Name: 表征的分子机制紫外线辐射诱发白内障 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: 了解利用紫外线辐射诱导大鼠白内障的实验方法，通过实时定量PCR和免疫组织化学技术分析晶状体中caspase-3的表达与定位，揭示紫外线诱发白内障的分子机制。该方法为研究白内障发病机理提供了可靠的动物模型。

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本工作得到了卡罗林斯卡学院KID基金、瑞典辐射防护局、卡罗林斯卡学院眼科研究基金会、Gun och Bertil Stohnes基金会、圣埃里克眼科医院研究基金会、Ögonfonden以及古斯塔夫五世国王与维多利亚王后共济会基金会的资助。

1. 紫外辐射暴露
<ol>
	<li>照射前15分钟，通过腹腔注射给予雌性Sprague-Dawley大鼠90 mg/kg Ketalar（氯胺酮）和10 mg/kg Rompun（赛拉嗪）混合物进行麻醉。</li>
	<li>将动物置于大鼠固定器中，并收紧绑带，直至大鼠固定不动但未造成躯干受压13。</li>
	<li>在大鼠双眼滴加Mydriacyl（托吡卡胺），浓度为10 mg/ml，以诱导散瞳。</li>
	<li>将动物放置妥当，使其一只眼睛对准波长为300 nm14、半高全宽为10 nm的窄束UVR照射，另一只眼睛用黑色胶带遮蔽。</li>
	<li>对大鼠单侧眼睛以300 nm波长、1 kJ/m2的亚阈值剂量UVR-B照射15分钟15。</li>
</ol>
2. 解剖
<ol>
	<li>在预定的暴露后时间点（1、5、24 和 120 小时），通过二氧化碳窒息法处死六周龄大鼠（体重 &lt; 200 g），并辅以颈椎脱位。</li>
	<li>摘除眼球，随后将眼球角膜朝下、后部朝上放置。用27号套管针刺出一个微小孔洞，并沿巩膜表面切向推进，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。然后使用眼科手术剪在角膜缘后方作环形剪切，直至可将巩膜后部掀起。接着用钝性弯镊轻轻提起晶状体。</li>
	<li>在显微镜下清除晶状体赤道部残留的睫状体组织，晶状体在平衡盐溶液中存放时间不得超过5–10分钟。</li>
</ol>
3. 定量 RT-PCR
<ol>
	<li>将晶状体放入含有 350 μl RA1 裂解缓冲液（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）和 3.5 μl β-巯基乙醇的混合液中，置于 2 ml Eppendorf 管内。</li>
	<li>在室温下使晶状体在此混合液中保持 30 分钟。</li>
	<li>用针头匀浆晶状体，直至仅剩晶状体的硬核部分（晶状体的皮质和囊膜已在裂解缓冲液中裂解），然后将核从混合液中移除。</li>
	<li>立即将样品储存在 -70 °C 条件下。</li>
	<li>解冻样品，并按照“培养细胞和组织的总 RNA 纯化”方案（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）进行操作。</li>
	<li>将 RNA 样品储存在 -70 °C 条件下。</li>
	<li>为验证各样品中 DNA 是否已充分去除，使用 p53 DNA 特异性引物（上游引物：5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3'，下游引物：5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'）和 Taq DNA 聚合酶（dNTPack），按制造商说明书进行 PCR 扩增，反应条件如下：步骤 1：95 °C 预变性 2 分钟；步骤 2 进行 40 个循环：95 °C 变性 20 秒，55 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 20 秒；步骤 3：72 °C 最终延伸 7 分钟。预期扩增产物为 243 个碱基对。</li>
	<li>进行 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳，以检测 243 个碱基对的 DNA 特异性 PCR 产物。配制 1.5 % 琼脂糖凝胶时，取 3.75 g 琼脂糖溶于 250 ml TBE 缓冲液中。在 500 ml 1.5 % 琼脂糖凝胶溶液中加入 500 μl 溴化乙锭（0.5 mg/ml）。将混合物放入微波炉加热并搅拌，直至琼脂糖完全溶解。</li>
</ol>
所有样品在1.5%琼脂糖凝胶电泳中均不应显示出任何DNA特异性PCR产物。
<ol start="9">
	<li>使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计测定 RNA 样品（1 μl）的浓度以及样品在 260 nm（RNA）和 280 nm（蛋白质）处的吸光度比值。若 RNA 样品的 RNA 与蛋白质吸光度比值为 2.0 或更高，则表明 RNA 样品纯度合格；若比值低于 2.0，则需重复 RNA 纯化步骤 3.5。</li>
	<li>取相当于 1 μg 的 RNA 样品体积，按照 1st Strand cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR 的 1st Strand cDNA 合成试剂盒）的操作说明合成 cDNA。</li>
	<li>将 cDNA 样品储存在 -20 °C（若需保存一年以上，请储存在 -70 °C）。</li>
	<li>在 iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统上进行定量实时 PCR。根据制造商说明书，在 96 孔板中每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 caspase 3 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。另取一个 96 孔板，同样根据制造商说明书（TaqMan 基因表达检测方案），每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 18s 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。从三个随机选取的未暴露处理的晶状体中提取部分 cDNA 进行系列稀释，并将这些稀释样品与待测样本的 cDNA 一同上样至 96 孔板中进行扩增。</li>
	<li>采用标准曲线法对结果进行定量分析。在 MyiQ 软件中，以达到阈值荧光所需的循环数作为测量值。对每块 96 孔板中的系列稀释样品建立标准曲线，该曲线以阈值循环数为因变量，相对校准品浓度为自变量。使用三个未经处理的晶状体样本的 cDNA 作为校准品。将每个样本的阈值循环数与标准曲线比对，计算出该样本 cDNA 的相对浓度。最后，通过将目标基因 cDNA 的相对浓度与内参基因 18s cDNA 的相对浓度进行比较，获得目标基因的表达水平。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>在 PBS（磷酸盐缓冲液；pH 7.4）中解剖眼球。</li>
		<li>将眼球放入含有 4% 多聚甲醛（PFA）的离心管中，置于冰上固定 20 分钟。前一天配制 4% PFA 溶液，储存于 +4 °C 备用。PFA 溶液新鲜配制后约可保存一周。</li>
		<li>用移液器吸除 PFA，然后用预冷的 PBS 洗涤 20 分钟。</li>
		<li>将眼球置于含 30% 蔗糖的溶液中，+4 °C 过夜。</li>
		<li>将眼球放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂（Tissue-Tek）的小杯中，并调整眼球位置以利于切片。</li>
		<li>在干冰上将 OCT 包埋剂中的样本速冻。</li>
		<li>储存于 -70 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>将眼球置于适当角度，进行冷冻切片。</li>
		<li>从每只晶状体中央区域切取三张 5 μm 厚的正中矢状切片。连续切片之间至少弃去 6 张切片，以避免不同切片中染色到相同的细胞核。</li>
		<li>切下切片后，轻轻将载玻片覆盖其上，使切片自然黏附于载玻片。</li>
		<li>切片在使用前自然风干。载玻片可储存于 -20 °C 备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光免疫组织化学
	<ol>
		<li>让样本恢复至室温（5–10 分钟）。</li>
		<li>用 PAP 笔（Invitrogen）在样本周围画圈。</li>
		<li>待画好的圈自然干燥一段时间（10 分钟）。</li>
		<li>标记载玻片。</li>
		<li>在 1 × PBS 中再水化 15 分钟。</li>
		<li>用标准封闭液透化处理 30 分钟。</li>
		<li>加入一抗（兔多克隆抗体，cleaved caspase-3 抗体 Asp175 9661；Cell Signalling Technology, Inc），按 1:3,000 比例稀释于标准封闭液中。</li>
		<li>置于湿盒中，+4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（&gt;15 分钟，换液 1–2 次）。</li>
		<li>加入二抗（抗兔二抗，具有特定吸收/发射光谱），按 1:300 比例稀释于标准封闭液中。</li>
		<li>用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（&gt;15 分钟，换液 1–2 次）。</li>
		<li>擦除 PAP 笔痕迹。</li>
		<li>置于湿盒中，室温避光孵育 3 小时。</li>
		<li>滴加一滴 Vectashield 封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>等待 Vectashield 固化（约 20 分钟）。</li>
		<li>切片在分析前需避光保存。</li>
		<li>所有对照切片均在不加一抗的条件下进行处理。</li>
		<li>数小时内使用荧光显微镜观察结果。</li>
		<li>从每张晶状体一侧核弓至另一侧核弓之间的上皮细胞核进行计数。使用标准蓝色滤光片观察所有晶状体上皮细胞核（呈蓝色），使用与二抗发射波长匹配的标准滤光片观察 caspase-3 阳性细胞核（呈绿色）。</li>
		<li>记录所有晶状体上皮细胞核数量及阳性细胞核数量。每张切片重复计数三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文描述了可用于研究UVR-B诱导白内障过程中发生的分子事件的方法。
考虑到，目前可获得的大部分信息 体内 由对白化Sprague-Dawley大鼠进行的实验得出紫外线辐射诱发的白内障 7, 16, 17, 18, 19因此，本研究决定采用白化Sprague-Dawley大鼠，大鼠年龄为6周，性别选择雌性，因为与雄性相比，雌性大鼠的尿液致敏性较低。此外，在UVR诱导白内障的严重程度方面，性别之间无显著差异。 20.
所有动物的饲养和处理均遵循眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明。伦理许可由乌普萨拉动物实验伦理委员会批准，批准号为C 29/10。大鼠购自商业养殖场（Taconic，丹麦）。
选择窄带紫外辐射（UVR）光源是为了使UVR光谱分布明确。大鼠晶状体对UVR-B的最大敏感波长约为300 nm。照射剂量选择为1 kJ/m2，低于阈值剂量15。照射时间设定为15分钟...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注（可选）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ketalar</td><td>Pfizer</td><td>150086</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>022545</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Oculentum Simplex</td><td>Apoteket, Sweden</td><td>336164</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Mydriacyl</td><td>Alcon</td><td>00352</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>平衡盐溶液</td><td>Alcon</td><td>0007950055</td><td></td></tr><tr><td>3.5 µL &amp;beta;-巯基乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II 总RNA提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel GmbH&amp;Co, Duren, Germany</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>p53 DNA 特异性引物</td><td>biomers.net GmbH</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶，dNTPack</td><td>Roche</td><td>04 728 866 001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液 0.5 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>E1385</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop ND-1000 分光光度计</td><td>NanoDrop Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; 链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR，AMV）</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11 483 188 001</td><td></td></tr><tr><td>iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.202</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 - Caspase 3</td><td>Applied Biosystems</td><td>Rn00563902_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 - 18S</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs99999901_s1</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ 软件</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3（Asp175）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab6798</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用显微镜 Axioplan 2 Imaging</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>TBE 缓冲液 10×</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

分子机制的表征 体内 uvr 诱导的白内障

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

白内障是全球致盲的首要原因1。世界卫生组织将白内障定义为眼睛晶状体混浊，阻碍光线传递。白内障是一种多因素疾病，与糖尿病、吸烟、紫外线辐射（UVR）、酒精、电离辐射、类固醇和高血压相关。已有大量实验证据2-4和流行病学证据5,6表明，UVR可导致白内障。我们建立了适用于麻醉7和非麻醉动物8的UVR B诱导白内障动物模型。
目前白内障的唯一治愈方法是手术，但这种治疗并非所有人都能获得。据估计，若能将白内障的发病时间延迟10年，对白内障手术的需求可减少50%9。为了延缓白内障的发生，有必要深入了解白内障形成的机制，并找到有效的预防策略。在白内障发展的诸多机制中，细胞凋亡在人类和动物白内障的起始过程中起着关键作用10。我们近期的研究重点是晶状体中的细胞凋亡作为白内障发展的机制8,11,12。预计对紫外线辐射（UVR）对细胞凋亡通路影响的更深入理解，将有助于发现新的药物以预防白内障。
本文中，我们描述了如何通过实验方法诱导白内障 体内 暴露于UVR-B。进一步介绍RT-PCR和免疫组织化学作为研究UVR-B诱导白内障分子机制的工具。

通过方差分析估算了测量过程中各种变异来源，结果发现，若每只动物进行三次测量，则测量间的方差约为动物间方差的15%。因此，在进行全晶状体分析时，无法进一步提高精度。正交检验揭示了在120小时潜伏期与其他较短潜伏期之间，caspase-3 mRNA水平存在统计学上显著的差异。
体内 紫外辐射暴露可诱导半胱天冬酶-3的表达。
<img alt="大鼠实验示意图：氯胺酮麻醉，托吡卡胺应用，紫外线辐射暴露。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 紫外线辐射暴露流程示意图。
<img alt="casp3 m...

白内障是全球致盲的首要原因。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发生的主要危险因素。目前已建立远紫外B波段（UVR-B）诱导白内障的动物模型。本文介绍白内障形成的研究方法：紫外线辐射暴露、定量RT-PCR和免疫组织化学。

分子机制的表征 体内 UVR 诱导的白内障

白内障是全球致盲的首要原因¹。世界卫生组织将白内障定义为眼球晶状体混浊，这种混浊……

本视频演示了一种在大鼠中使用紫外线辐射诱导白内障的方法。随后通过定量实时 PCR 和免疫细胞化学技术研究白内障发展过程中涉及的分子机制。首先，将大鼠的一只眼睛暴露于紫外线辐射下以诱导白内障形成。另一只眼睛作为对照。接着，解剖晶状体并进行处理以提取RNA，通过定量实时PCR检测Caspase-3的表达水平，或使用抗切割型Caspase-3抗体进行染色，以评估活性蛋白的表达与定位。最终，这些检测的结果证实，晶状体细胞在暴露于紫外线辐射（UVR）后，其细胞核内caspase-3 mRNA水平以及活性蛋白的表达均有所增加。本方案相较于现有方法的主要优势在于，采用了一种独特的窄波段紫外线辐射源以及通用的大鼠固定装置，使我们能够安全、精确地以明确定义的紫外光谱和剂量对动物进行照射。此外，我们应用了现代生物学技术，包括定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学，以研究晶状体中的细胞凋亡过程。该方法可提供有关紫外线辐射诱导白内障分子机制的信息。该方法也可应用于其他实验模型，如紫外线诱导或辐射诱导的皮肤癌、大鼠行为神经科学，以及以细胞凋亡为重点的实验性眼科研究。开始本实验方案时，将一只麻醉后的雌性Sprague Dawley大鼠置于大鼠固定器中，在不挤压躯干的情况下收紧固定带，直至大鼠被完全固定。为诱导瞳孔中度散大或扩大，向每只眼睛滴入1至2滴浓度为10毫克/毫升的tpic aide溶液。然后将药膏涂抹于未暴露的眼睛，并用黑色胶带覆盖以阻隔紫外线。接下来，将动物置于固定装置中，使暴露的眼睛对准高压汞灯产生的波长为300纳米、半高全宽为10纳米的窄束紫外辐射。单侧暴露大鼠于亚阈值剂量的UVRB（1 kJ/m²）照射15分钟，照射后进行后续处理。移除未暴露眼睛的胶带，并在双眼涂抹眼膏。将动物放回笼中，并用软纸覆盖以保持温暖。持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。然后将恢复的大鼠放回笼中与其他大鼠同笼。在暴露后1、5、24和120小时进行观察。将安乐死大鼠去核的眼球角膜朝下、后部朝上放置于柔软的纸巾上。然后在解剖显微镜下操作，使用27号套管针沿巩膜切线方向穿刺一个尽可能小的孔，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。接下来，使用眼科手术剪，在角巩膜缘后方环形剪切，直至能够掀开巩膜后部。然后用钝头弯镊夹起晶状体，将晶状体置于平衡盐溶液中，并清除晶状体上残留的睫状体组织。晶状体在平衡盐溶液中保存时间不应超过10分钟。解剖后，将晶状体放入含有 350 µL RA1 裂解缓冲液（来自 Nucleo Spin RNA II 总 RNA 提取试剂盒）和 3.5 µL β-巯基乙醇的 2 mL 微型离心管中，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，用针头对晶状体进行机械匀浆，直至仅剩硬核部分。晶状体的皮质和囊膜将被裂解缓冲液溶解。从混合物中去除细胞核并弃去。立即将样品储存在负70摄氏度条

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表征的分子机制<em在体内</em&gt;紫外线辐射诱发白内障

小鼠眼球解剖的正式演示，最终获得视网膜色素上皮的完整铺片。...

小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

在浅肤色紫外线敏感型人类的小鼠模型中，外用佛司可林可诱导表皮黑色素生成。通过药物调节皮肤中的cAMP水平以及表皮色素加深，能够显著防护紫外线引起的炎症反应（晒伤），该保护作用通过最小红斑剂量（MED）检测法进行测定。...

药理学诱导人源化小鼠模型表皮黑色素生成及其对晒伤的防护作用

我们描述了一种针对转基因啮齿类动物或经特定化学/物理因素处理的相应动物的培养细胞中进行Lambda Select...

Lambda Select cII 突变检测系统

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小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。...

实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

本文描述了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代细胞系和永生化细胞系毒性的实验步骤。...

测定紫外线辐射和化学物质对原代及永生化人角膜上皮细胞的毒性

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评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

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该方案描述了紫外线B辐射对小鼠全身及局部皮肤效应的研究。...

研究小鼠对紫外B辐射的长期暴露

我们详细介绍了一种用于斑块生物学二维血管内分子成像的新型近红外荧光（NIRF）导管 体内NIRF 导管可通过检测对斑块具有高亲和力的可激活型和靶向型近红外荧光染料的存在，从而实现对炎症等关键生物过程的可视化。该导管采用符合临床标准的工程设计和功耗要求，旨在应用于人类冠状动脉。以下研究描述了一种多模态成像策略，该策略利用一种新型的 体内...

体内 近红外荧光（NIRF）血管内分子成像技术对炎症斑块的检测：一种多模态动脉粥样硬化成像方法

了解利用紫外线辐射诱导大鼠白内障的实验方法，通过实时定量PCR和免疫组织化学技术分析晶状体中caspase-3的表达与定位，揭示紫外线诱发白内障的分子机制。该方法为研究白内障发病机理提供了可靠的动物模型。

分子机制的表征体内 UVR 诱导的白内障

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