Name: 逆行神经，大港，并用荧光染料的神经根装载 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用聚乙烯吸管将高浓度荧光和钙敏感染料引入神经元或神经束的简单低成本技术。该方法通过正压抽吸和避光孵育实现高效染料装载，适用于神经科学研究中的神经元活动可视化。

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本工作得到了美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所内部项目的支持。我们还要感谢George Mentis博士在本方法的早期开发以及图3数据方面所做的贡献。

荧光葡聚糖已被用作解剖学工具以及神经元活动成像1-4菲尔兹等人 al., (2009)4 发表了一种将离子和电压敏感性染料应用于轴突束的实验方案，重点以脊髓作为模型系统。本文中，我们描述了一种更为详细的程序，用于将荧光染料和/或离子敏感性染料施加于脊髓的切断腹根、背根或任何神经束 体外 光生理学与形态学研究。
1. I 型和 II 型移液管
首先，将两段较短的聚乙烯导管（PE90，Clay Adams 品牌）在酒精灯火焰上加热拉制，制成具有锥形尖端的移液管7。其中一根移液管（I 型）应较短（3–7 mm），尖端细小，可紧密固定目标根或通路（外径：0.2–0.4 mm；内径：0.1–0.3 mm）。然后拉制第二根移液管（II 型），其杆部更长（8–12 cm）、更细，尖端极细（外径：0.2–0.3 mm；内径：0.1–0.2 mm），可插入至 I 型移液管的尖端。第二根较细的移液管将用于从 I 型移液管中抽吸并注入人工脑脊液（aCSF）和染料溶液。
2. I 型移液管的放置
解剖并分离脊髓8,9，将其置于灌流有冷aCSF（约16 °C）的浴槽中，整个加载过程中持续灌流。将I型移液管放置在电极夹持器（H1/12电极夹持器，Narishige）上，使其后端开口可通过一段柔性管（PharMed BPT，Cole-Parmer，#AY242002；10 cm）轻松连接至注射器（1 ml U-100胰岛素注射器，Becton Dickinson或同类产品）（图1A-B）。
 
3. 染料应用
<ol>
	<li>使用注射器，首先将 aCSF 吸入 I 型移液管（图 1B；2A），然后吸入待填充的轴突束或神经根（图 2B）。随后应从后端开口处移除柔性导管。将 II 型移液管连接至另一支注射器，并插入已装载轴突束或神经根的 I 型移液管中。使用连接 II 型移液管的注射器抽吸 aCSF，使残留的 aCSF 刚好覆盖轴突束（图 1C；2C-D）。然后将 II 型移液管从 I 型移液管中撤出。监测 aCSF 液面数分钟，以确认轴突束或神经的密封良好（参见“故障排除”部分第 3 节中的“良好密封”说明）。</li>
	<li>将染料溶解于 aCSF 或含 0.2% Triton X-100 的双蒸水中，小心避免产生气泡，将溶液吸入 II 型移液管。将含有染料的 II 型移液管插入 I 型移液管，并进入残留的 aCSF 溶液中（图 2E）。通过轻微的正压缓慢将染料释放至 aCSF 中（图 2F）。注意避免引入气泡，或导致目标组织从移液管尖端移位。在释放足够量的染料后（3–5 μL 染料溶液），撤出 II 型移液管。</li>
</ol>
4. 孵育
根据实验类型，将组织在避光条件下孵育6至20小时。待充分填充后，轻柔地将电极从组织上移开，使组织处于可用于成像或组织学分析的状态。
故障排除
<ol>
	<li>如果目标组织难以进入 I 型移液管尖端，或进入后松动，则说明尖端直径不合适。若发生此情况，应重新拉制并使用另一根移液管。</li>
	<li>在将染料加入 I 型移液管的 aCSF 前，需确保管内留有足够量的 aCSF，以便 II 型移液管尖端能够触及（图 2D）。否则，加入染料后会形成气隙。若发生此情况，不应添加染料，而应将轴突束从移液管中取出，再重新吸入并确保含有足够量的 aCSF，以便 II 型移液管能够触及。</li>
	<li>若在用 II 型移液管吸液后，I 型移液管中的 aCSF 液面升高，表明组织密封性不佳。此时应更换电极，否则在标记过程中染料会被稀释。</li>
	<li>若在注射染料时有气泡进入 I 型移液管，可通过将 II 型移液管尖端靠近气泡，并使用连接的注射器施加轻微负压，将气泡排出。</li>
</ol>
5. 代表性结果
为了说明该方法的应用，我们同时使用三种不同的葡聚糖偶联荧光染料对运动神经元、感觉传入纤维和脊髓中间神经元进行标记（图3A）。如图3B所示，三类神经元被标记出来：感觉传入纤维（红色）、投射至腹侧索的中间神经元（绿色）和运动神经元（蓝色）。
<img alt="移液管式显微注射装置示意图；柔性弹性体管路；注射器连接。" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 移液管 Type-I 与 Type-II 组装示意图。(A) 将 Type-I 移液管（浅蓝色）放置于电极夹持器上，使其后端开口可方便地连接柔性弹性体管路（B），并可插入 Type-II 移液管（C）。
<img alt="脊神经药物递送示意图、弹性体导管装置、染料应用过程。" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 运动神经元加载荧光染料过程的示意图。(A) 将I型移液管置于待填充的腹根附近。(B) 对移液管施加负压，先将aCSF吸入移液管，随后吸入神经根。(C-D) 断开连接在I型移液管后端的柔性弹性体导管，并通过对II型移液管施加负压减少aCSF的量。(E) 将含有溶解染料的II型移液管尖端插入I型移液管中残留的aCSF内。(E-F) 缓慢用染料填充I型移液管，然后移除II型移液管。
<img alt="显示荧光葡聚糖示踪剂的脊髓示意图；在S4节段头端的神经通路可视化。" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图3. 填充法在离体小鼠脊髓中的应用。（A）示意图，显示用于填充脊髓中不同类型神经元的三根I型移液管。运动神经元（蓝色；Cascade Blue葡聚糖）和骶部感觉传入纤维（红色；Texas-Red葡聚糖）分别通过腹根和背根进行逆向填充。使用荧光素葡聚糖标记轴突经由腹索（VF）上行的脊髓中间神经元（绿色）。每种葡聚糖染料（10,000MW；Molecular Probes）各取1 mg，溶于6 μL含0.2% Triton X-100的蒸馏水中（B）。对一段经上述A方法进行神经元逆向标记的脊髓骶段组织切片进行共聚焦成像。注意，被标记的感觉传入纤维主要位于同侧，仅有少量投射至对侧。被标记的运动神经元位于填充腹根的同侧，而被标记的中间神经元则位于填充侧的对侧（箭头所示）。标尺：200 μm。

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
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<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

我们在此介绍一种简单且经济高效的将染料导入神经元、神经和脊髓束的方案。该方法通过将特定解剖通路暴露于高浓度染料溶液中，持续至完成染料加载过程。与显微注射、浴式给药和电穿孔技术相比，该方法可实现目标区域的逆行标记，且背景信号较低。然而，该方法仅适用于神经系统中可分离出轴突束的部位。此外，由于染料似乎沿轴突扩散以到达细胞体，染料加载时间将取决于染料施加部位与神经元胞体之间的距离。至少在以下条件下 体外 该条件限制了该方法仅适用于长度为几毫米的轴突纤维束。
 此类染料标记的应用包括对正常和突变小鼠的运动神经元进行逆行标记，以及对感觉传入纤维进行顺行标记10,11。此外，该技术已被用于证明感觉传入纤维直接与投射至腰段的脊髓中继中间神经元形成接触12，用于界定新生小鼠运动神经元的激活模式13，以及记录脊髓运动神经元14和中间神经元15对下行输入的反应。

逆行性荧光染料标记神经、传导束和脊神经根

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

逆行标记神经元是一种标准的解剖学方法1,2，也已被用于将钙离子和电压敏感性染料导入神经元3-6。通常，这些染料以固体晶体形式应用，或通过玻璃移液管进行局部加压注射。然而，当染料扩散需要数小时时，这种方法可能导致染料稀释和标记强度降低。本文我们展示了一种简单且低成本的技术，使用充满染料溶液的聚乙烯吸液移液管将荧光染料和离子敏感性染料导入神经元。该方法可在整个染料加载过程中持续保持染料与轴突接触的高浓度，具有良好的可靠性。

我们介绍一种简单且低成本的技术，利用聚乙烯吸液移液管将高浓度的荧光染料和钙敏感染料引入神经元或任何神经纤维束中。

逆行标记神经元是一种标准的解剖学方法1,2，也已被用于将钙离子和电压敏感性染料导入神经元3-6。

本实验的总体目标是利用一种简单且低成本的技术，将高浓度的荧光染料或离子敏感性染料导入神经元或任何神经纤维束中。该方法首先制备两种类型的移液管，即一类和二类移液管。然后将一段柔性弹性体管路连接至一类移液管，并施加正压，使目标神经纤维束进入一类移液管内，同时确认已形成良好的密封。接下来，将二型移液管插入一型移液管中，并使用二型移液管吸取一型移液管中残留的A型脑脊液。然后将染料引入一型移液管，注意避免产生气泡。最后一步是将神经元在避光条件下孵育6至20小时。最终，在移除 I 型移液管后，该制备样品即可用于体外电生理或形态学研究。与现有的浴式给药、BOS 注射和电穿孔等方法相比，该技术的主要优势在于能够将 D 递送至特定的神经元群体。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如特定神经元的活性、连接性、形态以及分布情况。通常情况下，该技术需要经过练习，特别是要确保染料不会在一类移液管中被稀释，并且不能有气泡进入其中。开始此操作时，将聚乙烯管置于酒精灯火焰上拉制，以制成两根具有锥形尖端的短移液管。首先，拉制一根尖端较小的一类短移液管，使其能够紧密固定目标根部或组织束。接着，拉制一支2型移液管，其杆部更长更细，且具有非常细的尖端，可插入1型移液管直至其尖端。随后，将2型移液管连接至EC夹持的19号针头。然后将分离的脊髓置于浴槽中。在整个上样过程中，用冰冻的脑脊液（A CSF）进行超融合。之后，将一型移液管置于电极架上，使其后端开口可通过一段柔性管路轻松连接至注射器。在此步骤中，首先使用注射器将脑脊液（CSF）吸入一型移液管中。接着，绘制需要填充的轴突束或神经根。然后从后端开口处移除柔性管路。之后，将二型移液管连接到另一个注射器上。将其插入显微镜下夹持着轴突束或神经根的第一型移液管中。使用连接在第二型移液管上的注射器抽吸脑脊液（A CSF），使残留的脑脊液刚好覆盖轴突束。随后将第二型移液管从第一型移液管中撤出。监测 A 脑脊液水平数分钟，以确认轴突束或神经的密封良好。随后，将染料溶解于 A 脑脊液或含 0.2% Triton X-100 的双蒸水中。通过向连接的注射器施加微弱的负压，将溶液吸入二型移液管中，注意避免吸入任何气泡。然后将装有染料的二型移液管插入一型移液管中残留的A脑脊液（CSF）溶液内，通过向连接的注射器施加轻柔的正压，缓慢将染料释放到A CSF中。注意避免引入气泡，或导致目标组织从移液管尖端内部发生位移。若在注射染料过程中有气泡进入一型移液管，可将二型移液管尖端靠近气泡处，然后通过连接的注射器施加轻微的负压，将气泡吸出。当释放足够量的染料后，移出二型移液管。接着，根据实验类型，将组织在避光条件下孵育6至20小时。待充分孵育后，轻柔地将电极从组织上撤下。然后，组织即可用于成像或组织学分析。下图示意图显示了同时向运动神经元、感觉传入神经元和脊髓中间神经元加载三种不同的右旋荧光素偶联荧光染料的过程：通过腹根逆行填充级联蓝葡聚糖（Cascade blue Dextran）至运动神经元，通过背根逆行填充德克萨斯红葡聚糖（Texas red dextran）至骶部感觉传入神经元；绿色荧光葡聚糖则被加载至轴突经由腹索上行的脊髓中间神经元。图中显示的是骶段脊髓切片的共聚焦图像，其中神经元已被逆行标记。请注意，标记的感觉传入纤维主要位于同侧，仅有少数对侧投射；标记的运动神经元位于灌注的腹根同侧，而如箭头所示，标记的中间神经元则位于其对侧。通过该操作步骤，还可进一步开展其他方法，以回答有关DI区域神经元的功能连接性、兴奋性与抑制性、窦性类型、分布以及神经递质产生的关键问题。该技术为脊髓与脑干神经生理学领域的研究人员利用离子敏感性染料标记特定神经元群体奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何在离体脊髓的神经元及感觉纤维中应用荧光染料或离子敏感性染料。

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逆行神经，大港，并用荧光染料的神经根装载

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