Name: 量子点的生长曲线和平皿计数的细菌毒性检测的增溶作用和生物共轭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学习使用CdTe量子点与抗生素偶联的光激活抗菌检测方法，通过增溶和生物共轭技术评估细菌生长曲线和平皿计数。该方法为开发新型抗菌纳米药物提供高通量筛选平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）个人发现项目、NSERC/加拿大卫生研究院（CIHR）协作健康研究计划（CHRP）以及NSERC CREATE加拿大天体生物学培训计划（CATP）资助。

1. 量子点溶解
该方法适用于CdTe。其他类型的量子点（如InP/ZnS20和CdSe/ZnS21）也可采用类似方法。
<ol>
 <li>在甲苯中配制浓度为 15 μM 的 CdTe 量子点溶液（在第一激子峰处的光密度为 2.5）。</li>
 <li>将 200 μL 该储备液转移至玻璃小瓶中。切勿使用塑料容器！</li>
 <li>加入 800 μL 甲苯、1 mL 200 mM 硼酸盐缓冲液（pH 9）以及 2 μL 11.5 M 巯基丙酸（MPA）。</li>
 <li>盖紧瓶盖，剧烈振荡 30–60 秒。</li>
 <li>水相与有机溶剂相将自发分离，水相将呈现量子点的颜色。为避免甲苯层干扰，将其移除并弃去，然后将水相转移至洁净的小瓶中。</li>
 <li>使用 500 μL、截留分子量为 10000 的离心过滤装置，通过洗涤/过滤四次纯化溶解的量子点。每次离心条件为 3000 × g，离心 13 分钟。最后至少两次洗涤应使用所需的终末缓冲液进行。</li>
 <li>最后一次洗涤后，将纯化的量子点重悬于 50 mM 硼酸盐缓冲液中（调节至所需 pH），并在 4 °C 下保存。样品可稳定保存 1–2 周。</li>
 <li>测定吸光度和发射光谱，依据已发表的公式 22估算量子点浓度。</li>
</ol>
代表性结果：图1展示了CdTe量子点在紫外灯照射下的图像，以及水溶化前后发射光谱的变化，表明配体交换过程引起的光谱变化可忽略不计。尺寸数值为通过电子显微镜测得的核直径。
2. 量子点与抗生素的偶联
该方案的这一部分适用于任何带负电荷的水溶性纳米颗粒，包括大多数商用量子点、金属颗粒等19。
<ol>
 <li>任何分子均可使用，只要其能够自发组装到带负电荷的溶解态量子点（QDs）上，或含有可共价偶联的反应性基团（例如伯胺）。本示例中采用多粘菌素B（PMB），该分子带正电荷，可自发组装，无需偶联试剂。将PMB溶解于H2O at 60 μM。（如果所选抗生素不溶于H2O，用DMSO或乙醇溶解，浓度为0.1–1 mM）。该溶液将作为10倍浓缩液（在H2O）或100倍浓度溶液（溶剂中）。</li>
 <li>计算细菌毒性实验所需的量子点溶液用量。对于每孔0.3 mL、设四个重复的96孔板，需要0.5 mL的200 nM偶联物溶液。准备两支试管，分别装有 100 μL 的 1 μM 50 mM 硼酸盐缓冲液中的量子点</li>
 <li>若与伯胺偶联，配制19 mg/mL（100 mM）的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液2O. EDC 溶液不稳定，需立即使用，剩余部分应丢弃。</li>
 <li>添加 50 μL 10倍抗生素溶液（溶于H2O) 或 5 μL 将100倍浓度的溶液（溶于溶剂中）加入到偶联管中。对于摩尔比为30:1的PMB:CdTe偶联，添加 50 μL 的 60 μM PMB。加入H2O 或溶剂加入仅含量子点的对照管中。</li>
 <li>如有需要，添加 1 μL 将 EDC 储备液加入偶联管中。</li>
 <li>用适当的缓冲液（硼酸盐缓冲液或PBS；不可使用含胺缓冲液如Tris，因其会抑制EDC反应）将偶联液体积调至0.5 mL。</li>
 <li>用铝箔避光包裹离心管，并在旋转摇床或往复摇床上孵育1小时。若出现聚集现象，应使用较低浓度的抗生素重复偶联反应。逐步提高抗生素浓度，直至颗粒不再发生聚集。</li>
 <li>用适当的滤器冲洗偶联物。对于大多数抗生素，可使用截留分子量为10000的滤器，但不适用于蛋白质或抗体。</li>
 <li>根据分子的不同，可采用多种方法来估算每个量子点所结合的抗生素分子数量：吸光度或荧光光谱法、凝胶电泳法或傅里叶变换红外光谱法（FTIR）。</li>
</ol>
代表性结果。 在本示例中，PMB 的偶联通过量子点发射光谱的变化进行表征。图2展示了添加PMB后CdTe量子点的光谱。
3. 96孔筛选用细菌的制备；抗生素IC50的测定
这适用于在适当培养基中培养的几乎所有细菌菌株18。记录所需的确切时间取决于细菌的生长速率。在本示例中，我们使用在溶菌肉汤（LB）培养基中培养的大肠杆菌（Escherichia coli）。
<ol>
 <li>为了选择合适的量子点偶联物浓度，了解IC50 待偶联抗生素的浓度以及量子点（QDs）单独是否存在毒性。该步骤应在偶联实验开始前2天进行。傍晚时，采用正确的无菌和生物安全技术，从新鲜菌落接种10 mL细菌培养基。</li>
 <li>第二天，在实验前1-2小时，向透明底96孔板的每个孔中加入接近最大容量的培养基。使用多通道移液器，向每个孔中接种1-50 μL 细菌培养物的量（具体浓度取决于特定菌株的生长速度，需由实验室自行校准）。</li>
 <li>将培养板放入酶标仪中，设置在特定波长（通常为600 nm）下每10分钟读数一次，持续2小时。监测培养板，防止细菌生长过密过快。</li>
 <li>当所有细胞的 OD 值达到 0.1–0.15 时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。</li>
 <li>以至少三个重复孔分别加入不同浓度的药物单独处理组和量子点（QDs）单独处理组。将平板的一侧设为“暗”对照组，另一侧设为光照组。建议的板式布局如下所示 图3浓度范围应足够宽，以包含一个对细菌抑制作用很小的浓度和一个能完全杀死细菌的浓度。</li>
 <li>用铝箔遮盖平板的“暗”面，将另一面暴露于所需波长的光源下。我们使用自制的96孔440 nm灯，由2.4 mW LED制成（图4）并照射30-60分钟。底部透明的黑色板有助于屏蔽未照射侧的细菌免受杂散光影响。也可在照射侧与未照射侧之间使用空列。</li>
 <li>光照后，将培养板放入酶标仪中，根据生长速度每10分钟记录一次OD 600，持续5至12小时。保持温度 &lt; 32 °C 尽可能避免培养物干燥。</li>
 <li>在选定时间点绘制生长曲线，以生长情况对浓度的对数值（log [浓度]）作图，并确定IC50 使用Hill方程计算抗生素的效应：</li>
</ol>
<img alt="剂量-反应曲线分析的非线性回归方程，变量为 ymax、ymin、IC50 和 H。" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
其中 H 为希尔系数，ymax 为生长最高点（理想情况下处于平台期），ymin 为零点，理想情况下也处于平台期。量子点（QDs）在所用浓度下单独作用时不太可能对细胞产生明显毒性，因此不会确定其数值。
代表性结果。 在记录期结束时，透明的孔表明细胞已完全死亡，且随着药物浓度的增加，细胞密度应呈现出梯度变化。细菌应表现出S形生长曲线（图5 A）；最大平台期的位置因菌株而异，并且还取决于温度。可选择某一特定时间点作为代表，将其数值对Log[抗生素]作图，以获得IC50值（图5 B）。为了评估量子点（QD）的毒性，也可绘制存活率对Log[QD]的曲线，但单独使用量子点实现显著的细菌杀伤作用较为罕见（图5 C）。
4. 抗生素/量子点96孔筛选用细菌的制备
<ol>
 <li>实验前一天，使用无菌及生物安全操作技术，从新鲜菌落中接种10 mL培养物至适当的丰富培养基中。除非量子点-抗生素偶联物极不稳定，否则也应在当天制备。</li>
 <li>实验前1-2小时，用接近最大容量的培养基填充透明底96孔板的每个孔。使用多通道移液器，向每孔接种1-50 μL 细菌培养物</li>
 <li>将培养板放入酶标仪中，设置为在与第3部分相同的波长下，每10分钟读数一次，持续2小时。</li>
 <li>当所有细胞的 OD 值达到 0.1–0.15 时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。</li>
 <li>以至少四个复孔为一组，加入不同浓度的量子点偶联物。将平板的一侧设为“暗”对照，另一侧设为光照组。建议的布局如图所示 图6仅含细菌的对照条应 始终 应包含对照组，以防培养、温度等因素影响生长条件。还应设置仅含单条药物和仅含QD的组别，以确保其与之前完成的对照板结果一致。其余孔用于放置偶联物，以便获得良好的统计学数据。</li>
 <li>用铝箔遮盖培养皿的“暗”侧，将另一侧暴露于所需波长的光源下。</li>
 <li>光照后，将培养板放入酶标仪中，每10分钟记录一次OD 600，持续5至12小时。保持温度 &lt; 32 °C 尽可能避免培养物干燥。</li>
</ol>
代表性结果。量子点与抗生素的组合可能比单独使用抗生素的毒性更低；毒性相当；或毒性更高。这可以通过生长曲线和IC50测定进行量化。图7展示了一个与单独使用抗生素毒性相当的偶联物示例，以及一个毒性更高的偶联物示例。
5. 平板计数
<ol>
 <li>选择经处理的96孔板中的一个或多个孔，用于进行系列稀释和菌落计数。</li>
 <li>用PBS或生理盐水（0.9% NaCl）对所选的每个细菌样品进行系列稀释。取20 μL细菌溶液加入180 μL生理盐水中，更换移液器吸头，混匀后取20 μL稀释后的细菌溶液加入180 μL生理盐水中。重复此步骤6次。</li>
 <li>从每个稀释度中取10 μL，接种于适当的固体培养基平板上。一个样品的全部8个浓度可接种于一个直径10 cm的圆形培养皿上，但更推荐使用矩形培养皿，因其更便于排列。</li>
 <li>在实验台上静置干燥15分钟，然后在适合该细菌生长的温度下培养16小时。</li>
 <li>计数菌落，并根据公式（菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积 = CFU/mL 计算菌落形成单位（CFU）。</li>
</ol>
图8 显示了一个菌落形成单位（CFU）平板的示例。
6. 代表性结果
<img alt="CdTe 光致发光、发射光谱、量子点、小瓶样品、光谱分析图" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. CdTe 量子点。(A) 八个 CdTe 量子点样品在 365 nm 紫外灯照射下的发光情况。(B) 五种选定尺寸的量子点在水溶化前后的吸收光谱和发射光谱。虚线表示甲苯中的光谱，实线表示水中的光谱。
<img alt="发射光谱和吸光度图；PMB与CdTe的比值随波长的变化；光子分析。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 量子点-PMB 偶联物的光谱和凝胶分析。本示例使用了发射橙光的 CdTe 量子点；其他类型量子点的影响需在每次实验中单独评估。(A) 偶联 PMB 前量子点的典型吸光度（灰色线）和发射光谱（黑色线），以及加入 160 倍摩尔量 PMB 后的发射光谱（虚线）。(B) PMB 与量子点的摩尔比与量子点发射强度（方块）及发射峰波长位置（三角形）之间的关系。
<img alt="E. coli 生长实验平板布局；PMB 和 QD 的系列稀释；实验设置与分析。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 建议的对照生长平板布局。展示了较宽范围的 PMB 和 QD 浓度。平板的一半接受光照（以蓝色高亮），另一半则避光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="光子学实验中用于光学激发的LED阵列；上方为关闭状态，下方为开启状态，发射蓝光。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 定制的96-LED灯，用于实现培养板的均匀照射，图中显示其关闭和开启时的外观。也可使用常见的手持式紫外灯，但无法对整个培养板实现均匀照射。
<img alt="细菌生长抑制、存活率分析图；PMB光照效应；光学响应研究。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5．对照生长平板的示例结果。（A）不同药物浓度下的代表性细菌生长曲线，浓度范围从0至完全细胞死亡。空心符号代表仅使用PMB，浓度如图所示；实心符号代表未照射光的CdTe-PMB；半填充符号代表经光照的CdTe-PMB。光照对仅含PMB的样品无影响，因此为清晰起见省略了这些曲线。所有PMB-CdTe偶联物的PMB:QD比例均为30:1。（B）200分钟时生长曲线数值相对于Log[PMB]的作图，以及对公式（1）的拟合结果。为控制光照的影响，单独使用抗生素并进行30分钟光照处理作为对照曲线。（C）200分钟时细菌存活率相对于QD浓度的变化，使用CdTe量子点（QDs）。可见光照条件下存在一定毒性，但毒性过低，无法确定IC50值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="微量滴定板布局示意图；用于生物测定测试的大肠杆菌、量子点（QD）和多粘菌素B浓度梯度。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 建议的偶联物测试板布局。板中以蓝色高亮的一半应暴露于光照下，未高亮的一半则需避光保护。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="细菌生长抑制实验，OD 600 与 log[PMB] 的关系，比较不同 PMB 制剂；实验图表。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 偶联物测试板的示例结果。将 200 分钟时的生长曲线值绘图并拟合至公式 (1)。（A）CdTe-PMB 偶联物表现出比单独使用 PMB 更高的毒性。（B）金纳米颗粒 Au-PMB 偶联物未表现出比单独使用 PMB 更高的毒性。
<img alt="细菌菌落生长、琼脂平板上的梯度稀释、实验设置、微生物学分析。" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. CFU 平板示例。E. coli 接种于 96 孔板中，用 QD-PMB 处理，有或无光照，处理 30 分钟后，在 32 °C 下孵育 4 小时。各细菌样品用生理盐水进行系列稀释，取 10 μL 100 X 至 107 X 的稀释液涂布于琼脂平板上。平板在 37 °C 下孵育，16 小时后计数菌落。图中显示稀释梯度按行排列，如图所示；各列为：(A) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe，(B) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe，(C) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe，(D) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe 经光照，(E) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe 经光照，(F) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe 经光照。

<ol><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Jamieson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological applications of quantum dots.</a> Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).</li>
<li>Asokan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heat+transfer+fluids+in+the+synthesis+of+high-quality+CdSe+quantum+dots%2C+core%2Fshell+quantum+dots%2C+and+quantum+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods.</a> Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).</li>
<li>Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+quantum+dots+for+multiplexed+biological+detection+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).</li>
<li>Chan, W. C. W., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+ultrasensitive+nonisotopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.</a> Science. 281, 2016-2018 (1998).</li>
<li>Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+quantum+dots+to+cells%3A+bioconjugated+quantum+dots+for+targeted+and+nonspecific+extracellular+and+intracellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).</li>
<li>Boucher, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad++bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Morones, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+effect+of+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The bactericidal effect of silver nanoparticles.</a> Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).</li>
<li>Mitoraj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+inactivation+of+bacteria+and+fungi+by+modified+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).</li>
<li>Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatase+TiO2+nanocomposites+for+antimicrobial+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings.</a> J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).</li>
<li>Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+TiO2+coating+for+reducing+hospital-acquired+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).</li>
<li>Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+size+scale+of+ZnO+nanoparticles+and+microparticles+on+toxicity+toward+bacteria+and+osteoblast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Rincon, A. G., Pulgarin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+coaxial+photocatalytic+reactor+%28CAPHORE%29+in+the+TiO2+photo-assisted+treatment+of+mixed+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+and+the+bacterial+community+present+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Today%22%5BJournal%5D)">Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater.</a> Catal. Today. 101, 331-344 (2005).</li>
<li>Neal, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+inferred+from+bacterium-nanoparticle+interactions+about+the+potential+consequences+of+environmental+exposure+to+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).</li>
<li>Kovochich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+C60+aggregates+toward+mammalian+cells%3A+role+of+tetrahydrofuran+%28THF%29+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition.</a> Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+cellular+toxicity+of+nanocrystal+quantum+dots+depend+on+their+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification.</a> Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101(2011).</li>
<li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitization+of+CdSe%2FZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li>
<li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe%2FZnS+quantum+dots+in+water%3A+A+procedure+guided+by+computational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li>
<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

纳米颗粒为开发新型抗菌剂提供了一种有前景的途径。生长曲线分析是一种监测细菌细胞密度的方法，能够区分活跃生长的细胞与生长受抑制的细胞。结合平板计数法，可对偶联物的抗生素潜力进行深入分析。采用96孔板格式可实现浓度及其他条件（如光照）的相对高通量筛选；后者对于量子点等光激活型试剂尤为关键。该基本方法存在多种变体，使其成为纳米毒理学研究中一种灵活且适用性广的技术。

<table><tbody><tr><td>硼酸盐缓冲液组分 #1</td><td>Fisher</td><td>Boric acid A-74-1</td><td></td></tr><tr><td>硼酸盐缓冲液组分 #2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sodium Tetraborate B9876</td><td></td></tr><tr><td>MPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5801</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9322</td><td>提供多种分子量截留规格</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisher</td><td>03-338C</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>多粘菌素 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养基（LB）组分 #1</td><td>Fisher</td><td>NaCl S271</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养基（LB）组分 #2</td><td>BD</td><td>Tryptone 211705</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养基（LB）组分 #3</td><td>BD</td><td>Yeast Extract 211929</td><td></td></tr><tr><td>用于光照处理的灯具</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明底96孔板</td><td>Fisher</td><td>07-200-567 或 07-200-730</td><td></td></tr><tr><td>荧光光谱仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸光度酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于固体培养基的BactoAgar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>圆形培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-75-12</td><td></td></tr><tr><td>矩形培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-757-11A</td><td></td></tr></tbody></table>

量子点的溶解与生物偶联及通过生长曲线和菌落计数进行的细菌毒性检测

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

量子点（QDs）是一类荧光半导体纳米颗粒，其发射光谱依赖于尺寸，并可由多种波长的光激发。由于具有明亮且稳定的荧光特性，量子点在成像、诊断和治疗领域受到广泛关注1,2 3,4,5。量子点可与多种生物活性分子偶联，用于结合细菌和哺乳动物细胞6。
量子点（QDs）也正在被广泛研究作为靶向杀灭细菌的细胞毒性试剂。多重耐药菌株的出现正迅速演变为一场公共卫生危机，尤其在革兰氏阴性病原体方面尤为严重7。由于某些纳米材料（尤其是银，Ag）具有广为人知的抗菌效应，已有数百项研究探讨了纳米颗粒对细菌的毒性作用8。此外，其他类型的半导体纳米颗粒也被用于细菌相关研究，特别是二氧化钛（TiO2）9,10-11，以及氧化锌（ZnO）12和氧化铜（CuO）13等。在这些研究中，部分开展了不同细菌菌株之间的比较，通常为革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的对比。对于所有这些纳米颗粒，其毒性机制均归因于氧化作用：或是颗粒在光照下产生活性氧物种（ROS），或是直接释放可引发氧化毒性的金属离子。即便使用这些材料，不同研究的结果仍存在巨大差异。一些研究报道革兰氏阳性测试菌株比革兰氏阴性菌更敏感10；而在另一些研究中则恰恰相反14。这些研究已得到充分综述15。
在所有纳米颗粒研究中，颗粒的组成、尺寸、表面化学性质、样品老化/降解情况，以及光照的波长、功率和持续时间，均可能显著影响实验结果。此外，还需考虑合成副产物和溶剂的影响16 17。为了能够开发出有效的新型纳米药物制剂，亟需高通量筛选技术。
CdTe量子点单独使用18或与抗生素联合使用均具有抗菌作用。在之前的一项研究中，我们发现将抗生素与CdTe偶联可增加对细菌的毒性，但会降低对哺乳动物细胞的毒性，这归因于偶联物产生的活性氧减少19。尽管含镉化合物不太可能被批准用于人体，但此类制剂可用于物体表面的消毒或水的灭菌。
在本方案中，我们提供了一种使用巯基丙酸（MPA）溶解 CdTe 量子点的简便方法。该量子点可在一小时内完成制备并直接使用。随后，我们展示了将其与抗菌剂偶联的方法。
实验方案的第二部分展示了使用偶联与非偶联量子点的96孔细菌抑制实验。通过在数小时内连续测定光密度，可即时评估量子点添加和光照处理的效果，并可在恢复培养后进一步评估其影响。我们还展示了通过菌落计数来定量分析细菌存活率的方法。

半导体量子点（QDs）等纳米颗粒可用于制备光活化试剂，以用于抗菌或抗癌应用。本技术展示了如何使碲化镉（CdTe）量子点水溶化，将其与抗生素偶联，并基于生长曲线和平板计数进行细菌抑制实验。

量子点（QDs）是一类荧光半导体纳米颗粒，其发射光谱随粒径大小而变化，可由多种不同波长的光源激发。

本实验的总体目标是高通量筛选纳米颗粒在有或无抗生素偶联情况下的抗菌效果。在此，通过检测聚混合物B偶联的碲化镉量子点的抗菌作用来实现该目标。首先将量子点溶于巯基丙酸中。接下来，将量子点与多聚混合物B偶联，然后用偶联和未偶联抗生素的量子点处理已接种抗生素的细菌。将一半样品用440纳米蓝光照射30分钟，诱导量子点产生激子和活性氧物种，以评估量子点处理对细菌生长和存活的影响。随后进行光密度测定和菌落计数。结果数据表明，在所测试的条件中，使用抗生素偶联的碲化镉量子点并结合光照处理所产生的抑菌效果最为显著。尽管该方法可揭示碲化镉量子点及其与多聚物B在大肠杆菌生长中的作用，也可应用于其他类型的纳米颗粒和抗生素对各种细菌菌株的影响。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为巯基丙酸（MPA）过量会导致量子点发生聚集，而若移除透析液时即使吸入少量，也会破坏滤膜。尽管今天我们将演示一种评估抗生素偶联的硒化镉（KE IDE）量子点抗菌效应的方法，但类似的方法也可用于其他类型的量子点，例如磷化铟、硫酸锌以及硒化镉-硫酸锌。开始该实验时，首先在玻璃小瓶中配制浓度为15 µM的碲化镉（CdTe）量子点甲苯溶液，使用移液器将200 µL该储备液转移至玻璃小瓶中，通过吸光度光谱法测定其光密度（OD）。请勿使用塑料器皿。然后向瓶中加入 800 µL 甲苯、1 mL 200 mmol/L 硼酸盐缓冲液以及 2 µL 11.5 mol/L 巯基丙酸（MER capto proprionic acid 或 MPA），盖紧瓶盖并剧烈振荡 30 至 60 秒。振荡后，水相和有机溶剂相将自发分离。水相将变为量子点的颜色。为避免产生分层，需将其去除，然后收集量子点相并转移至一个洁净的小瓶中。为纯化溶解的量子点，将其转移至500微升的离心过滤管中。加入 100 微升 50 毫摩尔的 bore 八缓冲液，以 3000 ×g 离心 13 分钟。最后一次洗涤后重复此洗涤步骤四次。将洗涤后的量子点重悬于 500 微升 bore 缓冲液中，并在 4 摄氏度下保存。它们可稳定保存一至两周。为估算量子点的浓度，需测量其吸收光谱和发射光谱。该图显示了CdTe量子点在紫外灯照射下的发光情况，以及水溶化前后发射光谱的对比，表明配体交换对光学性质的影响可忽略不计。本实验方案的这一部分适用于任何带负电荷的水溶性纳米颗粒，包括苔藓、商用量子点、金属颗粒等。在此示例中，抗生素多粘菌素B（poly mixen B，简称PMB）将以30:1的摩尔比与量子点偶联。PMB带正电荷，可自发组装，无需偶联过程。试剂包括PMB和水。在 60 微摩尔浓度下。对于每孔含有 0.3 毫升细菌的 96 孔板，设置四组重复实验时，将 0.5 毫升 200 纳摩尔的偶联物加入含 100 微升 1 微摩尔量子点的 50 毫摩尔硼酸缓冲液中，置于微量离心管内，即足以完成该配制。接下来，向结合物管中加入 50 微升溶于水的 10 倍浓度或 60 微摩尔 PMB 抗生素溶液。向对照管中加入 50 微升水。用 50 毫摩尔醋酸盐缓冲液将体积补至 0.5 毫升，用铝箔避光，并将各管置于旋转仪上孵育一小时。如果发生聚集，则使用较低浓度的抗生素重复偶联反应。逐步提高浓度，直至颗粒不发生聚集，以洗涤偶联产物。将溶液通过10,000分子量截留滤膜过滤，该方法适用于大多数抗生素，但不适用于蛋白质或抗体。最后，通过吸收光谱或荧光光谱、凝胶电泳或傅里叶变换红外光谱法，估算每个量子点所结合的抗生素分子数量。该图显示了PMB偶联前量子点的典型吸收和发射光谱，以及加入160倍摩尔当量PMB后的发射光谱。此处展示了由方块表示的PMB比例与量子点发射强度以及由三角形表示的峰值波长位置之间的关系。随着PMB浓度的增加，量子点的发射强度降低，导致发射峰值波长发生偏移。接下来的实验步骤旨在确定抗生素和量子毒性的半数最大抑制浓度（IC 50），该步骤需在偶联实验前两天的傍晚进行。从大肠杆菌的新鲜菌落中接种10毫升LB培养基。第二天，在实验前一至两小时，用生长培养基填充透明96孔板的每个孔。检测板的布局应如图所示。样品应设置三个重复孔，并包含不同浓度的抗生素。抗生素浓度范围应足够宽，以涵盖一个对细菌抑制作用极小的浓度和一个能够完全杀死细菌的浓度。含有量子点的孔，其浓度应与偶联实验中所使用的浓度一致，也应设置三个重复孔。使用多通道移液器，向相应的孔中加入1至50微升的细菌培养液。浓度将取决于特定菌株的生长速度，需相应地进行校准。为监测生长情况，将培养板放入酶标仪中，设置为每10分钟读取一次，持续两小时，波长为600纳米。当细胞的OD值均达到0.1至0.15时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。接下来，将量子点中的 PMB 加入到相应的孔中，并用铝箔将一半的孔进行三次重复遮蔽。然后将该板置于由 2.4 毫瓦 LED 制成的定制 440 纳米灯下照射 30 分钟，以使板的一侧接受光照。光照结束后，将该板放入酶标仪中，每 10 分钟记录一次 OD 600，持续 5 至 12 小时，具体时间取决于菌体生长速率。尽可能将温度控制在 32 摄氏度以下，以避免使用软件时培养物干燥。将选定时间点的生长曲线相对于药物浓度的对数值作图，并利用屏幕上显示的Hill方程确定抗生素的IC50，其中H为Hill系数。Ymax代表最大生长值，Ymin为零点，理想情况下也应位于平台期。在记录期结束时，空白孔表明细胞完全死亡，而随着药物浓度的增加，应出现细胞密度的梯度变化。细菌应表现出如图所示的S形生长曲线。最大平台期的位置因菌株不同而有显著差异，同时也取决于温度。可选择某一特定时间点作为代表性时间点，将该时间点的数值对数抗生素浓度作图，以获得IC50值，用于评估量子点的效果。毒性存活率与量子点浓度的对数关系也可进行绘图，但在所用浓度下，仅靠量子点实现显著的细菌杀灭效果较为罕见。在确定了量子点和抗生素单独作用的毒性后，可采用相同方案测定抗生素的毒性。图中所示为偶联的量子点。以下是该检测的一个示例布局。请注意，偶联物应以递增浓度进行四复孔测试，同时应包括仅含细菌的对照条带、仅含药物的条带，以及仅含量子点的样品孔。随后可利用 600 nm 处的光密度（OD 600）读数生成生长曲线，并像之前一样计算 IC50 值。该图展示了一个与单独使用抗生素毒性相当的偶联物示例，以及一个毒性更强的偶联物示例。为确定每种条件下的菌落形成单位（CFU）数量，可选择经处理的96孔板中的一个或多个孔用于进行平板计数。用生理盐水溶液对所选的每个细菌样品进行系列稀释。将180微升生理盐水溶液加入相应的孔中。取20微升细菌溶液，加入180微升生理盐水溶液进行稀释。更换移液枪头，混匀后取20微升稀释后的细菌溶液，转移至含180微升生理盐水溶液的孔中。重复此过程六次。接着，从最后六个稀释液中各取10微升，点样到一块矩形的auger平板上。一块矩形平板上可点样36个点。将平板在实验台上静置干燥15分钟后，于37°C培养16小时。培养结束后，计数菌落以确定每毫升的菌落形成单位。将菌落数乘以稀释倍数，再除以涂布体积，以确定处理对细菌生长的影响。大肠杆菌的细胞密度在OD 600处测定。图中显示了从零到完全细胞死亡的不同药物浓度下的代表性细菌生长曲线。空心符号代表仅使用PMB，浓度如图所示。实心符号代表未照射的 C-D-T-E-P-M-B，半填充符号代表照射后的 C-D-T-E-P-M-B。照射对仅含 PMB 的样品无影响，因此为清晰起见，省略了这些曲线。此处为 200 分钟时的生长曲线值相对于 log PMB 的图示，以及对这些数据拟合方程以确定 IC 50 值，从而控制光照效应。使用抗生素并仅进行30分钟光照处理绘制曲线。该图显示了在200分钟时细菌存活率与量子点浓度的关系，实验采用CDTE量子点。光照条件下观察到一定的毒性作用，但毒性过低，无法确定IC50值。这表明，在偶联实验所用浓度下，CDTE 单独作用的毒性可忽略不计。为比较不同处理对细胞生长的影响，将 200 分钟时的生长曲线数值进行作图，并拟合至此前所示方程，结果如图所示。C-D-T-E-P-M-B 偶联物比 PMB 单独作用时毒性更强。相比之下，金纳米颗粒 A-U-P-M-B 偶联物相较于单独使用 PMB 并未表现出毒性增加，以此确定处理方式对细菌存活率的影响。通过测定大肠杆菌在96孔板中的菌落形成单位数量，评估经P-M-B-Q-D-P-M-B或QD单独处理、并接受或未接受I射线照射30分钟后的抗菌效果，随后在32°C下孵育4小时。将每种细菌样品用生理盐水进行系列稀释，取10 µL稀释100倍至10的7次方倍的溶液接种于琼脂平板上。平板在37°C下孵育，16小时后计数菌落。本示例中，平板的 A 至 C 列为用浓度递增的 CDTE 处理的细菌；未进行照射的偶联物以及 D 至 F 列为用浓度递增的偶联物处理的细菌。每行显示了经 30 分钟照射后的稀释梯度。数据表明，在照射条件下，这些偶联物对细菌生长的抑制作用强于未照射条件下的偶联物。请务必注意，CA试剂具有极强的毒性，进行本实验操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套、实验服和护目镜。观看本视频后，您应能够充分理解如何对纳米颗粒（无论是否与抗生素偶联）的抗菌效果进行高通量筛选。

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

量子点的生长曲线和平皿计数的细菌毒性检测的增溶作用和生物共轭

来源：Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company,...

使用染料标记的磁性微球进行多重定量细菌检测

本文介绍了一种同时定量和比较生物膜中三种细胞内及细胞外组分的实验方案。该方法涉及共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析与可视化软件以及统计分析软件的使用。...

生物膜中细胞与胞外组分的同时定量

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。...

通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

我们提供了利用特定长度的硫代磷酸酯DNA制备单价靶向量子点（mQDs）的详细步骤。DNA缠绕反应产率高，因此产物无需纯化。我们展示了如何利用SNAP标签将mQDs靶向至细胞表面受体，用于活细胞成像应用。...

单价量子点的制备与靶向

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S.

适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

开发了一种高通量、实时的检测方法，可同时实现：（1）筛选靶向胞内细菌病原体的真核细胞穿透性抗菌剂；（2）评估抗菌剂对真核细胞的细胞毒性。随后，该技术经过改进，并结合数字分配技术，从而能够便捷地开展高分辨率的剂量-反应以及二维和三维协同作用研究。...

高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

采用简单的ATP检测法和活/死染色法，对经头孢曲松处理后的Neisseria...

抗生素敏感性的定量检测 淋病奈瑟菌 使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本文描述了一种利用单细胞荧光显微镜技术在共培养条件下观察和定量细菌竞争的方法。...

使用单细胞荧光成像定量细菌间竞争

本文介绍一种利用市售的基于实时ATP的发光微生物活力检测方法，评估载抗生素聚合物在模拟预防性临床应用中的抗菌效果的实验方案。该方法可实现对药物释放材料长期活性的监测，并可广泛适用于各类抗菌药物递送平台的测试。...

一种测定载药材料纵向抗菌活性的新方法

学习使用CdTe量子点与抗生素偶联的光激活抗菌检测方法，通过增溶和生物共轭技术评估细菌生长曲线和平皿计数。该方法为开发新型抗菌纳米药物提供高通量筛选平台。

量子点的溶解与生物偶联及通过生长曲线和菌落计数进行的细菌毒性检测

探索更多视频