Name: 测试:α-细胞快速免费的CD4计数，使用全唾液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 了解使用全唾液进行α-测试快速CD4计数的方法，该方法无需采血即可准确评估HIV患者的CD4细胞数量。这种低成本检测技术适用于资源有限地区的现场筛查，可显著改善患者健康结果并降低医疗成本。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由哈里·温斯顿研究基金会资助。

1. 准备新鲜工作液
<ol>
	<li>TBS： 0.05 M Tris 缓冲盐水，pH 7.8（TBS）。每块微孔板准备 60 ml TBS。</li>
	<li>个人防护装备： 1型猪胰弹性蛋白酶（PPE）以混悬液形式提供。充分振荡混匀后，用TBS将PPE稀释至约0.01 U/ml。每微孔板准备6 ml工作液。</li>
	<li>SA3NA： 琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸对硝基苯胺（SA3NA）。配制 0.1 M 的 SA 储存液3NA溶液置于二甲基亚砜（DMSO）中，立即使用或储存于-20 °C. 通过稀释储备液 SA，为每微孔板配制 6 ml 工作液3TBS 中 1/100 的 NA 溶液。</li>
	<li>考马斯亮蓝： 配制10%考马斯亮蓝R-250（Coomassie Blue）在TBS中的储备液，立即使用或于-20 °C保存20 °C. 按1/1000比例将储备液稀释于TBS中，配制6 ml工作液。</li>
</ol>
2. 准备唾液
<ol>
	<li>唾液采集： 受试者取直立位，在口中放置促唾剂（如柠檬酸或口香糖）以刺激血清渗入唾液。对于常无牙且无法咀嚼口香糖的 HIV-1 患者，使用无糖柠檬硬糖较为方便。前 3 分钟根据需要吞咽，随后 3 分钟将全口唾液收集至带盖杯子中。此过程可获得约 2 ml 唾液。应立即使用或储存于 -80 °C。</li>
	<li>唾液处理： 若样本已冷冻，请在 37 °C 下解冻并置于冰上。新鲜或解冻后的样本可在 2–4 °C 下储存，但不超过 3 天。禁止涡旋震荡唾液，并避免吸取含有黏蛋白的部分，因其不含血清渗出物。处理唾液时应采取标准防护措施 <a href="http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf" target="_blank">http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf</a>。</li>
</ol>
3. 微孔板设置
<ol>
	<li>缓冲液： 每个实验重复三次。向微孔板的每个孔中加入 130 μL TBS。</li>
	<li>样本： 向每个检测孔中加入 20 μL 唾液，终体积为 150 μL/孔。通过移液混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>对照： 阳性对照含有 PPE，但不加唾液；阴性对照含有唾液，但不加 PPE。向阳性对照孔中加入 20 μL TBS，向阴性对照孔中加入 20 μL 唾液。</li>
	<li>PPE 孵育： 充分振荡混匀 PPE 工作液。除阴性对照孔外，向其余各孔加入 50 μL PPE 工作液；向阴性对照孔中加入 50 μL TBS。于 23 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>底物孵育： 向每个孔中加入 50 μL SA3NA 工作液。于 23 °C 孵育 45 分钟。</li>
	<li>考马斯亮蓝： 向每个孔中加入 50 μL 考马斯亮蓝工作液。</li>
	<li>检测： 使用酶标仪读取吸光度，A405 nm 用于检测 SA3NA 的裂解，代表有活性的 α1PI；A595 nm 用于检测考马斯亮蓝，代表蛋白含量。</li>
</ol>
4. 计算 α1PI 指数
<ol>
	<li>标准化平均 A405 nm 和 A595 nm：对每个三复孔计算平均值。用待测样本的平均值减去阴性对照的平均值。为尽量减少板间差异，通过将每个待测样本的平均值除以阳性对照的平均值来进行归一化处理，如下所示： 
	 </li>
</ol>
<img alt="归一化吸光度计算公式；比值法；光谱分析方程" src="/files/ftp_upload/3999/3999eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"> 
<ol start="2">
	<li>计算 α1PI INEX： 将归一化的 A405 nm 除以归一化的 A595 nm： 
	 </li>
</ol>
<img alt="静态平衡公式；α₁PI 指数方程，光谱学中的归一化吸光度 A405/A595。" src="/files/ftp_upload/3999/3999eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"> 
5. 典型结果
为了确定α检测是否适合作为在资源有限的流行地区用于监测CD4计数的即时检测筛查方法，研究人员从喀麦隆诊所接受常规护理的20名女性和11名男性HIV-1感染者中收集了刺激性唾液样本。与在纽约市采集唾液开发α检测时的初步观察结果一致，在喀麦隆采集的唾液中α1PI指数与CD4计数呈显著相关性（r2=0.91，p&lt;0.0001，n=31）。该关系符合三参数S型曲线，符合剂量-反应关系特征（图2A）。95%的置信区间和预测区间分别以蓝色和红色线条表示（图2B）。
在之前的一项研究中，我们确定了在 HIV-1 感染者以及遗传性 α1PI 缺乏症（PIZZ 型）受试者中，CD4+ T 细胞表现出周期为 23±3.5 天的正弦波动规律3。此处展示的是计算机生成的正弦曲线分析的一个代表性示例，显示一名非 HIV-1 健康对照者中 CD4 波动的周期为 27 天 （图 3A）。
计算机生成的CD4正弦曲线分析+ 6名受试者的T细胞变化产生了振幅峰峰值和振荡轴的数值3. 与预期一致，振荡轴与振幅呈正相关（r2=0.96，p=0.009，n=6）（图3B）。在CD4 T细胞计数较低的患者中+ 细胞计数，CD4 T细胞数量的周期性变化较小，且在CD4水平较高的患者中+ T细胞计数呈现显著的周期性波动。
由于图2中所示的回归线估计了振荡轴，而振荡轴与振幅相关，因此可以计算回归线的振幅，从而估计CD4+ T细胞因周期性波动而偏离回归线上下范围的程度（图3C）。将图3C中计算的振幅与图2B中计算的置信区间叠加后发现，振幅（绿色线）位于95%置信区间（蓝色线）之内（图3D）。
<img alt="唾液采集过程及使用微孔板进行蛋白质检测的吸光度测量示意图。" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程概要： 将柠檬酸置于口中并采集唾液。将稀释后的唾液以每组三个复孔的方式加入微孔板的孔中。向每个孔中加入PPE，并在23 °C孵育15分钟。向每个孔中加入PPE底物，并在23 °C孵育45分钟。加入考马斯亮蓝，在405 nm处读取吸光度以检测PPE活性，在595 nm处读取吸光度以检测蛋白质。
<img alt="显示数据点和拟合线的 CD4 细胞与 α1PI 指数关系图；免疫学研究分析。" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. α 检测法与标准 CD4 计数法的比较。A) 通过定量刺激后全口唾液中的 α1PI 指数进行 α 检测。CD4 计数由独立医学实验室采用标准流式细胞术完成。用于流式细胞术的血液和唾液在同一临床就诊期间采集。α1PI 指数与 CD4 计数之间的关系由三参数S型曲线定义（r2=0.91，p&lt;0.0001，n=31）。B) 95% 置信区间和预测区间分别以蓝色和红色线条表示。
<img alt="CD4细胞分析图表；A：周波动，B-D：α1PI指数相关性；数据分析图" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 使用α1PI指数计算CD4计数的准确性。A) 在一名非HIV-1健康对照者中，CD4+ T细胞呈现周期为27天的正弦波动。振荡轴如图中红色虚线所示。B) 采用计算机生成的正弦波分析法，分析4名HIV-1感染者、1名非HIV-1的PIzz受试者以及A部分所示的非HIV-1健康对照者的CD4 T细胞波动，用于计算峰-峰值振幅和振荡轴。CD4 T+细胞振幅与振荡轴之间的关系由三参数S型曲线定义（r2=0.96，p=0.009，n=6）。C) 利用B部分得出的振幅与振荡轴之间的S型关系，计算沿图2回归线（黑线）各点的预期振幅（绿色线）。D) 预期振幅区间（绿色线）与95%置信区间（蓝色线）之间存在显著差异，Mann Whitney秩和检验结果显示差异具有统计学意义（基于95%置信区间与回归线之间的中位数差异（63个细胞/μl）与振幅线与回归线之间的中位数差异（37个细胞/μl）的比较；p=0.001）。

<ol><li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol%2C+triglyceride+and+HDL-cholesterol%3A+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Isr.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li>
<li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+stem+cell+mobilization%3A+The+roles+of+chemokines%2C+proteolytic+enzymes%2C+adhesion+molecules%2C+cytokines%2C+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li>
<li>Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBristow%2C+CL+%22Soluble+factors+mediating+innate+immune+responses+to+HIV+infection%22">Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection</a>. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).</li>
<li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li>
<li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B11Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4%2B+lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , Forthcoming (2011).</li>
<li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+Composition+and+Functions%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Contemp.+Dent.+Pract%22%5BJournal%5D)">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li>
<li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+its+secretion%2C+composition+and+funcitons%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Dent.+J%22%5BJournal%5D)">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li>
<li>Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activity+of+%CE%B11proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum%3A+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li>
<li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+levels+of+%CE%B12-macroglobulin%2C+%CE%B11-antitrypsin%2C+C-reactive+protein%2C+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li>
<li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li>
<li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li>
<li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+ART+guidelines+for+adults+and+adolescents+-+evidence+map%22">2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html">http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html</a> (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

未稀释血清中α的中位浓度为36 μM1PI 和 3.6 μM α2巨球蛋白（α2M）10 倍差异 8两种蛋白质竞争结合PPE。这两种特性，即浓度和对PPE的亲和力，已被用于开发一种能够特异性检测α的方法1正常血清中存在竞争性α时的PI2M 8该方法可检测低至 50 nM 的 μ1PI在含0.3%血清的条件下。在2.5%血清稀释度下，α的结合2M 到 PPE 的信号变得不可检测，且该稀释液中含有约 900 nM α1PI 和 90 nM α2M. 
与血清中α1PI含量比α2M高10倍不同，全口唾液中两者的差异可达20倍9。本研究发现，未经稀释的刺激性唾液中α1PI含量约为血清中的1/30，即约1200 nM α1PI，据此推算α<sub...

<table><tbody><tr><td>促唾液分泌剂，0.05 M 柠檬酸</td><td>Eda&amp;#8217;s Sugarfree Candies，宾夕法尼亚州费城北20街4900号，邮编19144</td><td>无糖柠檬硬糖</td><td></td></tr><tr><td>猪胰弹性蛋白酶，1型（EC 3.4.21.36）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，邮编63103</td><td>E1250</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-对硝基苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4760</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的96孔微孔板</td><td>Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖，邮编07417-1886</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>配备405 nm和595 nm滤光片的微孔板读板仪</td><td>MTX Lab Systems，弗吉尼亚州维也纳泰科路8456号D座，邮编22182</td><td>Dynex P97277</td><td></td></tr></tbody></table>

α-测试：利用全唾液进行快速无细胞cd4计数

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

目前迫切需要一种经济实惠的CD4计数方法来监测艾滋病病情。由于时间和温度限制、技术复杂性以及试剂成本（特别是用于检测血细胞CD4的单克隆抗体），目前唯一可接受的CD4检测方法在资源有限地区难以实现。一种常见的节省成本和时间的实验室策略是通过计算而非直接测量某些血液指标。例如，低密度脂蛋白（LDL）水平是通过总胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）和甘油三酯的实测值计算得出的1。因此，若能鉴定出直接调控CD4+ T细胞数量的无细胞因子相关物，将可能提供一种准确计算CD4计数的方法，因为这些相关物具有生理学相关性。
进入血液并 destined to become 循环 CD4 的干细胞数量+ T细胞的定位由趋化因子CXCL12及其受体CXCR4决定，因其对细胞运动具有调控作用2干细胞向血液中迁移的过程还受到细胞表面人白细胞弹性蛋白酶（HLE）的调控。CS）以及 HLECS-反应性活性 α1蛋白酶抑制剂（α1PI，α1抗胰蛋白酶，SerpinA13在HIV-1疾病中，α1PI 因疾病过程而失活 4在HIV-1感染的早期无症状阶段，活跃的α1PI 在 100% 未经治疗的 HIV-1 患者中均低于正常水平（中位数 = 12 μM），且在有症状阶段仍未能恢复至正常水平4, 5这种模式归因于免疫失活，而非合成不足、蛋白水解失活或氧化作用。我们观察到，在HIV-1感染者中 &gt;220 个 CD4 细胞/μl，CD4 计数与血清中活性 α 水平相关1PI (r2=0.93，p&lt;0.0001，n=26）和非活性α1PI (r2=0.91，p&lt;0.0001，n=26 5α的给药1PI治疗HIV-1感染者与未感染者导致CD4计数显著升高，提示α1PI 参与调控 CD4 的数量+ 血液中的T细胞 3.
在刺激条件下，全唾液中含有足够的血清渗出物（即含有蛋白质成分、通过血管壁进入唾液的血浆），从而可以测定有活性的α1PI，并且该测定值的相关性表明这是一种准确计算CD4细胞计数的可靠方法。简而言之，通过使用口香糖或柠檬酸等促唾剂刺激，可促使血清渗出至全口唾液中。在诱导血清渗出后，通过检测血清α1PI抑制弹性蛋白酶活性的能力来测定其在唾液中的活性。猪胰弹性蛋白酶（PPE）是一种易得且成本低廉的弹性蛋白酶来源。PPE可与α1PI结合形成一对一的复合物，从而阻止PPE切割其特异性底物之一——比色肽类底物琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-对硝基苯胺（SA3NA）。将唾液与饱和浓度的PPE在室温下孵育10分钟，可使PPE与唾液中所有有活性的α1PI充分结合。随后通过加入PPE底物SA3NA，即可测定活性α1PI对PPE的抑制程度。（图1）。尽管CD4计数是以血液体积为单位（CD4细胞/μl）进行测量的，但唾液中α1PI的浓度与唾液中血清的浓度相关，而非与唾液体积相关，因为唾液体积在一天内以及个体之间可能存在显著差异6。然而，唾液中几乎所有的蛋白质均来源于血清，且唾液蛋白质含量是可测量的7。因此，唾液中活性α1PI以相对于唾液总蛋白含量的比值形式计算，称为α1PI指数。本文展示的结果表明，α1PI指数是一种准确且精确的生理学方法，可用于推算CD4细胞计数。

本文介绍了一种使用全唾液进行快速且准确CD4计数的CD4计数方法——α-test。该α-test成本低廉，无需专业技术培训，也无需单克隆抗体等昂贵试剂、仪器设备、冷藏条件、样本运输，以及血液的采集和处理。

α-测试：利用全唾液进行快速无细胞CD4计数

迫切需要一种经济实惠的CD4计数方法来监测艾滋病病情。由于耗时……，在资源有限的地区难以开展CD4计数。

在资源有限的地区，迫切需要一种经济实惠的CD4细胞计数方法来监测HIV疾病进展。本视频展示了一种低成本的即时检测筛查方法，该方法通过检测唾液中蛋白酶抑制剂Alpha one PI的存在来确定CD4细胞计数。为此，首先让受试者或患者含服一颗柠檬糖，以刺激血清样液体渗入唾液中。将唾液收集到样本杯中，并转移至96孔检测板。然后向唾液中加入足量的蛋白酶——猪胰弹性蛋白酶，使其结合并抑制α1-抗胰蛋白酶。接着加入比色法弹性蛋白酶底物。任何残留的未结合弹性蛋白酶会切割底物，导致颜色由无色变为黄色。向孔中加入库马西蓝以染色总蛋白，并使用微孔板读数仪进行比色测定。最终，通过计算α1抗胰蛋白酶与总蛋白的比值，并结合指数值，准确评估CD4计数。与现有的流式细胞术方法相比，该技术具有多项优势。该检测可在现场进行，无需采血——采血不仅具有创伤性且成本较高；同时无需使用价格昂贵的单克隆抗体，也无需专业技术培训，且不需要冷藏或样本运输。该方法克服了艾滋病干预中的一项关键障碍，将显著影响患者的治疗成本和健康结局，以及 HIV 传播的频率，而这些因素均对全球经济产生重大影响。该方法可揭示Alpha和PI如何通过黏附与迁移作用调控CD4+ T细胞数量，也可应用于其他系统，例如其他蛋白抑制剂如何调控不同类型细胞的黏附与细胞迁移。我们最初提出该方法，是在发现HIV感染患者体内Alpha-1-PI水平极低，以至于显著限制了进入血液的CD4+ T细胞数量。开始本实验方案前，需为每个将使用的微孔板制备所需的现用工作溶液。配制 60 毫升 0.05 摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲盐水（TBS），pH 值为 7.8。同时，为每块微孔板配制 6 毫升猪胰弹性蛋白酶 I 型（PPE）。充分振荡混匀 PPE 悬液，然后用 TBS 稀释至浓度约为 0.01 单位/毫升。接下来，用DMSO配制0.1摩尔的比色底物SA 3-NA储备液。该储备液应立即使用，若需立即使用，可保存于-20摄氏度。通过在TBS中按1:100稀释，为每块微孔板配制6毫升工作液。最后，配制10%考马斯亮蓝R-250的TBS储备液，并立即使用，或若需立即使用，则保存于-20摄氏度。通过将原液在 TBS 中稀释 1000 倍，为每块微孔板准备 6 毫升溶液。处理唾液时，必须采取适当的预防措施，例如佩戴手套，并让受试者或患者处于直立位时穿着实验服。将 SGO 置于口腔内以刺激血清渗出。本演示中，由一名研究助理扮演艾滋病患者的角色。对于经常无牙且无法咀嚼口香糖的艾滋病患者而言，无糖柠檬糖更为方便。患者需在前3分钟内根据需要含服柠檬糖，并在接下来的3分钟内将全口唾液收集到样本杯中。此方法可获得约2毫升唾液。如果唾液不会立即使用，则需在处理样本当天将其置于-80摄氏度条件下保存。将样本在37摄氏度条件下解冻。解冻后，唾液可在2至4摄氏度条件下保存最多三天。每个样本和对照需在96孔平底板中设置三个复孔，每孔加入130微升TBS，用于建立检测的样本孔和对照孔。然后避开黏液，因为黏液黏稠且不含血清渗出物。将20 µL唾液分别转移至三个检测孔和三个阴性对照孔中。然后向阳性对照孔中加入20 µL TBS，并用移液器吹打混匀。在此步骤中，吸取唾液时应避免产生涡流和气泡，同时避免吸取固体颗粒和黏液。接下来，轻轻振荡 PO 标志的胰腺弹性蛋白酶（PPE）工作液，充分混匀后，向样本孔、阳性对照孔以及阴性对照孔中各加入 50 µL。加入 50 µL TBS。由于加入的体积足够大，可使溶液在唾液混合物中均匀分布，因此无需混匀。将培养板在室温下孵育 10 分钟。孵育结束后，向每个孔中加入50微升弹性蛋白酶底物SA Three NA工作液。然后在23摄氏度下继续孵育45分钟。45分钟后，向每个孔中加入50微升库马西蓝工作液。然后使用酶标仪在405纳米波长下测定吸光度，以检测SA3NA的裂解情况，同时在595纳米波长下测定考马斯亮蓝的吸光度，以反映总蛋白含量。为计算α1-PI指数，首先使用以下公式计算每个波长下的归一化吸光度：将待测样本平均值与阴性对照平均值之差，除以阳性对照平均值与阴性对照平均值之差。随后，将405纳米处的归一化吸光度除以595纳米处的归一化吸光度，得到α1-PI指数，如图所示。该指数可用于评估α测试是否适合作为在资源有限的流行地区监测CD4计数的即时检测筛查方法。采集了喀麦隆20名女性和11名男性HIV-1患者的刺激性唾液样本，这些患者在当地诊所接受常规护理。该结果与前期在纽约市采集唾液开发α检测时的初步观察一致。在喀麦隆采集的α1-PI指数与唾液样本和CD4计数之间的相关性，R²值为0.91，P值小于0.0001。该关系由一个三参数S型曲线定义，符合剂量-反应关系。95%的置信区间和预测区间分别用蓝色和红色线条表示。在之前的一项研究中，我们发现 CD4+ T 细胞在 HIV-1 感染者以及遗传性 α1-PI 缺陷（PIZZ 型）受试者中呈现正弦振荡循环，周期为 23 ± 3.5 天。此处展示的是一个非 HIV 健康对照者 CD4+ T 细胞 27 天周期的计算机生成正弦曲线分析的代表性示例。对六名受试者的 CD4+ T 细胞变化进行计算机生成正弦曲线分析，得到了峰-峰振幅和振荡轴数值，结果符合预期。振荡轴与振幅呈正相关，R² 值为 0.96，p 值为 0.009。在CD4阳性T细胞计数较低的患者中，CD4 T细胞计数的周期性变化较小；而在CD4阳性T细胞计数较高的患者中，周期性变化较大，因为此处所示的回归线估计了振荡轴，而振荡轴与振幅相关。可通过回归线计算振幅，以估计由于周期性波动叠加所导致的CD4阳性T细胞计数相对于回归线上下波动的预期范围。将计算得到的振幅与置信区间叠加后发现，绿色线所示的振幅位于蓝色线所示的95%置信区间之内。一旦掌握该技术，从采集唾液到获得患者的CD4细胞计数结果可在90分钟内完成。该操作旨在用作监测CD4计数的筛查试验。若患者CD4计数出现显著变化，则应通过流式细胞术进行随访，以确认CD4计数测量结果的有效性，并为治疗决策提供支持。在后续的开发阶段，微孔板检测将被转化为试纸条技术，从而实现在无仪器和无电源条件下进行检测。通过唾液传播 HIV 的可能性极低，但 HIV 患者常伴有其他传染病，如结核病和丙型肝炎，因此请务必注意，处理唾液时与处理血液一样，可能因存在未知的传染性颗粒而具有极高危险性。在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套及其他个人防护装备。

the-test-rapid-cell-free-cd4-enumeration-using-whole-saliva

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

测试：α-细胞快速免费的CD4计数，使用全唾液

集落形成细胞（CFC）实验是一种体外实验，其中造血祖细胞在半固体培养基中形成集落。通过集落形态、细胞形态以及流式细胞术相结合的方法，评估祖细胞在不同造血谱系中增殖和分化的能力。...

人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

在南非，针对艾滋病/艾滋病病毒的抗逆转录病毒治疗正在大规模开展监测。通过流式细胞术，结合血液学（CD45）、免疫学（CD4）以及与病毒载量相关的CD38检测方法进行综合分析。这些现代化技术在约翰内斯堡的南非国家卫生实验室服务署（NHLS-SA）实验室中实施，具有成本效益高、本地内部质量控制严格的优势，为资源有限地区的诊断体系提供了可借鉴的典范。...

全面且经济高效的艾滋病实验室监测：非洲的典范模式

对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1...

对标准临床检测方法无法检出病毒载量的HIV感染者进行HIV-1 RNA的扩增与定量

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外...

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

在本报告中，我们展示了在新鲜全血上进行表型分析实验的染色与分析步骤，以计数主要的天然免疫和适应性白细胞群体。我们重点强调了在多中心临床试验背景下开展这些操作时的注意事项。...

使用全血表型分析法对多中心临床试验中主要外周血白细胞群体进行计数

本视频展示了利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子对人中性粒细胞抗真菌活性进行活细胞成像的分析方法。最初，中性粒细胞内可同时检测到红色和洋红色荧光，随着时间推移，红色荧光逐渐减弱，表明分生孢子被降解，从而证实了中性粒细胞具有抗真菌活性。...

原代人类免疫细胞抗真菌活性的实时评估

我们开发了一种 体外 用于研究免疫调节通路在HIV特异性CD4...

体外检测免疫调节通路对HIV特异性CD4 T细胞效应功能影响的实验方法

与无细胞的HIV-1病毒颗粒不同，受感染的CD4+...

评估HIV-1感染的CD4细胞的天然感知能力+ 使用浆细胞样树突状细胞的T细胞 离体 共培养系统

我们描述了一种处理接受抗逆转录病毒治疗的慢性HIV感染者支气管肺泡灌洗液及其配对的外周血的方法，以评估肺部HIV储存库。这些方法可获得高纯度的CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞，随后可用于通过超敏聚合酶链式反应进行免疫表型分析以及HIV...

支气管肺泡灌洗液及配对血液样本中肺泡巨噬细胞和CD4+ T细胞免疫表型分析与HIV储存库评估的处理方法

本文介绍了一种利用染料稀释法检测CD4+...

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4+ T细胞

母乳可传播人类免疫缺陷病毒（HIV），但仅有约15%的HIV感染母亲所哺乳的婴儿会因此感染。哺乳婴儿每日摄入约105−108个母源白细胞，然而这些细胞的研究尚不充分。本文介绍了从母乳中分离白细胞的方法，并对其吞噬能力进行了分析。...

从人乳汁中分离白细胞用于针对HIV靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测

了解使用全唾液进行α-测试快速CD4计数的方法，该方法无需采血即可准确评估HIV患者的CD4细胞数量。这种低成本检测技术适用于资源有限地区的现场筛查，可显著改善患者健康结果并降低医疗成本。

α-测试：利用全唾液进行快速无细胞CD4计数

探索更多视频