Name: 在大鼠和小鼠的卵巢切除和17β-雌二醇更换:一个可视化示范 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解卵巢切除术和17β-雌二醇替代方法，用于控制大鼠和小鼠血清雌激素浓度。本视频演示硅胶胶囊和口服Nutella给药技术，帮助研究人员建立稳定的激素替代模型。

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本研究由林雪平大学和东约特兰郡议会资助。

1. 通过背部入路进行卵巢切除术
<ol>
	<li>使用1.5%异氟烷（诱导时使用4%）与氧气/氧化亚氮30%/70%混合气体对动物进行麻醉。将动物俯卧位放置于连接直肠温度计的加热板上。动物与加热板之间应保留一层薄的隔离材料，并通过温度计反馈系统将体温维持在37 ± 0.5 °C范围内。在动物眼睛上涂抹保护性凝胶，并在术后于颈部侧面皮下注射5 mg/kg体重的卡洛芬（Rimadyl），用生理盐水稀释后给药，以缓解疼痛。</li>
	<li>在髂嵴头侧剃除4×4 cm（小鼠为3×3 cm）的毛发区域。使用例如Jodopax彻底清洗剃毛区域，然后覆盖带有4×4 cm开口的手术巾。</li>
	<li>沿中线做2–3 cm长的切口，并钝性分离皮肤与下方筋膜。在中线外侧1 cm处，通过筋膜再做一切口。在此筋膜下尽可能表浅地向侧方钝性分离，直至进入腹腔。</li>
	<li>使用镊子夹住腹腔内包裹卵巢的脂肪组织，轻柔地将其拉出。辨认卵巢结构，在该结构近端0.5–1 cm处结扎子宫角及其血管。切除卵巢及已结扎的脂肪组织，将剩余组织放回腹腔。在对侧筋膜做另一切口，并重复上述操作。</li>
	<li>使用单股缝合线缝合伤口为宜，并让动物从麻醉中自然苏醒。术后至少2小时内将动物置于加热笼中（25–27 °C）。术后最初几天应将动物单独饲养。恢复期间必须频繁清洁或更换笼具。术后24小时，再次皮下注射5 mg/kg体重的卡洛芬（Rimadyl），用生理盐水稀释后给药。</li>
</ol>
2. 通过硅胶胶囊皮下给予17β-雌二醇
<ol>
	<li>将所需量的17β-雌二醇与芝麻油充分混合。对于大鼠和小鼠的生理浓度，我们分别推荐180 μg/mL和18–36 μg/mL。安慰剂胶囊则仅填充纯芝麻油。</li>
	<li>剪取3 cm（小鼠为2 cm）长的硅胶管，以及5 mm（小鼠为3 mm）长的木制涂抹棒作为塞子。用镊子将一根木塞压入硅胶管一端，然后注入17β-雌二醇/芝麻油溶液，使其充满整个管腔。在开口端轻轻塞入另一根木塞以封闭硅胶胶囊（木塞应永久保留在胶囊内）。植入前，将胶囊在剩余的17β-雌二醇溶液中孵育过夜。</li>
	<li>胶囊的植入可在大鼠行卵巢切除术时所使用的麻醉状态下进行。然而对于小鼠，强烈建议在卵巢切除术后恢复14天，以尽量降低胶囊从脆弱皮肤处突出的风险。</li>
	<li>按照步骤1.1进行手术准备，或在关闭卵巢切除切口后，剃除并清洗动物颈部背侧约2×2 cm的区域。做1 cm切口，并向尾外侧钝性分离皮下 pockets，留出足够空间容纳胶囊。取出此前一直孵育在17β-雌二醇溶液中的硅胶胶囊，擦拭后经切口轻轻置入，随后缝合切口。关键是要确保胶囊对皮肤的张力尽可能小，特别是靠近伤口的区域。从胶囊制备到植入的整个过程，都必须避免污染。</li>
</ol>
3. 通过能多益巧克力酱经口给予17β-雌二醇
<ol>
	<li>将17β-雌二醇充分溶解于芝麻油中，然后将芝麻油与能多益（Nutella）混合。建议每只大鼠每日剂量为每千克体重含17β-雌二醇28 μg、芝麻油5 μL和能多益1 g；每只30 g小鼠每日剂量为17β-雌二醇1.12 μg、芝麻油0.312 μL和能多益60 mg。安慰剂组的坚果奶油除不含17β-雌二醇外，其余制备方法相同。</li>
	<li>在实验开始前5天，训练动物食用不含激素的坚果奶油。训练的前3天，应尽量将大鼠分组（约0.5 g能多益供2–5只动物）在其饲养笼内进行训练。训练的第4天和第5天，动物应在给予每日剂量前移至单独的笼子中，以模拟实验时的条件。</li>
	<li>实验期间，每次喂食时均将动物置于单独的笼子中，随后将能多益涂抹于小型陶瓷片上供其食用。若按上述方法完成训练，根据我们的经验，超过95%的大鼠和小鼠均可接受该坚果奶油；一旦完全适应，大多数动物可在数秒内完成摄食。</li>
</ol>
4. 代表性结果
当前方法旨在模拟的生理范围内血清17β-雌二醇浓度，在大鼠中约为5-140 pg/mL，在小鼠中约为5-35 pg/mL4,6。按照上述说明制备的皮下硅胶胶囊，给予体重300 g的雌性Sprague-Dawley大鼠后，血清17β-雌二醇浓度从第2天的约40 pg/mL缓慢下降至第35天的10 pg/mL。然而，在给药后立即会出现一个约1000 pg/mL的血清浓度峰值，并在8小时内迅速降至生理范围（图1A）4,5。上述含有36 μg 17β-雌二醇/mL的硅胶胶囊给予体重25 g的雌性C57BL/6小鼠后，血清浓度从第2天的约90 pg/mL缓慢下降至第35天的25 pg/mL。在浓度开始下降前，可能也会出现与大鼠类似的峰值，但该现象尚未被研究证实（图1B）6。
当以所述剂量对300 g雌性Sprague-Dawley大鼠经口给予Nutella法时，可使17β-雌二醇水平维持在生理范围内，每日波动于10–70 pg/mL之间（图2A）4。在小鼠中使用上述剂量时，每日激素水平在约20至120 pg/mL之间波动（图2B）6。
<img alt="比较大鼠和小鼠植入E2/mL胶囊后随时间变化的17β-雌二醇水平的图表。" src="/files/ftp_upload/4013/4013fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 植入胶囊后大鼠（A；前24小时时间点n=10，后续时间点n=15）4,5和小鼠（B；n=10）6体内17β-雌二醇浓度的示意图。硅胶胶囊在植入初期会引起血清浓度短暂升高，最高可达1000 pg/mL，但在数小时内迅速下降至100 pg/mL以下。在随后的4至5周内，胶囊可维持相对稳定但呈持续缓慢下降的血清浓度。阴影区域分别代表完整雌性大鼠和小鼠体内的生理性17β-雌二醇血清浓度水平。尽管图中未直观显示，采用硅胶胶囊法个体间17β-雌二醇浓度存在差异，大鼠的变异系数为27%至183%，小鼠为28%至115%（极低的平均浓度通常会导致较高的变异系数）。
<img alt="大鼠和小鼠口服E2后96小时内17β-雌二醇浓度的时间-浓度曲线图。" src="/files/ftp_upload/4013/4013fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 以Nutella载体每日给予激素后，大鼠（A；n=15）4和小鼠（B；n=10）6体内17β-雌二醇浓度的示意图。经口给予Nutella的方法会产生每日浓度峰值，但远低于皮下或静脉给药所产生的峰值。该方式模拟了人类激素替代治疗的药代动力学特征，且经口给药可长期持续进行，尽管上图仅展示了最初的96小时数据。阴影区域分别代表完整雌性大鼠和小鼠体内的生理性17β-雌二醇血清浓度范围。尽管图中未直观显示个体间差异，但采用Nutella方法时，大鼠17β-雌二醇浓度的变异系数为40%至132%，小鼠为13%至219%（极低的平均浓度常导致较高的变异系数）。

<ol><li>Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-related+neuroprotective+versus+neurodamaging+effects+of+estrogens+in+rat+cerebral+ischemia%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).</li>
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<li>Yong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+potentiates+ischemia-reperfusion+injury+in+diabetic+ovariectomized+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats.</a> Brain Res. 1054, 192-199 (2005).</li>
<li>Theodorsson, A., Theodorsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+increases+brain+lesions+in+the+cortex+and+lateral+striatum+after+transient+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats%3A+no+effect+of+ischemia+on+galanin+in+the+stroke+area+but+decreased+levels+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus.</a> Peptides. 26, 2257-2264 (2005).</li>
<li>Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+and+effective+method+for+chronic+17beta-estradiol+administration+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice.</a> Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

上述给药方式在早期研究中已被证明在产生生理水平的17β-雌二醇血清浓度方面优于商用缓释颗粒和注射剂。缓释颗粒会导致血清浓度峰值过高且持续时间过长，而注射给药则会引起剧烈的每日激素波动，并需要反复对动物进行操作，造成应激4-6。近期研究进一步强调了选择合适给药方式的重要性：低剂量17β-雌二醇给药方案（如本文所述技术）可对脑缺血起到保护作用8-10，而商用缓释颗粒所产生的17β-雌二醇浓度反而可能加重脑损伤1,2,11-14。此外，也有研究尝试过饮水给药和灌胃两种较少使用的方法。饮水给药的最大优势在于其高度非侵入性，几乎无需对动物进行操作。然而，17β-雌二醇在无乳化剂的情况下难溶于水，个体饮水量难以控制，且若目标是模拟口服药片的摄入模式，则该方法存在另一缺陷：小鼠在24小时内持续饮水。灌胃法最主要的缺点是对动物造成较大应激，并可能引起食管损伤，从而影响其摄食行为。
本文所述的方法——硅胶胶囊和经口Nutella给药——均适用于短期雌激素给药，也可用于长达5至6周的较长期给药。若使用的剂量高于上述描述，无论采用何种给药...

<table><tbody><tr><td>利马多尔，50 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>462986</td><td>卵巢切除术后镇痛。</td></tr><tr><td>卢布里塔尔眼用凝胶</td><td>Leo Laboratories</td><td></td><td>手术期间眼部保护。</td></tr><tr><td>碘帕克斯兽用</td><td>Pharmaxim</td><td></td><td>手术消毒。</td></tr><tr><td>薇乔4-0缝线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td>伤口缝合及卵巢结扎。</td></tr><tr><td>17&amp;#946;-雌二醇，&amp;gt;98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>溶于芝麻油用于硅胶胶囊及能多益。</td></tr><tr><td>芝麻油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-1L</td><td>溶解17&amp;#946;-雌二醇。</td></tr><tr><td>硅胶管，内径/外径：1.575/3.175 mm</td><td>Dow Corning</td><td>508-008</td><td>硅胶胶囊制备。</td></tr><tr><td>木制涂药棒</td><td>Selefatrade</td><td>12-0783</td><td>硅胶胶囊封口。</td></tr><tr><td>能多益（Nutella）</td><td>Ferrero</td><td></td><td>口服17&amp;#946;-雌二醇的载体。</td></tr></tbody></table>

卵巢切除术与17β-雌二醇替代在大鼠和小鼠中的可视化演示

Ovariectomy and 17&beta;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

雌激素是一类具有极其广泛生理效应的女性性激素。在使用大鼠和小鼠开展雌激素研究时，通常需要对其进行卵巢切除术，以消除体内快速波动的激素分泌，并通过外源方式补充17β-雌二醇。然而，目前对于如何给药才能达到生理性的血清激素浓度仍缺乏共识。这一点至关重要，因为17β-雌二醇的给药水平和给药方式会显著影响实验结果1-3。我们在一系列研究中系统比较了不同17β-雌二醇给药方式，发现皮下植入硅胶管胶囊和口服榛子酱（Nutella）在产生生理性17β-雌二醇血清浓度方面优于市售的缓释颗粒（由Innovative Research of America公司生产）以及每日注射给药方式4-6。其中，口服榛子酱的方法此前已被用于布托啡诺的给药7，其优势在于用于雌激素给药时可模拟临床上的口服激素替代疗法，且具有非侵入性的特点；而皮下硅胶胶囊则操作简便，并能提供最稳定的血药浓度。本视频文章逐步演示了在大鼠和小鼠中实施卵巢切除术以及通过硅胶胶囊和口服Nutella进行17β-雌二醇替代的实验操作流程，随后讨论了这些给药方法中的关键注意事项。

本文演示了在大鼠和小鼠中进行卵巢切除术，以及通过硅胶胶囊和口服 Nutella 补充 17β-雌二醇的方法。

雌激素是一类女性性激素，具有极其广泛的作用。在使用大鼠和小鼠进行雌激素研究时，它们是……

本实验的总体目标是对雌性大鼠和小鼠体内通常波动的血清雌激素浓度实现严格控制。首先通过背侧入路切除卵巢，随后制备硅胶弹性胶囊和Nutella混合物。最后，将胶囊植入皮下，或将Nutella混合物经口给予。最终，可通过放射免疫分析获得结果，分别显示胶囊法和Nutella法对应的血清17β雌二醇浓度保持稳定或出现波动。与现有的缓释颗粒等方法相比，这些技术的主要优势在于已被证实可在较长时间内产生生理浓度的雌二醇。该方法有助于回答雌激素研究领域中的一些关键问题，例如不同给药途径、给药部位和剂量之间的效应差异。在对动物进行麻醉后，将其俯卧位放置于连接直肠温度计的加热板上。在动物颈部侧面皮下注射IGEL，以缓解术后不适。在髂前上棘前方4厘米×4厘米区域，以生理盐水配制每千克体重5毫克的IL进行给药。随后用消毒剂对该区域进行消毒，并覆盖带有4厘米×4厘米开口的手术巾。沿中线做2至3厘米长的切口，从中线旁开1厘米处钝性分离皮肤与下方深筋膜。在筋膜上再做一个切口。然后尽可能浅表地在此筋膜下方进行钝性分离，直至进入腹腔。用镊子夹住腹腔内包裹卵巢的脂肪组织，轻轻将其拉出。识别卵巢，并在距此结构近端0.5至1厘米处结扎子宫角及血管。切除卵巢及结扎的脂肪组织，将剩余组织放回腹腔内。在对侧筋膜上再做一个切口，摘除另一侧卵巢。缝合伤口，如果不需要立即给予17β-雌二醇，则让动物从麻醉中苏醒。术后将动物置于加热笼中至少两小时。术后最初几天单独饲养大鼠。术后24小时皮下注射。使用学士管胶囊通过皮下注射给予动物每公斤体重5毫克的17β-雌二醇。将所需剂量充分混匀于芝麻油中。用镊子剪取3厘米长的学士管，并准备5毫米长的木制涂药棒作为封堵材料。在注射17β-雌二醇芝麻油溶液之前，将一个木塞压入学术胶囊中。为填满整个长度，用另一个木塞轻轻封住学术胶囊的开口端。将胶囊在剩余的17β-雌二醇溶液中孵育过夜，然后再进行植入。缝合切口后，剃除并消毒大鼠颈部背侧一块2厘米×2厘米的区域。做一条1厘米长的切口，横向并钝性分离皮下组织。分离出一个皮下囊袋，为胶囊留出充足的空间。擦净学术胶囊，然后轻轻将其通过切口插入。接着用缝线闭合切口。确保胶囊对皮肤的牵拉尽可能小，尤其是伤口周围区域。为了使用坚果酱Nutella作为雌激素给药介质，需先将17β-雌二醇充分溶解于芝麻油中，然后将该芝麻油与坚果酱混合。在实验开始前五天，制备不含17β-雌二醇的安慰剂坚果酱。在第1至第3天训练大鼠食用不含激素的坚果酱。在第四天和第五天以分组形式对动物进行训练。在整个实验过程中，将坚果乳剂喂给单独饲养在笼子中的动物。当给予动物坚果乳剂生理盐水时，应将它们分别放置在不同的笼子中。当前方法旨在重现的17β雌二醇浓度在大鼠中约为每毫升5至140皮克，在小鼠中约为每毫升5至35皮克。如图所示，当给予300克重的雌性Sprague Dawley大鼠

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