Name: Oct4GiP记者试验研究小鼠胚胎干细胞维持和自我更新的基因调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解利用荧光报告基因检测小鼠胚胎干细胞维持与自我更新相关基因功能的方法。该技术通过基因沉默和流式细胞术快速评估基因作用，适用于发育生物学和再生医学研究。

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感谢 Brad Lackford 对手稿的阅读和编辑。本研究由美国国立环境卫生科学研究所、美国国立卫生研究院院内研究计划 Z01ES102745（资助编号：G. H.）提供支持。

1. Oct4GiP 小鼠胚胎干细胞的维持
Oct4GiP 细胞由 Austin Smith 博士惠赠。该细胞系来源于携带 Oct4-GFPiresPac 转基因的 129/Ola 小鼠4,5。细胞培养于明胶包被的组织培养皿中，使用 ESGRO complete plus clonal grade 培养基（Millipore）或 M15 培养基：DMEM（Invitrogen）添加 15% FBS、1000 U/ml ESGRO（Millipore）、1x 非必需氨基酸（Invitrogen）、1x EmbryoMax Nucleasides（Millipore）以及 10 μM β-巯基乙醇。
<ol>
	<li>在室温下用 0.1% 明胶（Sigma）包被培养板 30 分钟（每 cm2 加入 0.1 ml 明胶溶液）。</li>
	<li>将 Oct4GiP 细胞接种至明胶包被的培养板中，密度约为 2 × 104/cm2。</li>
	<li>每两天用 0.05% 胰蛋白酶消化传代一次细胞。</li>
</ol>
2. Oct4GiP 细胞中的 siRNA 转染
Oct4GiP 报告基因检测最适宜在经明胶包被的平底96孔或384孔板（Corning 或 BD）中的 M15 培养基内进行。整体操作流程如图1所示。
<ol>
	<li>siRNA-脂质复合物的制备：
	<ol>
		<li>对于96孔板中的转染，在U型底96孔板中制备siRNA-脂质复合物。</li>
		<li>在每个孔中，加入10 μl OptiMEM（Invitrogen）和0.3 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen），室温孵育5分钟。</li>
		<li>向脂质-OptiMEM混合物中加入5 pmol siRNA，再孵育15分钟。siRNA与脂质的比例为100 pmol : 6 μl。</li>
		<li>使用多通道移液器将U型底板中的siRNA-脂质复合物转移至明胶包被的平底板中。</li>
		<li>对于384孔板中的转染，使用10 μl OptiMEM、0.1 μl Lipofectamine 2000和2 pmol siRNA制备siRNA-脂质复合物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：转染中siRNA的终浓度为50 nM。每种siRNA转染需进行3-4次生物学重复。在U型底培养板中配制siRNA-脂质复合物的主混合液，并分装至平底明胶包被的培养板中。
<ol start="2">
	<li>Oct4GiP 细胞铺板与转染：
	<ol>
		<li>对于 96 孔板中的转染，收集 Oct4GiP 细胞并将其重悬于新鲜 M15 培养基中，调整细胞密度至 9 x 104 个细胞/ml。</li>
		<li>使用多通道移液器向每孔加入 100 μl 细胞悬液。</li>
		<li>通过上下吹打 3–5 次，将孔中预分装的 siRNA-脂质复合物与细胞悬液混合均匀。不同 siRNA 转染时需更换移液器吸头。</li>
		<li>对于 384 孔板中的转染，将 Oct4GiP 细胞重悬至 6 x 104 个细胞/ml，并向每孔分装 30 μl 细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：最佳细胞接种密度通常为 3 × 105 个细胞/cm2，但对于显著影响细胞生长或活力的 siRNA，可能需要进一步优化。接种密度过低会导致转染期间细胞存活率差；接种密度过高则会因细胞汇合度过高引发分化，从而导致背景信号升高。如有必要，可在 2–4 × 105 个细胞/cm2 范围内测试接种密度。
<ol start="3">
	<li>更换培养基：
	<ol>
		<li>使用多通道吸液器（Corning）或真空吸头（VP-Scientific）移除旧培养基。注意不要刮伤培养板底部的细胞。</li>
		<li>每天使用多通道移液器向细胞中加入新鲜的胚胎干细胞培养基（96孔板每孔100 μl，384孔板每孔30 μl）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. FACS 分析
<ol>
	<li>细胞解离：
	<ol>
		<li>转染后第四天，使用多通道吸液器（Corning）或真空吸头（VP-Scientific）移除培养基。</li>
		<li>对于96孔板，用100 μl PBS洗涤细胞一次。</li>
		<li>使用多通道移液器向每孔加入25 μl 0.25%胰蛋白酶。</li>
		<li>室温孵育5分钟，期间轻轻振荡，观察以确保细胞完全脱落。</li>
		<li>加入90 μl含10% FBS的PBS以终止胰蛋白酶反应，并通过反复吹打使细胞解离成单细胞悬液。</li>
		<li>对于384孔板，使用10 μl胰蛋白酶解离细胞，并用30 μl含10% FBS的PBS终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS分析：
	<ol>
		<li>使用配备高通量筛选（HTS）装置的BD LSRII FACS分析仪或其他类似配置的FACS分析仪（如Accuri或Intellicyt）检测GFP荧光。</li>
		<li>在HTS上启用高通量模式，分析10 μl细胞悬液。将计数阈值设定为1.0 × 104个细胞。</li>
		<li>调节PMT电压和阈值，使细胞在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图中清晰可见。在FSC与SSC散点图中圈选活细胞群体。</li>
		<li>建立GFP通道的直方图。在GFP通道中设置门控，使空白对照组或对照siRNA转染组中约有10%的细胞显示为GFP阴性。</li>
		<li>计算各处理组中GFP阴性细胞的百分比：分化细胞百分比 = GFP阴性细胞百分比。使用双尾t检验比较实验组与对照组siRNA转染后的分化细胞百分比，将p值 < 0.01的结果判定为阳性结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 代表性结果
Oct4、Nanog 和 Sox2 是三个在维持胚胎干细胞自我更新中起关键作用的基因6,7,9-11。图2显示，Oct4GiP 报告基因检测能够轻松检测到在 Oct4GiP 胚胎干细胞中沉默这些因子所引起的分化。
图2A 显示Oct4GiP ES细胞在维持为ES细胞状态时呈GFP阳性。图2B 显示转染了对照siRNA或Oct4-siRNA的Oct4GiP细胞的前向散射与侧向散射图以及GFP通道的直方图。在前向散射与侧向散射图中必须对活细胞进行设门，因为死细胞和碎片呈GFP阴性，会增加背景信号。另一方面，双联体 discrimination 以排除可能的细胞团块并非总是必需的。在转染对照siRNA的细胞中，绝大多数细胞应为GFP阳性。如果在转染对照siRNA的孔中出现明显的GFP阴性细胞群，则起始的Oct4GiP细胞或转染操作可能已受到影响，导致结果无法解读。
图2C显示了对照组、Oct4、Nanog和Sox2 siRNA转染细胞中分化细胞百分比（%分化细胞 = GFP阴性细胞百分比）的柱状图。
<img alt="Oct4GiP 胚胎干细胞中 siRNA 转染的工作流程图；GFP 阴性细胞的流式细胞术分析。" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. Oct4GiP 报告基因检测流程示意图。
<img alt="流式细胞术、GFP的FACS分析、siRNA效应。柱状图：细胞分化百分比。" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. Oct4GiP报告基因检测可检测由Nanog、Oct4或Sox2沉默引起的胚胎干细胞分化。A) 通过FACS分析E14Tg2a（野生型，黑线）和Oct4GiP（绿线）细胞。GFP通道的直方图显示Oct4GiP细胞为GFP阳性。B) 在96孔板中将Oct4GiP细胞转染对照siRNA或Oct4-siRNA，并在转染后4天进行FACS分析。图中显示了转染细胞的前向散射与侧向散射图以及GFP通道的直方图。C) Oct4GiP细胞分别转染对照、Nanog、Oct4或Sox2的siRNA。转染后4天，根据GFP阴性细胞的百分比确定分化细胞百分比，并以均值±标准误差（n = 4）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
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<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们上述描述的 Oct4GiP 报告基因检测法可定量测量自我更新与分化程度。与其他现有方法（如基于形态学12或基于增殖/活力的检测法）相比，该方法具有更高的灵敏度和通量，并能更直接地检测胚胎干细胞状态，因此非常适用于大规模筛选和遗传上位性分析。事实上，我们及其他研究者已成功将 Oct4GiP 报告基因检测法用于全基因组范围的 RNA 干扰筛选3,8。然而，与其他所有检测方法一样，该方法也存在局限性。它仅可用于研究直接或间接调控 Oct4 启动子活性的基因，且可能错误地鉴定出在转录后水平影响 GFP 表达、稳定性或功能的基因。因此，需通过其他辅助检测或二次筛选方法（如碱性磷酸酶染色13（Millipore, SCR004）以及多能性标志物的免疫荧光染色或定量 RT-PCR3,8,12,14）来验证本方法所得结果。
Oct4GiP 报告基因检测依赖于高效的基因沉默。有效的 siRNA 及高效的 siRNA 转染是该检测成功的关键。尽管我们仅描述了报告基因检测与 siRNA 转染联用的方法，但该检测...

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Plus 克隆级培养基</td><td>EMD Millipore</td><td>SF001-500P</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高糖1X）</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>1001817</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM（减血清培养基）</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO mLIF (10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; 单位/1毫升</td><td>EMD Millipore</td><td>DAM1776540</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（Non-Essential Amino Acids）</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>100倍浓缩核苷用于ES细胞 </td><td>EMD Millipore</td><td>10620-1</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522-100ml</td><td></td></tr><tr><td>经胚胎干细胞验证的胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Nanog siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>MSS231181</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-046256-02</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>M-058489-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">对照siRNA：靶向萤火虫荧光素酶的siRNA双链（5&amp;rsquo;-CGTACGCGGAATACTTCGA）由Dharamcon公司合成。</td></tr></tbody></table>

oct4gip 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

多能性和自我更新是胚胎干细胞（ES细胞）的两个定义性特征。了解其潜在的分子机制将极大促进ES细胞在发育生物学研究、疾病建模、药物发现和再生医学中的应用（详见文献1,2）。
为了加快鉴定和表征胚胎干细胞（ES细胞）维持与自我更新的新调控因子，我们开发了一种基于荧光报告基因的检测方法，利用Oct4GiP细胞定量测定小鼠ES细胞的自我更新状态3。Oct4GiP细胞在Oct4基因启动子区域的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）4,5。Oct4是ES细胞自我更新所必需的基因，在ES细胞中高表达，并在分化过程中迅速下调6,7。因此，报告细胞中的GFP表达和荧光信号能够真实反映ES细胞的身份特征5，并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析在单细胞水平上密切监测细胞的自我更新状态3,8。
结合RNAi技术，Oct4GiP报告基因检测可用于快速鉴定和研究胚胎干细胞维持与自我更新的调控因子3,8。与其他检测自我更新能力的方法相比，该方法更便捷、灵敏、定量性好，且成本较低。该检测可在96孔或384孔板中进行，适用于大规模研究，如高通量筛选或遗传上位性分析。最后，通过使用其他谱系特异性的报告基因胚胎干细胞系，本文所述的检测方法也可被改造用于研究胚胎干细胞分化过程中的命运决定。

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

多能性和自我更新是胚胎干细胞（ES细胞）的两个定义性特征。理解其潜在的分子机制将……

以下实验的总体目标是快速确定目的基因在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）自我更新维持中的作用。该目标首先通过构建转染主混合液来实现，该混合液将用于沉默目的基因。第二步。 将转染主混合液转移至明胶包被的培养板中，并加入T 4G IP细胞。随后在正常的胚胎干细胞培养条件下培养细胞，以使基因沉默效应得以显现。培养四天后，将细胞从培养板上分离，并通过流式细胞术检测其自我更新状态。最终可通过流式细胞术分析对照组与实验组siRNA转染的T 4G IP细胞中GFP阴性细胞百分比的差异。与现有的细胞形态学或谱系标志物分析等方法相比，该技术的主要优势在于具有更高的灵敏度和通量，因此更适用于中、大规模的遗传筛选或遗传上位性分析。该方法可极大促进对维持 ESL 及其自我更新能力至关重要的基因的研究。此外，该方法也可适用于 ESL 分化过程中发生的自我特化事件。T 4G IP 细胞在明胶包被的培养皿中维持培养。其接种密度约为每平方厘米 2 × 10⁴ 个细胞，为转染目的每 2 至 3 天传代一次。在 96 孔平底板中，首先用 0.1% 明胶对板进行包被，然后配制 Optum 与 Lipectomy 2000 的主混合液，并分装至 96 孔 U 型底板中。将培养板在室温下孵育5分钟，然后向脂质最佳混合物中加入5皮摩尔的I a，再孵育15分钟。接下来，从96孔平底板中移除明胶，并使用多通道移液器将U型底板中的i a脂质复合物（最佳条件）转移至平底板中。现在收集OC 4G IP细胞，用新鲜M 15培养基重悬，调整细胞密度至每毫升9×10⁴个细胞。然后使用多通道移液器将100微升细胞悬液加入96孔平底板的每个孔中，上下吹打三至五次，使细胞悬液与预形成的Eloqua-siRNA脂质复合物充分混匀。每次更换不同siRNA时需更换枪头。转染完成后，将培养板置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养细胞四天。在培养期间的每一天，使用多通道吸液器小心吸除旧培养基，注意避免刮伤培养板底部的细胞。转染后第四天，使用多通道移液器向细胞中加入 100 微升新鲜的 ES 细胞培养基。用多通道吸液器吸去培养基，并用 100 微升 PBS 清洗细胞一次。然后使用多通道移液器向每孔加入 25 微升 0.25% 胰蛋白酶。将细胞在室温下孵育5分钟，期间偶尔轻轻振荡。待细胞完全脱落后，肉眼观察培养板，确认细胞已完全脱落。加入90 µL含10% FBS的PBS以中和胰蛋白酶活性，用移液器上下吹打数次，使细胞充分解离成单细胞悬液。最后，使用传真分析仪的高通量模式（HTS单元）分析10 µL细胞悬液。将计数阈值设为1.0 × 10⁴个细胞，并调节PMT电压，以便在前向散射与侧向散射图中捕获细胞。在前向散射与侧向散射图中为活细胞群设置分析门，然后创建GFP通道的直方图。在模拟转染或对照 SINA 转染细胞中，通过设定 GFP 通道的门控

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生物学

Oct4GiP记者试验研究小鼠胚胎干细胞维持和自我更新的基因调节

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

SC1通过同时抑制Ras-GAP和ERK1发挥作用。我们在无LIF条件下测试了SC1在维持小鼠胚胎干细胞自我更新中的功能，结果表明SC1能够维持小鼠胚胎干细胞培养的自我更新能力。...

使用SC1（Pluripotin）在无LIF条件下维持小鼠胚胎干细胞自我更新

本视频展示了一种评估小鼠胚胎中视黄酸活性的技术。从小鼠胚胎中分离细胞后，将这些细胞与视黄酸（RA）报告细胞共培养。胚胎细胞产生的视黄酸可诱导报告细胞中β-半乳糖苷酶的表达，从而指示胚胎细胞中存在视黄酸活性。...

利用报告细胞共培养研究小鼠胚胎细胞的视黄酸生成

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

本文介绍了一种定量且可扩展的方案，用于对调控 naive-primed...

通过高通量抑制剂筛选鉴定调控胚胎干细胞多能性的激酶的简易方法

我们详细描述了两种基于化学方法培养小鼠胚胎干细胞的方案。这种新方法利用了促进Tet介导的氧化（通过维生素C）和抑制的协同机制 从头合成...

使用MEK抑制剂PD0325901和维生素C维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

本方案通过放线菌素D处理、逆转录定量PCR及非线性回归分析，定量测定小鼠胚胎干细胞中基因间和基因内增强子RNA的稳定性和半衰期。采用位置特异性标准化策略，以准确建模依赖于上下文的增强子RNA降解动力学。...

小鼠胚胎干细胞中增强子RNA稳定性的优化定量评估

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

了解利用荧光报告基因检测小鼠胚胎干细胞维持与自我更新相关基因功能的方法。该技术通过基因沉默和流式细胞术快速评估基因作用，适用于发育生物学和再生医学研究。

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

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