α-测试：利用全唾液进行快速无细胞CD4计数

在资源有限的地区，迫切需要一种经济实惠的CD4细胞计数方法来监测HIV疾病进展。本视频展示了一种低成本的即时检测筛查方法，该方法通过检测唾液中蛋白酶抑制剂Alpha one PI的存在来确定CD4细胞计数。为此，首先让受试者或患者含服一颗柠檬糖，以刺激血清样液体渗入唾液中。

将唾液收集到样本杯中，并转移至96孔检测板。然后向唾液中加入足量的蛋白酶——猪胰弹性蛋白酶，使其结合并抑制α1-抗胰蛋白酶。接着加入比色法弹性蛋白酶底物。

任何残留的未结合弹性蛋白酶会切割底物，导致颜色由无色变为黄色。向孔中加入库马西蓝以染色总蛋白，并使用微孔板读数仪进行比色测定。最终，通过计算α1抗胰蛋白酶与总蛋白的比值，并结合指数值，准确评估CD4计数。

与现有的流式细胞术方法相比，该技术具有多项优势。该检测可在现场进行，无需采血——采血不仅具有创伤性且成本较高；同时无需使用价格昂贵的单克隆抗体，也无需专业技术培训，且不需要冷藏或样本运输。该方法克服了艾滋病干预中的一项关键障碍，将显著影响患者的治疗成本和健康结局，以及 HIV 传播的频率，而这些因素均对全球经济产生重大影响。

该方法可揭示Alpha和PI如何通过黏附与迁移作用调控CD4+ T细胞数量，也可应用于其他系统，例如其他蛋白抑制剂如何调控不同类型细胞的黏附与细胞迁移。我们最初提出该方法，是在发现HIV感染患者体内Alpha-1-PI水平极低，以至于显著限制了进入血液的CD4+ T细胞数量。开始本实验方案前，需为每个将使用的微孔板制备所需的现用工作溶液。

配制 60 毫升 0.05 摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲盐水（TBS），pH 值为 7.8。同时，为每块微孔板配制 6 毫升猪胰弹性蛋白酶 I 型（PPE）。充分振荡混匀 PPE 悬液，然后用 TBS 稀释至浓度约为 0.01 单位/毫升。

接下来，用DMSO配制0.1摩尔的比色底物SA 3-NA储备液。该储备液应立即使用，若需立即使用，可保存于-20摄氏度。通过在TBS中按1:100稀释，为每块微孔板配制6毫升工作液。最后，配制10%考马斯亮蓝R-250的TBS储备液，并立即使用，或若需立即使用，则保存于-20摄氏度。

通过将原液在 TBS 中稀释 1000 倍，为每块微孔板准备 6 毫升溶液。处理唾液时，必须采取适当的预防措施，例如佩戴手套，并让受试者或患者处于直立位时穿着实验服。将 SGO 置于口腔内以刺激血清渗出。

本演示中，由一名研究助理扮演艾滋病患者的角色。对于经常无牙且无法咀嚼口香糖的艾滋病患者而言，无糖柠檬糖更为方便。患者需在前3分钟内根据需要含服柠檬糖，并在接下来的3分钟内将全口唾液收集到样本杯中。此方法可获得约2毫升唾液。

如果唾液不会立即使用，则需在处理样本当天将其置于-80摄氏度条件下保存。将样本在37摄氏度条件下解冻。解冻后，唾液可在2至4摄氏度条件下保存最多三天。每个样本和对照需在96孔平底板中设置三个复孔，每孔加入130微升TBS，用于建立检测的样本孔和对照孔。

然后避开黏液，因为黏液黏稠且不含血清渗出物。将20 µL唾液分别转移至三个检测孔和三个阴性对照孔中。然后向阳性对照孔中加入20 µL TBS，并用移液器吹打混匀。

在此步骤中，吸取唾液时应避免产生涡流和气泡，同时避免吸取固体颗粒和黏液。接下来，轻轻振荡 PO 标志的胰腺弹性蛋白酶（PPE）工作液，充分混匀后，向样本孔、阳性对照孔以及阴性对照孔中各加入 50 µL。

加入 50 µL TBS。由于加入的体积足够大，可使溶液在唾液混合物中均匀分布，因此无需混匀。将培养板在室温下孵育 10 分钟。

孵育结束后，向每个孔中加入50微升弹性蛋白酶底物SA Three NA工作液。然后在23摄氏度下继续孵育45分钟。45分钟后，向每个孔中加入50微升库马西蓝工作液。

然后使用酶标仪在405纳米波长下测定吸光度，以检测SA3NA的裂解情况，同时在595纳米波长下测定考马斯亮蓝的吸光度，以反映总蛋白含量。为计算α1-PI指数，首先使用以下公式计算每个波长下的归一化吸光度：将待测样本平均值与阴性对照平均值之差，除以阳性对照平均值与阴性对照平均值之差。随后，将405纳米处的归一化吸光度除以595纳米处的归一化吸光度，得到α1-PI指数，如图所示。该指数可用于评估α测试是否适合作为在资源有限的流行地区监测CD4计数的即时检测筛查方法。

采集了喀麦隆20名女性和11名男性HIV-1患者的刺激性唾液样本，这些患者在当地诊所接受常规护理。该结果与前期在纽约市采集唾液开发α检测时的初步观察一致。在喀麦隆采集的α1-PI指数与唾液样本和CD4计数之间的相关性，R²值为0.91，P值小于0.0001。该关系由一个三参数S型曲线定义，符合剂量-反应关系。95%的置信区间和预测区间分别用蓝色和红色线条表示。

在之前的一项研究中，我们发现 CD4+ T 细胞在 HIV-1 感染者以及遗传性 α1-PI 缺陷（PIZZ 型）受试者中呈现正弦振荡循环，周期为 23 ± 3.5 天。此处展示的是一个非 HIV 健康对照者 CD4+ T 细胞 27 天周期的计算机生成正弦曲线分析的代表性示例。对六名受试者的 CD4+ T 细胞变化进行计算机生成正弦曲线分析，得到了峰-峰振幅和振荡轴数值，结果符合预期。振荡轴与振幅呈正相关，R² 值为 0.96，p 值为 0.009。

在CD4阳性T细胞计数较低的患者中，CD4 T细胞计数的周期性变化较小；而在CD4阳性T细胞计数较高的患者中，周期性变化较大，因为此处所示的回归线估计了振荡轴，而振荡轴与振幅相关。可通过回归线计算振幅，以估计由于周期性波动叠加所导致的CD4阳性T细胞计数相对于回归线上下波动的预期范围。将计算得到的振幅与置信区间叠加后发现，绿色线所示的振幅位于蓝色线所示的95%置信区间之内。

一旦掌握该技术，从采集唾液到获得患者的CD4细胞计数结果可在90分钟内完成。该操作旨在用作监测CD4计数的筛查试验。若患者CD4计数出现显著变化，则应通过流式细胞术进行随访，以确认CD4计数测量结果的有效性，并为治疗决策提供支持。

在后续的开发阶段，微孔板检测将被转化为试纸条技术，从而实现在无仪器和无电源条件下进行检测。通过唾液传播 HIV 的可能性极低，但 HIV 患者常伴有其他传染病，如结核病和丙型肝炎，因此请务必注意，处理唾液时与处理血液一样，可能因存在未知的传染性颗粒而具有极高危险性。在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套及其他个人防护装备。