Name: 膀胱膀胱分析各种啮齿类动物模型中使用的增广的生物材料评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解使用三维支架进行小鼠和大鼠膀胱扩大术的手术步骤，通过清醒和麻醉状态下的膀胱测压技术评估生物材料配置的有效性，为先天性及获得性膀胱异常的治疗提供功能数据支持。

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这些研究部分得到了波士顿儿童医院泌尿科捐赠收入基金以及美国国立卫生研究院资助项目 NIBIB P41-EB002520（Kaplan）；NIDDK T32-DK60442（Freeman）；NIDDK 1K99-DK083616（Mauney）的支持。我们感谢佛蒙特大学的 Peter Zvara 博士在建立膀胱造瘘管置入技术和膀胱测压技术方面提供的帮助。

手术方法
1. 手术准备与麻醉
<ol>
	<li>使用必要的外科器械设置无菌手术区域：剃毛剪、有齿镊、精细无创镊、精细持针器、纱布、梅岑鲍姆剪、肌腱剪、手术刀片、30号皮下注射针头、装有生理盐水的1 mL注射器、四根6-0聚丙烯缝线、7-0聚乳酸羟基乙酸缝线和4-0聚乳酸羟基乙酸缝线。</li>
	<li>在诱导室中通过吸入异氟烷对动物进行麻醉。在将动物转移至手术区域前，确认其已完全进入麻醉状态。确保吸入麻醉管位置适当，以维持持续麻醉。</li>
	<li>将动物仰卧位放置于无菌手术巾上。 
	[关于膀胱压力测定分析，请参见下文膀胱造瘘导管隧道植入部分。]</li>
	<li>使用剃毛剪去除下腹部的毛发。</li>
	<li>用聚维酮碘和70%乙醇对腹部进行消毒处理。</li>
	<li>切口前，可皮下注射镇痛药（如布托啡诺，0.05–0.1 mg/kg），以实现围手术期疼痛控制。</li>
</ol>
2. 切口与膀胱暴露
<ol>
	<li>使用手术刀在皮肤上做一条1-2 cm的下腹正中切口（切口长度取决于动物大小以及是大鼠还是小鼠）。从切口下端继续切开腹直肌，注意避免损伤下方的肠管或膀胱。</li>
	<li>用有齿镊提起腹直肌，用精细的梅岑鲍姆剪刀游离该肌的后表面。</li>
	<li>沿皮肤切口全长，在正中线切开剩余的肌肉层。</li>
	<li>将膀胱经切口拉出（图1）。膀胱通常是骨盆内位置最低的器官。（在雄性动物中，前列腺位置更低，且比去膨胀状态的膀胱更大。）</li>
	<li>使用6-0聚丙烯缝线，先在膀胱后壁放置一根固定缝线，再在膀胱前壁放置另一根固定缝线。在两侧可加置额外缝线。暂不打结。当这些缝线拉紧时，膀胱应呈现约1 cm2的方形轮廓（图2）。注意不要过度牵拉缝线，以免缝线轻易穿透膀胱组织。</li>
	<li>在膀胱前壁正中（紧靠膀胱顶部下方）纵向切开膀胱约1 cm（大鼠膀胱为1.5-2 cm）。</li>
</ol>
3. 支架的吻合
<ol>
	<li>使用精细剪刀将丝素蛋白支架修剪至与膀胱缺损区域大致相同大小。</li>
	<li>使用7-0聚乳酸羟基乙酸缝线，从支架的一角开始，以连续锁边缝合方式将支架缝合至膀胱，确保围绕缺损边缘形成严密的防水封闭（图3）。</li>
	<li>通过30号皮下注射针头向膀胱壁内注入无菌生理盐水以充盈膀胱，检测吻合口的完整性。若发现渗漏，可使用额外的间断7-0聚乳酸羟基乙酸缝线缝合以闭合缺口。</li>
	<li>将重建后的膀胱复位回腹腔内。</li>
</ol>
4. 切口关闭
<ol>
	<li>在关闭腹壁前，向腹直肌和皮下组织注射布比卡因以进行局部麻醉（< 3 mg/kg 的 0.25% 溶液）。</li>
	<li>使用连续锁扣式 4-0 聚乳酸羟基乙酸缝线缝合腹直肌。</li>
	<li>使用连续锁扣式 4-0 聚乳酸羟基乙酸缝线缝合皮肤。</li>
	<li>清洁并干燥切口（图 4）。</li>
	<li>将动物转移至温暖、清洁的笼子中，使其从麻醉中苏醒。</li>
</ol>
用于膀胱测压分析的膀胱造瘘导管置入步骤如下：
5. 建立膀胱造瘘导管通道
<ol>
	<li>使用必要的外科器械设置无菌手术区域：剃毛剪、有齿镊、精细无创镊、精细持针器、纱布、梅岑鲍姆剪、肌腱剪、小型弯钳、手术刀片、6-0聚丙烯缝线、4-0聚乳酸羟乙酸缝线、3-0丝线（小鼠使用4-0丝线）、18G针头、22G钝头针、25G针头、1 mL生理盐水注射器、剪成约10 cm长度的聚乙烯导管50（PE-50）。</li>
	<li>将PE-50导管末端轻轻置于火焰上加热，使其末端扩张成喇叭状。注意避免将末端完全熔化或堵塞管腔（可通过将生理盐水从连接在“非扩张”端的25G针头注入并确认液体流通来验证）。此扩张端可作为锚定结构，以保持导管在膀胱内的位置（图5）。</li>
	<li>按照步骤1.2所述方法对动物进行麻醉。</li>
	<li>使用剃毛剪去除动物肩胛骨之间背部区域以及腹侧下腹部的毛发。</li>
	<li>用聚维酮碘和70%乙醇对上述区域进行消毒处理。将动物俯卧位放置于手术巾上。</li>
	<li>在肩胛骨之间的背部做一长约1 cm的切口。使用梅岑鲍姆剪，在皮肤与下方肌肉之间建立分离平面：将剪刀尖端插入该平面，并张开剪刀，由此向腹部前方分离形成皮下隧道。</li>
	<li>将动物重新置于仰卧位。按步骤2.1–2.4所述方法做腹部切口并暴露膀胱。随后将膀胱复位回腹腔内。</li>
	<li>从背部皮肤切口处，将一小弯钳插入步骤5.6中创建的皮下隧道中。操作时用手指保护腹腔内器官，以钳尖穿透腹壁进入腹腔。</li>
	<li>用钳子夹住PE-50导管的光滑端，并将其从背部切口拉出。确保球状扩张端未被拉过腹壁（图6）。</li>
</ol>
6. 置入膀胱造瘘管
<ol>
	<li>将膀胱通过切口引出。从此时起，应使用精细镊子操作膀胱，以避免对膀胱造成创伤，防止可能引起的损伤或炎症，这些因素可能影响膀胱测压结果，或导致动物术后额外不适。</li>
	<li>记录拟行膀胱造瘘管置入的位置。应将造瘘管置于膀胱顶部（位于增强段上方），以防止导管扭曲或阻塞。</li>
	<li>使用6-0聚丙烯缝线，在膀胱顶部行荷包缝合，具体方法如下：第一针沿膀胱壁纵向穿入，位置位于拟置造瘘管位置的侧方。在松端夹上一个小夹子，以防缝线意外被完全拉出。第二针以横向方向穿入，起始点位于第一针出针点稍外侧的膀胱壁处。</li>
	<li>不要将缝线拉紧。将下一针与第一针平行（纵向）穿入膀胱壁，位置位于上一横向缝线出针点稍头侧处。第四针从上一缝线出针点外侧开始，终止于第一针进针点附近。正确操作时，可围绕拟置导管位置形成一个环形方形结构（图7）。</li>
	<li>使用18G针头，在荷包缝合中心处刺穿膀胱壁。注意不要刺入过深（仅需进入腔内即可）。将精细镊子的尖端插入开口，轻轻撑开以扩大孔径。</li>
	<li>将导管的膨大端插入膀胱缺损处，直至进入腔内。收紧荷包缝线并围绕导管打结固定。此操作可使膀胱壁紧贴导管，确保其位置稳定（图8）。</li>
	<li>取缝线一端，围绕导管缠绕一圈后打结，以进一步加固导管固定。</li>
</ol>
7. 测试导管并关闭腹部切口
<ol>
	<li>使用1 mL注射器和25G针头，将针头插入导管，缓慢注入生理盐水以扩张膀胱。观察导尿管周围是否有渗漏。一旦看到尿道有液体渗出，立即吸出生理盐水，使膀胱再次减压。</li>
	<li>按照上述步骤4.1–4.4关闭腹部切口。</li>
</ol>
8. 关闭背侧切口并固定导管（适用于大鼠）
<ol>
	<li>将动物置于俯卧位。</li>
	<li>用剪刀在皮肤水平处剪断导管管路。将一根22G钝头针插入管路中。</li>
	<li>使用4-0聚乙醇酸以连续缝合方式关闭覆盖管路的皮肤，针座部分留在皮肤外。</li>
	<li>在钝头针上安装静脉输液帽。使用3-0丝线将导管尖端固定于皮肤（图9）。</li>
	<li>清洁切口部位，将大鼠转移至温暖、洁净的笼子中，使其从麻醉状态中苏醒。</li>
</ol>
8.* 关闭背侧切口并固定导管（适用于小鼠或大鼠）
<ol>
	<li>*通过弯曲导管或使用火焰熔化末端来闭塞导管的远端。</li>
	<li>*将导管末端盘绕后留置于动物背部皮下囊袋内（切勿剪短导管）（图10）。</li>
	<li>*使用4-0聚乳酸羟基乙酸缝线连续缝合关闭导管上方的皮肤（图11）。</li>
	<li>*进行膀胱测压当天，用聚维酮碘和70%乙醇处理背部切口部位。在麻醉下打开背部切口，从皮下囊袋中取出盘绕的导管，然后关闭切口。使动物从麻醉中苏醒，并在其完全清醒后进行膀胱测压。</li>
</ol>
9. 代表性结果 - 外科手术方法
重建的膀胱应尽可能严密防水，以避免因大量尿液渗漏而引起的并发症（图3）。疼痛或不适通常表现为颤抖，或抓挠、啃咬腹部切口。可通过每日皮下注射非甾体抗炎药（如美洛昔康，0.5–1.0 mg/kg，皮下）进行管理。通常情况下，动物仅需在术后前3天接受注射。必要时可补充使用阿片类药物，如布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，皮下，每8–12小时一次）。术后最初3天应每日观察动物3次，第3至5天每日2次，之后改为每日1次，以评估疼痛、感染迹象、伤口愈合情况、活动能力、理毛行为及皮肤弹性。术后最初72小时内给予抗生素（拜耳灵，5 mg/kg，皮下，每24小时一次，体积不超过0.1 mL）作为预防感染的外科预防措施。正常恢复的表现包括正常的行走和活动水平、正常的进食和饮水、无疼痛或痛苦表现（无发声）以及与同笼动物正常的社交行为。在进行膀胱压力测定分析前，应给予至少5–7天的恢复时间，以确保膀胱充分愈合并减轻可能影响实验结果的炎症反应。
膀胱压力测定分析
10. 清醒状态膀胱压力测定分析
<ol>
	<li>使用 MLT844 ADInstruments 系统进行设置，并通过 LabChart v6（ADInstruments）采集和分析数据，同时使用 Harvard 22 注射泵（Harvard Apparatus, Holliston, MA）进行灌注，尽管也可使用其他类似系统（图12）。</li>
	<li>根据所用膀胱测压系统的规格，对体积和压力进行校准。</li>
	<li>将动物置于代谢笼（带金属网底的笼子）中，笼子悬置于一台与换能器相连的电子天平上方。</li>
	<li>排除系统中的所有气泡，并确保灌注泵持续稳定地输出液体。</li>
	<li>将数据采集系统连接至计算机，观察数据波形，并相应调整天平参数。膀胱压力和尿液体积将被持续记录。</li>
	<li>使用27G针头经T型管连接耻骨上导管，分别与压力换能器和灌注泵相连。以小鼠12.5 μL/min、大鼠100 μL/min的速度开始生理盐水灌注。</li>
	<li>等待排尿模式波形趋于稳定（膀胱压力上升后出现排尿），通常需要约10–20分钟。持续记录45–120分钟的排尿周期，或至少记录3–4个完整的排尿周期。</li>
	<li>全程实时观察实验过程，及时发现并处理可能导致伪影的并发症（如导管扭曲、阻塞等；详见下文讨论）。</li>
	<li>停止灌注，将导管与系统断开，并将动物放回笼中。</li>
</ol>
11. 无意识膀胱压力测定分析（无耻骨上导管）
<ol>
	<li>通过腹腔注射（IP）给予乌拉坦（1-2 g/kg）麻醉动物。</li>
	<li>按照上述步骤1.3-2.4暴露膀胱。</li>
	<li>按照步骤9.2校准系统，按照步骤9.4-9.5准备系统。</li>
	<li>将一根通过T型管连接至压力传感器和输注泵的27G针头插入膀胱侧壁。</li>
	<li>记录45-90分钟的排尿周期。</li>
	<li>停止输注，将针头从膀胱中取出，并处死动物。</li>
</ol>
12. 代表性结果——膀胱压力测定分析
随后可分析尿动力学记录曲线，以获得排尿量、膀胱顺应性、最大排尿压、收缩间期、排尿周期时间和残余尿量等参数。
膀胱压力测定图可分为充盈期和排尿期。正常的充盈期是指排尿周期中膀胱在充盈过程中膀胱内压力几乎无明显变化的阶段。正常的排尿期在测图上表现为膀胱内压力持续升高，对应于逼尿肌的收缩。排尿期测图中达到的最高压力称为最大排尿压。较高的最大排尿压可能提示存在梗阻性排尿模式、逼尿肌高收缩性或SP导管扭曲。顺应性可通过计算充盈期灌注液体积与压力变化的比值来获得（顺应性 = ΔV/ΔP）。低顺应性膀胱是指在低压下无法容纳足够尿量的膀胱。间歇性收缩间隔可通过分析膀胱压力测定图上两次收缩之间的时间来计算。较短的间歇性收缩间隔提示膀胱过度活跃。排尿周期时间是指完成一次完整充盈和排尿过程所需的时间，可通过分析测图轻松确定。膀胱压力测定结束后，可获取残余尿量（PVR），方法是在逼尿肌收缩结束后经耻骨上导管抽吸膀胱内残余尿液。这些参数有助于研究者客观地研究膀胱在充盈和排空过程中的动态变化。
<img alt="鸡胚发育、显微镜图像、胚胎学研究、发育生物学研究。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 腹部切口及膀胱脱出的摄影图像。
<img alt="外科技术，伤口闭合，皮瓣，示意图，医疗操作，缝合方法。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 膀胱切口及膀胱腔的暴露。
<img alt="组织中的外科缝线，实验操作，缝合技术，生物学研究。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 植入物在膀胱壁上的整合。
<img alt="动物皮肤上的外科切口；兽医缝合技术；伤口愈合过程实验。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 闭合切口的照片。
<img alt="手术操作；持植入物的镊子特写，显微外科技术，精密工具。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. PE-50 导管的扩口端。
<img alt="外科缝合操作，特写，使用镊子，医疗技术，组织修复，实验。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 通过背侧切口插入PE-50导管（导管）。
<img alt="外科缝合技术，特写；动物组织，术后伤口闭合，兽医操作。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 荷包缝合。
<img alt="手术过程，特写，带有器械、切口过程、医疗技术、精细缝合。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图8. 将导管固定到膀胱。
<img alt="植入导管的大鼠；药理学研究；医学实验。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 9"> 
图 9. 固定好的导管接口。
<img alt="兽医外科技术，用于修复或接触内部结构的手术操作。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 皮下囊袋中的盘绕导管。
<img alt="动物组织手术操作、显微镜图像，聚焦于生物结构及愈合过程。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 11"> 
图11. 背部切口闭合。
<img alt="用于DNA分离的电泳装置；包括电源、凝胶室、天平。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图12"> 
图12. 尿动力学实验装置示例。
<img alt="囊内压力（cm H2O）随时间（min）变化的曲线图，显示不同时间间隔内的压力波动。" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig13.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 13"> 
图13. 典型的膀胱压力测定图谱。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

在小型动物模型中植入生物材料并进行膀胱扩大术后，对其开展的尿动力学评估是识别适用于临床应用的基质结构设计最佳结构与力学特性的关键验证步骤。在本研究中，我们描述了在小鼠和大鼠中实施膀胱扩大术的外科手术方法，以及用于测定组织工程器官尿动力学特性的膀胱压力测定技术，以实现功能评估。我们在涉及小鼠和大鼠的多项实验中应用了这些技术，每项实验均包含30只以上的啮齿类动物，未出现显著问题。我们的研究实验室由基础科学家和具有医师资质的外科医生组成，所有手术操作均由具备至少5至6年毕业后外科培训经验的外科医生完成。
	无论使用何种生物材料，大鼠与小鼠膀胱扩大术的主要差异在于膀胱的大小。由于小鼠膀胱较小，生物材料的分离与植入在技术上更具挑战性。为便于观察，可使用手术显微镜。由于大鼠膀胱较大，因此更适用于需在膀胱上同时进行多种操作的情况（例如扩大术与膀胱造瘘导管置入）。此外，上述方案中描述使用PE-50导管用于大鼠13，但甚至可使用更大规格的导管（如PE-100），尤其是在长期研究中14。在小鼠中，可使用较小口径的导管（如PE-10）15,16，但需注意，更细且更柔软的导管可能无法准确将压力变化传递至传感器。此外，由于小鼠体型较小，将导管固定于背部的替代方法（如上文步骤8*）更为适用，因为钝头针和静脉帽在此情况下过于笨重。该方法的缺点是在进行膀胱压力测定前，需麻醉动物以取出皮下囊袋中的导管末端。
	研究表明，在导管置入后的最初几天（0-4天）内，膀胱压力测定显示膀胱压力升高、活动过度，且排尿量较低。这些指标大约在第6至第7天趋于稳定14,17，因此可能是进行膀胱压力测定的理想时机。然而，文献中大多数研究报告是在导管置入后的前3天内进行膀胱测压18，这导致上述参数随时间呈现较大变异。将经皮膀胱造瘘导管留置超过3天会带来多种并发症风险，如结石形成、导管移位、感染、血尿以及导管被碎屑堵塞等。
	在膀胱测压过程中，已报道的小鼠灌注速率范围为1-3 mL/hr15,16，大鼠为10-11 mL/hr13,19,20。超生理灌注速率可能导致压力测量值假性升高14。在我们的实验设置中，小鼠采用12.5 μL/min（0.75 mL/hr）的灌注速率，大鼠采用100 μL/min（6 mL/hr），但也可使用更低的速率。生理盐水的温度应至少为室温，尽管使用温热（37°C）的盐水更为理想，以避免因灌注冷液体而诱发膀胱过度活动。在清醒状态下的膀胱测压中，至关重要的是让动物适应笼具环境，使排尿模式趋于稳定，根据我们的经验，这一过程通常需要约10-20分钟。此后，可连续记录45-120分钟的规律排尿周期，或至少记录3-4个完整的排尿周期。由于动物处于自由活动状态，需实时观察，以防导管扭曲或折叠等并发症影响膀胱测压结果的准确性。应尽量减少膀胱测压期间的环境噪音，以降低动物活动及其引发的伪迹。无意识状态下的膀胱测压虽无清醒测压的相关问题，但多种麻醉剂已被证实会抑制膀胱的自发性收缩。这种抑制作用与麻醉药物预期的作用时间直接相关，即当麻醉效应消退后，自发性膀胱收缩也随之恢复14。此外，在活体及死后的大鼠中，麻醉状态下膀胱溢出时测得的压力在统计学上显著更高，提示麻醉对膀胱壁的被动顺应性产生了影响。该效应在使用戊巴比妥钠21、氯胺酮和氯醛糖（肌内或腹腔注射）以及吸入性氟烷和鞘内注射奈萨卡因时均有观察到14。一项更广泛的研究进一步证实，在中等麻醉深度下，吸入性麻醉剂（如异氟烷和甲氧氟烷）和巴比妥类麻醉剂（如戊巴比妥钠和硫丁巴比妥）均可抑制排尿反射17。即使使用芬太尼-氟哌啶醇或氯胺酮-地西泮等药物达到轻度麻醉或镇静水平，同样可观察到该抑制效应；且与前述研究一致，随着麻醉作用的减弱，抑制效应也随之消失17。对于本实验操作，可选用腹腔注射乌拉坦，因其已被证明可在提供充分麻醉的同时保留排尿反射17,22，且对排尿压力无显著影响23。本文描述的是经耻骨上途径置入导管进行膀胱测压，因为经尿道插管已被证实会导致较高的膀胱压力曲线和较低的尿流率，提示存在相对性的膀胱出口梗阻24。此外，经尿道插管仅适用于麻醉状态下的动物，即便如此，插管操作仍可能较为困难，尤其在雄性啮齿类动物和小鼠中更为明显。
	总之，选择用于膀胱扩大术和/或尿动力学分析的动物模型取决于特定研究的目标。从技术角度来看，大鼠模型因上述原因具有明显优势。然而，由于小鼠易于进行遗传操作，因此在评估特定基因编码终产物在泌尿道疾病中作用的研究中，可采用小鼠模型。而在大鼠中，这类操作通常难以实现。
	清醒状态下的膀胱测压最能准确模拟动物进行排尿周期时的正常生理状态，因此更有可能对膀胱功能作出更可靠的生理学评估。此外，还可避免麻醉剂对膀胱功能直接作用所带来的混杂因素。

<table><tbody><tr><td>剃毛剪</td><td>大鼠/小鼠手术前备皮</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾、聚维酮碘、70%乙醇、无菌纱布</td><td>准备无菌手术区域</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;器械：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>皮肤切口</td><td></td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>操作皮肤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊</td><td>无创（无齿），无锯齿或具细锯齿，用于组织操作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型持针器</td><td>锐性组织分离</td><td></td><td></td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪</td><td>膀胱切口</td><td></td><td></td></tr><tr><td>腱膜剪</td><td>用于牵引缝线及建立皮下隧道（膀胱造瘘导管）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型弯血管钳</td><td>建立皮下隧道（膀胱造瘘导管）</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;缝线：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>6-0 聚丙烯缝线</td><td>膀胱固定缝线和荷包缝合</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线</td><td>支架与膀胱的吻合</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线</td><td>肌肉/皮肤缝合</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 或 4-0 丝线缝线</td><td>将导管尖端固定于皮肤</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;针头与注射器：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>穿刺膀胱以置入膀胱造瘘导管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 号和 30 号针头</td><td>检测膀胱是否漏液</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器（含生理盐水）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 号钝头针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;膀胱造瘘导管：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PE-50 导管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>打火机</td><td>扩宽 PE-50 导管末端</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型弯血管钳</td><td>建立皮下隧道</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;膀胱测压：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MLT844 ADInstruments 数据采集系统及 LabChart 软件</td><td>压力数据采集</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harvard 22 注射泵（Harvard Apparatus，Holliston，MA）</td><td>液体灌注泵</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;麻醉剂（无意识状态下膀胱测压）：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>全身麻醉的诱导与维持</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨基甲酸乙酯</td><td>无意识状态下的膀胱测压</td><td></td><td></td></tr><tr><td>布比卡因或等效药物</td><td>局部麻醉</td><td></td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>术后镇痛</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>术后镇痛</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用不同啮齿类动物模型通过膀胱压力测定分析评估用于膀胱扩容的生物材料

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

肾脏功能和尿液控制能力在很大程度上依赖于膀胱的正常功能，膀胱能够以低压储存尿液，并通过精确协调的收缩将其排出。多种先天性和获得性泌尿系统异常，如后尿道瓣膜、良性前列腺增生以及继发于脊柱裂或脊髓损伤的神经源性膀胱，均可导致病理性组织重塑，进而引起膀胱顺应性下降和容量减小1。这些疾病常伴有泌尿道的功能性或解剖性梗阻，可能导致尿失禁，并因储尿和排尿压力升高而造成肾脏损伤2。当药物治疗无效时，将胃肠道节段外科植入以扩大膀胱容量并降低膀胱内压力，是目前主要的外科治疗手段3。然而，该方法受限于可用供体组织的不足，且常伴随显著并发症，包括慢性泌尿道感染、代谢紊乱、尿路结石形成以及继发性恶性肿瘤4,5。
目前，膀胱组织工程的研究重点在于寻找能够支持缺损部位组织再生的生物材料结构。来源于天然和合成聚合物（如小肠黏膜下层和聚乙醇酸）的传统三维支架在支持尿路上皮和膀胱平滑肌再生以及提高动物模型和临床患者器官储尿能力方面已显示出一定的短期成效6,7。然而，支架在力学完整性和生物相容性方面的不足常导致有害的纤维化8、移植物收缩9和钙化10，从而增加植入失败的风险并需要二次手术干预。此外，利用现有生物材料构建体进行膀胱扩大成形术尚无法恢复正常的排尿功能，因此亟需研发新型基质材料以实现这一目标。
为了成功开发和评估用于临床膀胱扩大术的最佳生物材料，必须首先在标准化的动物模型中采用详细的手术方法和功能结局评估进行有效性研究。我们先前已报道了在小鼠中使用膀胱扩大模型，以确定基于丝素蛋白的支架材料在介导组织再生和功能性排尿特性方面的潜力11,12。对该模型的尿动力学分析表明，植入物的结构和力学性能差异会影响组织工程膀胱的尿动力学特征11,12。该模型还显示，通过组织学方法确定的基质介导组织再生程度与通过尿动力学评估的功能性顺应性和容量之间存在正相关关系11,12。因此，这些结果提示，在啮齿类动物膀胱扩大系统中对生物材料构型进行功能评估，可能是评估支架特性并在开展大型动物研究及临床应用前确立其in vivo可行性的有效方法。在本研究中，我们将展示在小鼠和大鼠中使用丝素蛋白支架进行膀胱扩大的各个手术阶段，并演示清醒状态和麻醉状态下尿动力学检测的技术方法。

采用三维支架在小鼠和大鼠模型中描述膀胱扩大术的外科手术步骤。为评估生物材料构型在膀胱扩大术中的有效性，本文介绍了清醒状态和麻醉状态下膀胱测压的技术方法。

肾脏功能及尿液控制能力在很大程度上依赖于膀胱的正常功能，膀胱能够以低压储存尿液并……

该实验方案的目的是通过流式细胞术获取功能数据，以评估生物材料在膀胱扩大术中的应用。首先，将支架植入膀胱内创建的缺损部位。该操作的第二步是将膀胱造瘘管穿隧道至腹部。第三步是将造瘘管置入扩大后的膀胱，并将其固定在动物的背侧。最后一步是进行测压以从功能角度评估扩大后的膀胱。最终结果可通过清醒状态下的测压显示膀胱容量和顺应性的变化、排尿压力、排尿周期时间以及排尿后残余尿量。该技术的应用前景涉及治疗导致膀胱容量、顺应性及整体功能受损的先天性和后天性膀胱或尿道异常。由于用于膀胱扩容的新型生物材料需要进行功能评估，因此在完成动物腹部手术准备后，使用手术刀经皮肤做下腹正中切口。使用有齿镊提起腹直肌，用精细的梅茨钳和小号巴尔姆剪刀游离肌肉的后表面，并在中线处剪开肌肉全长，直至皮肤切口。将膀胱经切口处拖出。每日一次，先经膀胱后壁缝合，再穿过膀胱前壁进行缝合固定。在膀胱侧方添加额外缝线，但暂不打结。当缝线拉紧时，膀胱将呈现约一平方厘米大小的方形结构，切口沿膀胱前壁正中线纵向穿过膀胱，位置略低于膀胱顶部。注意不要对这些缝线施加过大张力，以免缝线轻易穿透膀胱组织。此步骤建议使用放大镜以利于支架的吻合。使用精细剪刀，将丝素蛋白支架修剪至与膀胱缺损区域大致相同的范围。从支架的一角开始，以连续缝合的方式将其缝合到膀胱上。为了在缺损周围形成完全密闭的防水密封，外科医生必须确保支架与膀胱之间的吻合无张力且防水，这一点至关重要。这将确保所有尿液均被封闭在膀胱内，因为任何腹腔内渗漏都可能导致动物死亡。作为测试，使用30号皮下注射针头向膀胱内注入水。若发现有渗漏，用额外的间断缝合线将其封闭。然后在关闭腹壁前，将重建的膀胱复位回腹腔内。注射布比卡因至腹直肌及皮下组织以实现局部麻醉，并关闭切口。接着，使用连续锁边缝合法使腹直肌复位，并用连续锁边缝合法缝合皮肤。清洁并擦干切口后，将动物转移至温暖、洁净的笼具中，使其从麻醉状态恢复清醒。开始之前，在一根10厘米长的PE 50导管末端制作一个锚定结构，以防止其从膀胱中滑脱。可通过将导管末端轻轻接触火焰使其略微扩张来实现。其次，确认导管未被堵塞。用生理盐水注入非扩口端，并确保其通畅。在动物术前准备完成后，暴露膀胱之前，在肩胛骨之间的背部做一厘米长的切口。使用梅森-伯尔姆剪刀，在皮肤与下方肌肉之间分离出一个平面。然后将剪刀尖置于皮下平面上，撑开以在皮下创建一条通向腹侧腹部的隧道。接着将动物翻转。暴露膀胱并将其复位至腹腔内。回到背侧切口，将一个小夹钳插入皮下隧道中。用手指保护腹腔内器官，然后用夹钳的尖端穿刺腹壁。接着，用夹钳夹住扩口管的光滑端，并将其从背侧切口拉出。不要在导管穿过切口时，将扩大的锚端拉过腹壁。在膀胱顶部放置一荷包缝合线。在缝线的游离端留一个小夹钳，以防缝线意外被拉出缝合口。同时，不要将缝线拉紧。使用 EU 18 号针头在荷包缝合线中心处刺穿膀胱壁，深度以刚好进入腔内为宜。然后将精细镊子插入开口，轻轻撑开以扩大孔口。将导管的喇叭端插入膀胱缺损处，直至进入管腔内。收紧荷包缝合线并围绕导管打结固定。然后将游离的缝线在导管上缠绕一圈并再次打结固定。现在，通过导管缓慢注入生理盐水以测试膀胱。若尿道有液体流出，则吸出盐水以使膀胱减压。再次检查。如发现渗漏，应使用缝线修补；尿液渗漏可能导致动物死亡。按照之前演示的方法关闭腹腔切口。然后进行背侧切口的关闭。大鼠和小鼠的背侧切口关闭方法有所不同。对于大鼠，使用剪刀在皮肤水平处剪断导管管路。然后将一根22号钝头针插入管路中。使用连续缝合线缝合皮肤以覆盖管路，使针座外露。现在将静脉输液管帽盖在钝针上，并将导管尖端固定在皮肤上。之后，清洁切口，并让动物在温暖的环境中恢复。在小鼠中，导管应按以下方式固定：保留导管较长一段，并用火焰加热熔融导管末端以封闭其开口。将导管末端盘绕并置于动物背部的皮下囊袋中。以连续缝合方式闭合导管上方的皮肤。在进行细胞因子分析前，无论是大鼠还是小鼠，均应给予至少5至7天的术后恢复期。细胞术检测当天恢复后。对于小鼠，需先在麻醉状态下打开背部切口，从皮下囊袋中取出盘绕的导管。取出导管后，缝合该切口，并等待小鼠完全从麻醉中苏醒，然后开始将动物置于悬挂在秤上的代谢笼中进行细胞术检测。现在使用连接至压力传感器和输注泵的27号针头，经由ttu通路接入耻骨上导尿管。开始输注生理盐水。待排尿模式描记曲线稳定。在接下来的10至20分钟内，膀胱压力首先升高，随后出现排尿。然后记录15至120分钟内的排尿周期，或在操作过程中至少记录三到四个排尿周期。注意观察导管扭曲及其他并发症。然后可以分析尿动力学图迹，以获得诸如排尿量、顺应性、峰值排尿压力、收缩间期、排尿周期时间以及排尿后残余尿量等参数。观看本视频后，您应能充分理解如何使用任何生物材料对膀胱进行扩容。您还将掌握如何通过清醒、非束缚状态下的测尿法来评估任何啮齿类动物膀胱的功能。

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Bioengineering

生物工程

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