便样本。然后垂直取下模板，避免扰动已粘附在显微镜载玻片上的粪便样本。模板和刮刀在用洗涤剂和水清洗后可重复使用。接下来，将一片已在甘油孔雀绿溶液中浸泡至少24小时的玻璃纸覆盖在载玻片上的粪便样本上。为了将粪便涂布成较厚的涂片，用另一片干净的载玻片轻轻按压含有粪便样本的载玻片，使样本均匀分布在直径略小于载玻片宽度的圆形区域内。然后将载玻片避光放置，静置澄清30至60分钟。30 至 60 分钟后，取出载玻片，在光学显微镜下以 40 至 100 倍放大倍数系统地检查厚涂片。计数虫卵数量，并按物种进行分类。然后将虫卵计数乘以 24，以获得标准化的感染程度估计值，该值通常以每克粪便中的虫卵数（EPG）表示。为了实施艾尔曼技术，首先设置一个能够固定玻璃漏斗的支架。取一个玻璃漏斗，并在其茎部连接一段橡胶管。用夹子或弹簧夹封闭橡胶管，然后将漏斗固定在支架上。接下来，将一个筛子或锥形的金属丝网放入漏斗中。在此金属丝网上铺一层医用纱布。然后用自来水装满漏斗，并戴上手套确保装置不漏水。取20至30克新鲜粪便置于医用纱布中央，确保其完全浸没于水中，必要时可添加更多水。然后将医用纱布折叠包裹样品。接着，从下方用人工光源照射漏斗两小时。这是因为厄尔曼法基于这样的原理：毛圆线虫幼虫具有趋光性，因此会从被光照的粪便样本中迁移出来。两小时后，轻轻松开橡胶管上的夹子，将漏斗中下层50毫升的水样排入离心管中。接着，以600 × g离心5分钟。然后小心倒出上清液，注意不要扰动沉淀。保留管内最后几滴液体，重新悬浮后吸取两滴溶液置于显微镜载玻片上。先在光学显微镜下以40倍放大倍数检查寄生虫的存在，再以100至400倍放大倍数进行虫种鉴定。OID线虫的第一阶段幼虫具有活性，在显微镜下会主动移动，可用于建立穿梭实验。首先，测量出一条20米长的平坦直线跑道，并用锥形标志物标记距离。将心率监测器佩戴在受试者的手腕上，同时将相应的发射器绑在受试者胸部周围。该设备用于测量受试者在测试前后的心率，从而监测其是否已达到最大努力程度。固定好监测设备后，要求儿童按照预录声音信号的节奏在跑道上来回跑动，声音信号对应每20米折返一次，起始跑速设定为8.5千米/小时。指示20米间隔的声音信号频率会自动以每分钟增加0.5千米/小时的速率递增，以确保受试者开始新的20米跑动区间。每次信号响起后，需在下一个信号出现前结束。若儿童连续两次未能跟上20米间距的节奏，则停止测试。随后，记录最后一次跑动区间的跑步速度。参与者需完全完成测试，并记录参与者的年龄、性别以及达到的心率。测试结束时，需确认此心率为该儿童的最大心率。若未达到最大心率，则表明该儿童可能未尽最大努力，应重复测试。现在，通过以下公式估算受试者的最大有氧能力（即 VO₂ max）。VO₂ max = 31.025 + 3.238 × 速度（千米/小时） - 3.248 × 年龄（年） + 0.1536 × 速度（千米/小时） × 年龄（年）。以下两张图片展示了似圆线虫属（Ascaris lumbricoides）的虫卵，其长度约为 45 至 74 微米，宽度为 35 至 50 微米，具有较厚的卵壳壁，图中所示为受精的似圆线虫卵。注意Alta清蛋白涂层的外观，使其呈现金棕色。相比之下，此处显示的是一个未受精的a lumoid e卵。注意其缺乏外层涂层，且卵细胞比受精卵略长且体积更大。总体而言，该图像显示了茶色三毛虫的卵。其长度约为 50 微米，宽度约为 22 微米，呈长椭圆形，具有明显的极塞结构。相比之下，此处所示的钩虫卵具有非常薄的卵壳，其内侧环绕着一圈清晰的环状结构，中央为一团致密的细胞。本图片展示了S stir Corrales L一期幼虫。它们的长度约为180至380微米，具有非常短的口腔腔。可以观察到明显的生殖原基，蓝色箭头已将其标出。红色箭头显示幼虫的尾部，其末端尖锐。进行20米折返跑测试以测量身体素质。折返跑测试结果的解读可通过多种方式进行。可以在年龄和性别相似，且在其他潜在相关健康状况、社会经济地位和文化习惯方面相近的感染与非感染儿童之间，比较其身体素质。还可以进一步尝试确定土壤传播蠕虫（STH）感染强度与身体素质之间是否存在可能的剂量反应关系，并将不同程度的多重寄生感染与身体素质进行比较。例如，此处的图表显示，感染鞭虫（T. trichiura）的儿童其身体素质显著低于未感染鞭虫的儿童。观看本视频后，您应该能够充分掌握如何实施切口技术、裸片装片技术以及20米折返跑测试。这些方法将有助于评估大豆递质头盔感染是否对学龄儿童的身体素质产生影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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