量子点的溶解与生物偶联及通过生长曲线和菌落计数进行的细菌毒性检测

本实验的总体目标是进行高通量筛选，评估纳米颗粒在结合或不结合抗生素情况下的抗菌效果。在此过程中，通过检测聚混合物和B型偶联的碲化镉量子点的抗菌作用来实现该目标。首先，将量子点溶解于巯基丙酸（me capto proprionic acid）中。

接下来，将量子点与多粘菌素B偶联，然后用偶联和未偶联抗生素的量子点处理已接种抗生素的细菌。将一半样品用440纳米蓝光照射30分钟，诱导量子点产生激子和活性氧物种，以评估量子点处理对细菌生长和存活的影响。随后进行光密度测定和菌落计数。结果数据表明，在所测试的条件中，使用抗生素偶联的碲化镉量子点并结合光照处理所产生的抑菌效果最为显著。

尽管该方法可揭示碲化镉量子点及其与多聚素B在大肠杆菌生长中的作用，但也可应用于其他类型的纳米颗粒和抗生素对各种细菌菌株的影响。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为巯基丙酸（MPA）过量会导致量子点发生聚集，而若移取吐温时即使有微量残留，也会破坏滤膜。

尽管今天我们将演示一种评估抗生素偶联的硒化镉（KE IDE）量子点抗菌效应的方法，但类似的方法也可用于其他类型的量子点，例如磷化铟、硫酸锌以及硒化镉-硫酸锌。开始该实验时，首先在玻璃小瓶中配制浓度为15 µM的碲化镉（CdTe）量子点甲苯溶液，使用移液器将200 µL该储备液转移至玻璃小瓶中，通过吸光度光谱法测定其光密度（OD）。

请勿使用塑料器皿。然后加入800 µL甲苯、1 mL 200 mmol/L硼酸盐缓冲液以及2 µL 11.5 mol/L的巯基丙酸（MER capto proprionic acid 或 MPA），盖紧瓶盖并剧烈振荡30至60秒。振荡后，水相和有机溶剂相将自发分离。

水相将变为量子点的颜色。为避免产生层叠，需将其去除，然后移除量子点相并转移至一个洁净的小瓶中。为纯化溶解的量子点，将其转移至一个500微升的离心过滤器中。

加入 100 微升 50 毫摩尔的硼酸盐缓冲液，以 3000 × g 离心 13 分钟。最终洗涤后重复此洗涤步骤四次。将洗涤后的量子点重悬于 500 微升硼酸盐缓冲液中，并在 4 摄氏度下保存。

它们可稳定保存一至两周。为估算量子点的浓度，需测量其吸收光谱和发射光谱。该图显示了CdTe量子点在紫外灯照射下的发光情况，以及水溶化前后发射光谱的对比，表明配体交换过程对光学性质的影响可忽略不计。

本实验方案的这一部分适用于任何带负电荷的水相太阳能化纳米颗粒，包括苔藓、商用量子点、金属颗粒等。在此示例中，抗生素多粘菌素B（PMB）将以30:1的摩尔比与量子点偶联。PMB带正电荷，可自发组装，无需偶联过程。试剂包括溶解用的PMB和水。

在 60 微摩尔浓度下。对于每孔含有 0.3 毫升细菌的 96 孔板，设置四组重复实验时，将 0.5 毫升 200 纳摩尔的偶联物加入含有 100 微升 1 微摩尔量子点的 50 毫摩尔硼酸缓冲液中，置于微量离心管内，即足以完成配制。

接下来，向结合管中加入 50 µL 的 10 倍浓度或 60 µmol/L PMB 抗生素水溶液。向对照管中加入 50 µL 水。用 50 mmol/L ate 缓冲液将体积补至 0.5 mL，用铝箔避光，并将管子置于旋转仪上孵育一小时。

如果发生聚集，则使用较低浓度的抗生素重复偶联反应。逐步提高浓度，直至颗粒不发生聚集，然后洗涤偶联产物。将溶液通过10,000分子量截留滤膜过滤，该方法适用于大多数抗生素，但不适用于蛋白质或抗体。

最后，通过吸收光谱、荧光光谱、凝胶电泳或傅里叶变换红外光谱来估算每个量子点所结合的抗生素分子数量。该图显示了PMB偶联前量子点的典型吸收和发射光谱，以及加入160倍摩尔当量PMB后的发射光谱。

此处展示了由方块表示的PMB与量子点发射强度比值以及由三角形表示的峰值波长位置之间的关系。随着PMB浓度的增加，量子点的发射强度降低，导致发射峰值波长发生偏移。接下来的实验步骤旨在确定抗生素和量子毒性在偶联实验前两天晚上的半数最大抑制浓度（IC 50）。

从大肠杆菌的新鲜菌落中接种 10 毫升 LB 培养基。实验前一至两小时，向透明 96 孔板的每个孔中加入培养基。检测板的布局应如图所示。

样品应设置三个重复孔，并包含不同浓度的抗生素，浓度范围应足够宽，以涵盖一个对细菌抑制作用很弱的浓度和一个能完全杀死细菌的浓度。含有量子点的孔也应设置三个重复，其浓度应与偶联实验中所使用的浓度一致。使用多通道移液器，向相应的孔中加入1至50微升的细菌培养物。

浓度将取决于特定菌株的生长速度，需相应进行校准。为监测生长情况，将培养板放入酶标仪，设置为每10分钟在600纳米处读取一次，持续两小时。当所有菌液的OD值达到0.1至0.15时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。

接下来，将量子点中的 PMB 加入到相应的孔中，并用铝箔将板的一半孔重复遮盖三次。然后将该板置于由 2.4 毫瓦 LED 制成的定制 440 纳米灯下照射 30 分钟，使板的半侧暴露于光照下。光照结束后，将板放入酶标仪中，每 10 分钟记录一次 OD 600，持续 5 至 12 小时，具体时间根据生长速率而定。尽量将温度控制在 32 摄氏度以下，以避免培养物干燥，此过程可通过软件实现。

在选定时间点绘制生长曲线，横坐标为药物浓度的对数，利用屏幕上显示的Hill方程计算抗生素的IC50值，其中H为Hill系数，Ymax为最大生长值，Ymin为理想状态下的零点（通常位于平台期）。记录期结束时，孔内完全透明表明细胞完全死亡，而随着药物浓度递增，应出现细胞密度的梯度变化。

细菌应表现出如图所示的S形生长曲线。最大平台期的位置因菌株不同而有显著差异，同时也取决于温度。可选择某一特定时间点作为代表性时间点，将该时间点的数值对数抗生素浓度作图，以获得IC50值，从而评估量子点的效果。

毒性存活率与量子点浓度的对数值也可进行绘图分析，但在所用浓度下仅通过量子点实现显著的细菌杀灭效果较为罕见。在确定了量子点和抗生素单独作用的毒性后，可采用相同方案评估抗生素的毒性。图中显示的是偶联后的量子点。

以下是该检测的一个示例布局。注意，缀合物应以逐渐增加的浓度进行四重复测试，同时应包括仅含细菌的对照条带、仅含药物的条带，以及仅含量子点的样品孔。随后可利用 600 nm 处的光密度（OD 600）读数生成生长曲线，并像之前一样计算 IC50 值。

该图展示了与单独使用抗生素毒性相当的偶联物示例，以及毒性更强的偶联物示例。为确定每种条件下的菌落形成单位（CFU）数量，可选择经处理的96孔板中的一个或多个孔用于进行平板计数。用生理盐水溶液对所选的每个细菌样品进行连续稀释。

将180微升生理盐水溶液加入适当的孔中。取20微升细菌溶液，加入180微升生理盐水溶液进行稀释。更换移液枪头，混匀后取20微升稀释后的细菌溶液，转移至含180微升生理盐水溶液的孔中。

重复此过程六次。接着，从最后六个稀释液中各取10微升，点样到一块矩形的auger平板上。一块矩形平板上可点36个样点。

将平板在实验台上静置干燥15分钟后，于37°C培养16小时。培养结束后，计数菌落以确定每毫升的菌落形成单位。将菌落数乘以稀释倍数，再除以涂布体积，以确定处理对细菌生长的影响。

大肠杆菌的细胞密度在OD 600处测定。图中显示了从零到完全细胞死亡的不同药物浓度下的代表性细菌生长曲线。空心符号代表仅使用PMB，浓度如图所示。

实心符号代表未照射的 C-D-T-E-P-M-B，半填充符号代表照射后的 C-D-T-E-P-M-B。照射对仅含 PMB 的样品无影响，因此为清晰起见省略了这些曲线。此处为 200 分钟时的生长曲线值相对于 log PMB 的图示，以及对本方程的拟合结果，用于确定 IC 50 值，以排除光照的影响。

使用抗生素并仅进行30分钟光照处理绘制曲线。该图显示了在200分钟时细菌存活率与QD浓度的关系，实验采用CDTE量子点。光照条件下观察到一定的毒性，但毒性过低，无法确定IC50值。

这表明，在偶联实验所用浓度下，CDTE 单独作用的毒性可忽略不计。为比较不同处理对细胞生长的影响，绘制了200分钟时的生长曲线数值，并将其拟合至此前所示的方程，如图所示。C-D-T-E-P-M-B 偶联物比单独使用 PMB 具有更高的毒性。相比之下，金纳米颗粒 A-U-P-M-B 偶联物相较于单独使用 PMB 并未表现出毒性增加，以确定处理方式对细菌存活率的影响。

通过测定大肠杆菌在96孔板中经P-M-B-Q-D-P-M-B或QD单独处理，并在有或无I辐射条件下作用30分钟后形成的菌落数量（菌落形成单位），评估其抗菌效果。将各细菌样品用生理盐水进行系列稀释，取10微升100倍至10的7次方倍稀释液接种于auger平板上。平板在37摄氏度下培养，16小时后计数菌落。

本示例中，平板的 A 至 C 列为用浓度递增的 CDTE 处理的细菌；未进行照射的偶联物以及 D 至 F 列为用浓度递增的偶联物处理的细菌。各列细菌经照射 30 分钟，稀释梯度按行显示。

数据表明，在照射后，这些偶联物对细菌生长的抑制作用强于未照射的偶联物。请务必注意，CA试剂具有极高毒性，进行本实验操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套、实验服和护目镜。观看本视频后，您应能够充分理解如何对纳米颗粒（无论是否与抗生素偶联）的抗菌效果进行高通量筛选。