可视化和肝脏微循环血流量和耗氧量分析:急性肝炎模型中的应用
2012年8月4日
光学系统的开发，可视化与FITC标记的红细胞肝脏微循环和氧气在微血管局部压力测量激光辅助磷光。这种方法可以用来研究生理和病理机制，通过分析微血管结构，直径，血流速度和氧张力。
开发了一种光学系统，用于用荧光标记的红细胞可视化肝脏微循环，并通过激光辅助磷酸化图像测量微血管中的氧分压。该方法可用于通过分析微血管结构、直径、血流速度和氧分压来研究生理和病理机制。在肝脏微循环中，血液从门静脉 ES 流向中央 ES，在两者之间形成氧梯度。
肝脏中的氧浓度会影响酶的表达和病理学，因此需要进行血流分析和氧测量。重要的研究主题。我们的实验方法包括静脉注射用荧光标记的红细胞。
为了使用荧光进行氧分压测量来可视化微循环，我们静脉注射钯卟啉，当被激光激发时，它会在血液中发出磷光，其程度取决于周围氧气的浓度。该过程允许对氧气进行定量分析，肝脏微循环分压测量显示门静脉和中央静脉氧分压分别为 59.8 和 38.9 毫米汞柱，证明氧气浓度的有效测量。接下来，我们将这种方法应用于肝炎模型。
我们发现门静脉 ES 正弦和中央 es 的氧分压升高，但门静脉和中央 es 之间的压差减小。这可能是由于肝细胞坏死导致中央 Ven 区的耗氧量减少。这些结果表明，我们使用光学系统测量肝脏血流动力学和耗氧量的方法能够阐明肝脏微循环中各种肝脏疾病的机制。
氧梯度是一个重要参数，涉及门静脉周围和旁中央区域酶的表达，这些肝脏疾病与微分布有关，因此量化血流和耗氧量很重要。为了阐明机制，我们的方法是非接触式和连续光学测量可以量化肝脏微循环中的血流、急迫血管直径和氧梯度。从供体小鼠中取出全血，用 PBS 洗涤红细胞两次，以 400 G 离心 5 分钟。
接下来，将 2 毫克 FITC 溶解在 1 毫升 100 毫摩尔的磷酸氢二钠中，然后通过 0.2 微米的孔膜过滤。接下来，将 1 毫升 FITC 溶液与 0.15 毫升 3 毫摩尔灵巧溶液、0.25 毫升 180 毫摩尔 DI 磷酸氢钠和 1.5 毫升 100 毫摩尔 DI 磷酸氢钠一起放入试管中，轻敲混合。在用 PBS 洗涤染色的 RBC 两次之前，将其保持在室温下两小时。
接下来，将少量 RBC 悬浮液放在载玻片上，确认 RBC 外观正常且荧光充足 将 0.1 毫升 RBC 悬浮在 0.9 毫升 PBS 中，并保持 4 摄氏度直到使用 接下来，将 500 毫克 BSA 溶解在 10 毫升 PBS 中。然后加入 30 毫克钯卟啉并搅拌过夜离心，除去任何未溶解的钯卟啉的溶液并通过 0.2 微米 po 膜雄辩剂过滤 SUP natin，将 1 毫升滤液放入试管中，并在零下 20 摄氏度下储存。注意避免反复冻融。
为了在显微镜下观察微循环，在塑料板上切一个直径为 20 毫米的孔，并用向一侧 30 毫米的方形盖玻片盖住孔。在插管尾静脉后，将肝主叶以俯卧位铺在塑料板上。接下来，使用多个 3 毫米 x 8 毫米的塑料食品包装膜覆盖肺叶周围的区域，以防止呼吸和干燥引起的运动。
用透射显微镜观察肝循环，并确认视野中至少 15 分钟内血流没有停滞。观察血流逐渐注射。点 2 毫升荧光标记的红细胞。
要测量氧分压，请注射 0.2 毫升钯卟啉溶液。FITC 标记的红细胞将占可视化区域循环中所有红细胞的 50 分之一，用通过 450 至 490 纳米带通滤光片的汞灯照射 FITC 来激发 FITC，并用 CCD 相机记录荧光。钯卟啉磷光相对较弱，需要高灵敏度检测器和黑暗的房间。
钯卟啉吸收峰在 410 和 532 纳米附近，建议使用 532 纳米的二次谐波波长。该波长由钕 YAG 脉冲激光器产生，将激光束连接到倒置显微镜并进行调整，使光束照亮焦平面的中心。激光的空间分辨率取决于光斑大小，光斑大小可以通过光束穿过针孔来调整。
将长通滤光片和光电倍增管也连接到显微镜上以检测磷光。PMT 应对红色波长敏感，尤其是 700 纳米左右。对磷光信号进行采样，并通过应用指数函数计算衰减时间常数。
在这个实验中，我们以 200 kHz 的频率对 500 个点进行了采样。要校准，请准备两种氧分压为 150 和零毫米汞柱的钯卟啉溶液。对于零毫米的汞溶液，向样品中添加 1% dihi 钠，以创造校准过程中没有氧气的条件。
保持样品 pH 值为 7.4，温度为 37°C。将鼠标放在显微镜载物台上，将要可视化肝脏微循环的微血管调整到激光点快速小鼠的点，免费饮水过夜，注射后 24 小时腹膜内注射对乙酰氨基酚 24 毫克，麻醉小鼠并用正中切口暴露肝脏。如果有肝炎，肉眼很容易通过中央旁区域的坏死看到。
我们对小鼠氧分压和肝微血管的测量显示，门静脉、窦土和中央静脉的平均氧压分别为 59.8、48.2 和 38.9 毫米汞柱。换句话说，从门静脉到中央 ES 的氧梯度表明红细胞在通过正弦波时释放了足够的氧气。我们准备了对乙酰氨基酚诱导的肝炎小鼠来测量肝脏微血管。
作为病理学模型示例，我们发现与正常小鼠相比，对乙酰氨基酚组门静脉、正弦和中央 Es 的氧分压更高。门静脉和中央静脉之间的氧分压差为正常小鼠 20.9 毫米汞柱，肝炎模型小鼠 16.9 毫米汞柱。门静脉和中央静脉之间的氧分压差为正常小鼠 20.9 毫米汞柱，肝炎模型小鼠 16.9 毫米汞柱。
肝脏微循环中的氧梯度主要是由于肝细胞消耗的门静脉氧气供应引起的，对乙酰氨基酚引起的中央静脉区域的肝细胞坏死导致耗氧量减少，下游微循环，因此与血流动力学相关的问题。供氧和耗氧与多种形式的肝病有关。我们制作了急性肝炎模型，发现微血管中的氧分压增加。
我们的光学系统可用于通过分析微血管结构，而不是血流分布和耗氧量来研究生理和病理机制。
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概述
开发了一个光学系统，用于可视化肝脏微循环，使用荧光标记的红细胞，并通过激光辅助磷光测量微血管中的氧分压。这种创新方法允许通过分析微血管结构、直径、血流速度和氧分压来研究生理和病理机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微循环
- 氧测量
背景
- 肝脏微循环涉及从门静脉到中央静脉的血流。
- 这两个区域之间存在氧梯度。
- 肝脏中的氧浓度影响酶表达和病理。
- 理解血流和氧水平对研究至关重要。
研究目的
- 可视化肝脏微循环。
- 测量微血管中的氧分压。
- 分析血流和氧分压之间的关系。
使用的方法
- 静脉注射荧光标记的红细胞。
- 使用光学系统可视化微循环。
- 使用激光辅助方法测量氧水平。
- 分析微血管结构和血流速度。
主要结果
- 成功可视化肝脏微循环。
- 准确测量微血管中的氧分压。
- 对生理和病理机制的洞察。
- 建立了一种用于未来肝功能研究的方法。
结论
- 开发的光学系统对研究肝脏微循环有效。
- 这种方法可以增强对肝脏病理的理解。
- 未来的研究可以利用这种方法进行各种生理学调查。
常见问题
Executive Industry Relevance
This optical method enables direct visualization and quantification of hepatic microcirculation and oxygen gradients, providing mechanistic insights into liver disease pathophysiology. By linking hemodynamic changes to enzyme expression patterns and zonation-specific injury, it supports target validation in hepatotoxicity and metabolic disease models. The approach offers a translational bridge from discovery to preclinical evaluation by revealing early functional alterations in liver microcirculation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating oxygen gradient alterations with zonated enzyme expression and pathology.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time, label-based hemodynamic readouts in disease models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying early shifts in oxygen consumption that precede structural damage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with quantifiable oxygen and flow parameters for compound screening.
- Reproducibility: Delivers continuous, non-contact measurements that standardize hemodynamic assessments across studies.
- Platform Utility: Generates scalable outputs (vessel diameter, flow velocity, pO2) suitable for high-content analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models acute hepatitis by demonstrating how pericentral necrosis alters oxygen gradients and downstream metabolic signaling.
- Translational Continuity: Connects microvascular dysfunction to enzyme expression shifts, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables early detection of hemodynamic changes that inform go/no-go progression in preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing functional hemodynamic data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking portal-to-central oxygen gradients to metabolic zonation and enzyme activity.
- Screening: Delivers quantitative outputs (flow velocity, vessel diameter, pO2) that enable compound effect stratification in liver models.
- Analytics: Provides decay-time-based oxygen measurements and flow metrics that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects hemodynamic shifts to zonated pathology, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable optical platform for longitudinal monitoring of liver microcirculation across disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly measuring oxygen gradients that drive hepatic zonation and enzyme expression.
- Operational Value: Ensures standardization through non-contact, continuous optical measurement independent of probe loading variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early hemodynamic biomarkers of liver injury before histologic endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by revealing oxygen consumption changes predictive of zonated toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, fluorescent labeling, and phosphorescence lifetime imaging.
- Depends on laser systems with specific wavelength excitation (e.g., 532 nm second harmonic) and sensitive red-shifted detection (PMT ~700 nm).
- Necessitates cross-team standardization for consistent calibration using defined pO2 references (0 and 150 mmHg) under controlled pH and temperature.
- Involves adaptation considerations when extending to other microvascular beds due to differences in flow dynamics and oxygen solubility.
- Includes practical limitations such as signal attenuation in deeply embedded vessels and the need for surgical access to hepatic tissue.
