Name: 表征的分子机制紫外线辐射诱发白内障 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: 了解利用紫外线辐射诱导大鼠白内障的实验方法，通过实时定量PCR和免疫组织化学技术分析晶状体中caspase-3的表达与定位，揭示紫外线诱发白内障的分子机制。该方法为研究白内障发病机理提供了可靠的动物模型。

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本工作得到了卡罗林斯卡学院KID基金、瑞典辐射防护局、卡罗林斯卡学院眼科研究基金会、Gun och Bertil Stohnes基金会、圣埃里克眼科医院研究基金会、Ögonfonden以及古斯塔夫五世国王与维多利亚王后共济会基金会的资助。

1. 紫外辐射暴露
<ol>
	<li>照射前15分钟，通过腹腔注射给予雌性Sprague-Dawley大鼠90 mg/kg Ketalar（氯胺酮）和10 mg/kg Rompun（赛拉嗪）混合物进行麻醉。</li>
	<li>将动物置于大鼠固定器中，并收紧绑带，直至大鼠固定不动但未造成躯干受压13。</li>
	<li>在大鼠双眼滴加Mydriacyl（托吡卡胺），浓度为10 mg/ml，以诱导散瞳。</li>
	<li>将动物放置妥当，使其一只眼睛对准波长为300 nm14、半高全宽为10 nm的窄束UVR照射，另一只眼睛用黑色胶带遮蔽。</li>
	<li>对大鼠单侧眼睛以300 nm波长、1 kJ/m2的亚阈值剂量UVR-B照射15分钟15。</li>
</ol>
2. 解剖
<ol>
	<li>在预定的暴露后时间点（1、5、24 和 120 小时），通过二氧化碳窒息法处死六周龄大鼠（体重 &lt; 200 g），并辅以颈椎脱位。</li>
	<li>摘除眼球，随后将眼球角膜朝下、后部朝上放置。用27号套管针刺出一个微小孔洞，并沿巩膜表面切向推进，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。然后使用眼科手术剪在角膜缘后方作环形剪切，直至可将巩膜后部掀起。接着用钝性弯镊轻轻提起晶状体。</li>
	<li>在显微镜下清除晶状体赤道部残留的睫状体组织，晶状体在平衡盐溶液中存放时间不得超过5–10分钟。</li>
</ol>
3. 定量 RT-PCR
<ol>
	<li>将晶状体放入含有 350 μl RA1 裂解缓冲液（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）和 3.5 μl β-巯基乙醇的混合液中，置于 2 ml Eppendorf 管内。</li>
	<li>在室温下使晶状体在此混合液中保持 30 分钟。</li>
	<li>用针头匀浆晶状体，直至仅剩晶状体的硬核部分（晶状体的皮质和囊膜已在裂解缓冲液中裂解），然后将核从混合液中移除。</li>
	<li>立即将样品储存在 -70 °C 条件下。</li>
	<li>解冻样品，并按照“培养细胞和组织的总 RNA 纯化”方案（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）进行操作。</li>
	<li>将 RNA 样品储存在 -70 °C 条件下。</li>
	<li>为验证各样品中 DNA 是否已充分去除，使用 p53 DNA 特异性引物（上游引物：5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3'，下游引物：5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'）和 Taq DNA 聚合酶（dNTPack），按制造商说明书进行 PCR 扩增，反应条件如下：步骤 1：95 °C 预变性 2 分钟；步骤 2 进行 40 个循环：95 °C 变性 20 秒，55 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 20 秒；步骤 3：72 °C 最终延伸 7 分钟。预期扩增产物为 243 个碱基对。</li>
	<li>进行 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳，以检测 243 个碱基对的 DNA 特异性 PCR 产物。配制 1.5 % 琼脂糖凝胶时，取 3.75 g 琼脂糖溶于 250 ml TBE 缓冲液中。在 500 ml 1.5 % 琼脂糖凝胶溶液中加入 500 μl 溴化乙锭（0.5 mg/ml）。将混合物放入微波炉加热并搅拌，直至琼脂糖完全溶解。</li>
</ol>
所有样品在1.5%琼脂糖凝胶电泳中均不应显示出任何DNA特异性PCR产物。
<ol start="9">
	<li>使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计测定 RNA 样品（1 μl）的浓度以及样品在 260 nm（RNA）和 280 nm（蛋白质）处的吸光度比值。若 RNA 样品的 RNA 与蛋白质吸光度比值为 2.0 或更高，则表明 RNA 样品纯度合格；若比值低于 2.0，则需重复 RNA 纯化步骤 3.5。</li>
	<li>取相当于 1 μg 的 RNA 样品体积，按照 1st Strand cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR 的 1st Strand cDNA 合成试剂盒）的操作说明合成 cDNA。</li>
	<li>将 cDNA 样品储存在 -20 °C（若需保存一年以上，请储存在 -70 °C）。</li>
	<li>在 iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统上进行定量实时 PCR。根据制造商说明书，在 96 孔板中每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 caspase 3 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。另取一个 96 孔板，同样根据制造商说明书（TaqMan 基因表达检测方案），每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 18s 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。从三个随机选取的未暴露处理的晶状体中提取部分 cDNA 进行系列稀释，并将这些稀释样品与待测样本的 cDNA 一同上样至 96 孔板中进行扩增。</li>
	<li>采用标准曲线法对结果进行定量分析。在 MyiQ 软件中，以达到阈值荧光所需的循环数作为测量值。对每块 96 孔板中的系列稀释样品建立标准曲线，该曲线以阈值循环数为因变量，相对校准品浓度为自变量。使用三个未经处理的晶状体样本的 cDNA 作为校准品。将每个样本的阈值循环数与标准曲线比对，计算出该样本 cDNA 的相对浓度。最后，通过将目标基因 cDNA 的相对浓度与内参基因 18s cDNA 的相对浓度进行比较，获得目标基因的表达水平。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>在 PBS（磷酸盐缓冲液；pH 7.4）中解剖眼球。</li>
		<li>将眼球放入含有 4% 多聚甲醛（PFA）的离心管中，置于冰上固定 20 分钟。前一天配制 4% PFA 溶液，储存于 +4 °C 备用。PFA 溶液新鲜配制后约可保存一周。</li>
		<li>用移液器吸除 PFA，然后用预冷的 PBS 洗涤 20 分钟。</li>
		<li>将眼球置于含 30% 蔗糖的溶液中，+4 °C 过夜。</li>
		<li>将眼球放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂（Tissue-Tek）的小杯中，并调整眼球位置以利于切片。</li>
		<li>在干冰上将 OCT 包埋剂中的样本速冻。</li>
		<li>储存于 -70 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>将眼球置于适当角度，进行冷冻切片。</li>
		<li>从每只晶状体中央区域切取三张 5 μm 厚的正中矢状切片。连续切片之间至少弃去 6 张切片，以避免不同切片中染色到相同的细胞核。</li>
		<li>切下切片后，轻轻将载玻片覆盖其上，使切片自然黏附于载玻片。</li>
		<li>切片在使用前自然风干。载玻片可储存于 -20 °C 备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光免疫组织化学
	<ol>
		<li>让样本恢复至室温（5–10 分钟）。</li>
		<li>用 PAP 笔（Invitrogen）在样本周围画圈。</li>
		<li>待画好的圈自然干燥一段时间（10 分钟）。</li>
		<li>标记载玻片。</li>
		<li>在 1 × PBS 中再水化 15 分钟。</li>
		<li>用标准封闭液透化处理 30 分钟。</li>
		<li>加入一抗（兔多克隆抗体，cleaved caspase-3 抗体 Asp175 9661；Cell Signalling Technology, Inc），按 1:3,000 比例稀释于标准封闭液中。</li>
		<li>置于湿盒中，+4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（&gt;15 分钟，换液 1–2 次）。</li>
		<li>加入二抗（抗兔二抗，具有特定吸收/发射光谱），按 1:300 比例稀释于标准封闭液中。</li>
		<li>用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（&gt;15 分钟，换液 1–2 次）。</li>
		<li>擦除 PAP 笔痕迹。</li>
		<li>置于湿盒中，室温避光孵育 3 小时。</li>
		<li>滴加一滴 Vectashield 封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>等待 Vectashield 固化（约 20 分钟）。</li>
		<li>切片在分析前需避光保存。</li>
		<li>所有对照切片均在不加一抗的条件下进行处理。</li>
		<li>数小时内使用荧光显微镜观察结果。</li>
		<li>从每张晶状体一侧核弓至另一侧核弓之间的上皮细胞核进行计数。使用标准蓝色滤光片观察所有晶状体上皮细胞核（呈蓝色），使用与二抗发射波长匹配的标准滤光片观察 caspase-3 阳性细胞核（呈绿色）。</li>
		<li>记录所有晶状体上皮细胞核数量及阳性细胞核数量。每张切片重复计数三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文描述了可用于研究UVR-B诱导白内障过程中发生的分子事件的方法。
考虑到，目前可获得的大部分信息 体内 由对白化Sprague-Dawley大鼠进行的实验得出紫外线辐射诱发的白内障 7, 16, 17, 18, 19因此，本研究决定采用白化Sprague-Dawley大鼠，大鼠年龄为6周，性别选择雌性，因为与雄性相比，雌性大鼠的尿液致敏性较低。此外，在UVR诱导白内障的严重程度方面，性别之间无显著差异。 20.
所有动物的饲养和处理均遵循眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明。伦理许可由乌普萨拉动物实验伦理委员会批准，批准号为C 29/10。大鼠购自商业养殖场（Taconic，丹麦）。
选择窄带紫外辐射（UVR）光源是为了使UVR光谱分布明确。大鼠晶状体对UVR-B的最大敏感波长约为300 nm。照射剂量选择为1 kJ/m2，低于阈值剂量15。照射时间设定为15分钟...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注（可选）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ketalar</td><td>Pfizer</td><td>150086</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>022545</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Oculentum Simplex</td><td>Apoteket, Sweden</td><td>336164</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Mydriacyl</td><td>Alcon</td><td>00352</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>平衡盐溶液</td><td>Alcon</td><td>0007950055</td><td></td></tr><tr><td>3.5 µL &amp;beta;-巯基乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II 总RNA提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel GmbH&amp;Co, Duren, Germany</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>p53 DNA 特异性引物</td><td>biomers.net GmbH</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶，dNTPack</td><td>Roche</td><td>04 728 866 001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液 0.5 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>E1385</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop ND-1000 分光光度计</td><td>NanoDrop Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; 链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR，AMV）</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11 483 188 001</td><td></td></tr><tr><td>iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.202</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 - Caspase 3</td><td>Applied Biosystems</td><td>Rn00563902_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 - 18S</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs99999901_s1</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ 软件</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3（Asp175）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab6798</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用显微镜 Axioplan 2 Imaging</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>TBE 缓冲液 10×</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

分子机制的表征 体内 uvr 诱导的白内障

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

白内障是全球致盲的首要原因1。世界卫生组织将白内障定义为眼睛晶状体混浊，阻碍光线传递。白内障是一种多因素疾病，与糖尿病、吸烟、紫外线辐射（UVR）、酒精、电离辐射、类固醇和高血压相关。已有大量实验证据2-4和流行病学证据5,6表明，UVR可导致白内障。我们建立了适用于麻醉7和非麻醉动物8的UVR B诱导白内障动物模型。
目前白内障的唯一治愈方法是手术，但这种治疗并非所有人都能获得。据估计，若能将白内障的发病时间延迟10年，对白内障手术的需求可减少50%9。为了延缓白内障的发生，有必要深入了解白内障形成的机制，并找到有效的预防策略。在白内障发展的诸多机制中，细胞凋亡在人类和动物白内障的起始过程中起着关键作用10。我们近期的研究重点是晶状体中的细胞凋亡作为白内障发展的机制8,11,12。预计对紫外线辐射（UVR）对细胞凋亡通路影响的更深入理解，将有助于发现新的药物以预防白内障。
本文中，我们描述了如何通过实验方法诱导白内障 体内 暴露于UVR-B。进一步介绍RT-PCR和免疫组织化学作为研究UVR-B诱导白内障分子机制的工具。

通过方差分析估算了测量过程中各种变异来源，结果发现，若每只动物进行三次测量，则测量间的方差约为动物间方差的15%。因此，在进行全晶状体分析时，无法进一步提高精度。正交检验揭示了在120小时潜伏期与其他较短潜伏期之间，caspase-3 mRNA水平存在统计学上显著的差异。
体内 紫外辐射暴露可诱导半胱天冬酶-3的表达。
<img alt="大鼠实验示意图：氯胺酮麻醉，托吡卡胺应用，紫外线辐射暴露。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 紫外线辐射暴露流程示意图。
<img alt="casp3 m...

白内障是全球致盲的首要原因。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发生的主要危险因素。目前已建立远紫外B波段（UVR-B）诱导白内障的动物模型。本文介绍白内障形成的研究方法：紫外线辐射暴露、定量RT-PCR和免疫组织化学。

分子机制的表征 体内 UVR 诱导的白内障

白内障是全球致盲的首要原因¹。世界卫生组织将白内障定义为眼球晶状体混浊，这种混浊……

本视频演示了一种在大鼠中使用紫外线辐射诱导白内障的方法。随后通过定量实时 PCR 和免疫细胞化学技术研究白内障发展过程中涉及的分子机制。首先，将大鼠的一只眼睛暴露于紫外线辐射下以诱导白内障形成。另一只眼睛作为对照。接着，解剖晶状体并进行处理以提取RNA，通过定量实时PCR检测Caspase-3的表达水平，或使用抗切割型Caspase-3抗体进行染色，以评估活性蛋白的表达与定位。最终，这些检测的结果证实，晶状体细胞在暴露于紫外线辐射（UVR）后，其细胞核内caspase-3 mRNA水平以及活性蛋白的表达均有所增加。本方案相较于现有方法的主要优势在于，采用了一种独特的窄波段紫外线辐射源以及通用的大鼠固定装置，使我们能够安全、精确地以明确定义的紫外光谱和剂量对动物进行照射。此外，我们应用了现代生物学技术，包括定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学，以研究晶状体中的细胞凋亡过程。该方法可提供有关紫外线辐射诱导白内障分子机制的信息。该方法也可应用于其他实验模型，如紫外线诱导或辐射诱导的皮肤癌、大鼠行为神经科学，以及以细胞凋亡为重点的实验性眼科研究。开始本实验方案时，将一只麻醉后的雌性Sprague Dawley大鼠置于大鼠固定器中，在不挤压躯干的情况下收紧固定带，直至大鼠被完全固定。为诱导瞳孔中度散大或扩大，向每只眼睛滴入1至2滴浓度为10毫克/毫升的tpic aide溶液。然后将药膏涂抹于未暴露的眼睛，并用黑色胶带覆盖以阻隔紫外线。接下来，将动物置于固定装置中，使暴露的眼睛对准高压汞灯产生的波长为300纳米、半高全宽为10纳米的窄束紫外辐射。单侧暴露大鼠于亚阈值剂量的UVRB（1 kJ/m²）照射15分钟，照射后进行后续处理。移除未暴露眼睛的胶带，并在双眼涂抹眼膏。将动物放回笼中，并用软纸覆盖以保持温暖。持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。然后将恢复的大鼠放回笼中与其他大鼠同笼。在暴露后1、5、24和120小时进行观察。将安乐死大鼠去核的眼球角膜朝下、后部朝上放置于柔软的纸巾上。然后在解剖显微镜下操作，使用27号套管针沿巩膜切线方向穿刺一个尽可能小的孔，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。接下来，使用眼科手术剪，在角巩膜缘后方环形剪切，直至能够掀开巩膜后部。然后用钝头弯镊夹起晶状体，将晶状体置于平衡盐溶液中，并清除晶状体上残留的睫状体组织。晶状体在平衡盐溶液中保存时间不应超过10分钟。解剖后，将晶状体放入含有 350 µL RA1 裂解缓冲液（来自 Nucleo Spin RNA II 总 RNA 提取试剂盒）和 3.5 µL β-巯基乙醇的 2 mL 微型离心管中，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，用针头对晶状体进行机械匀浆，直至仅剩硬核部分。晶状体的皮质和囊膜将被裂解缓冲液溶解。从混合物中去除细胞核并弃去。立即将样品储存在负70摄氏度条件下。样品可储存长达一年，待准备就绪后进行后续操作。按照试剂盒中的总RNA从培养细胞和组织中纯化RNA的方案，采集样本并纯化RNA。将RNA样本保存在负70摄氏度条件下。为验证每个样本中的DNA是否充分去除，在以下条件下使用P53 DNA特异性引物扩增DNA。第一步：95 °C 下反应 2 分钟。第二步：进行 40 个循环，95 °C 反应 20 秒，55 °C 反应 20 秒。72 摄氏度，20 秒。步骤 3：72 摄氏度，7 分钟。运行完成后，将产物在 1.5% AROS 琼脂糖凝胶上电泳。为了检测大小为 243 个碱基对的特异性 DNA PCR 产物，务必设置阳性对照和阴性对照样本。如果 DNA 已被成功去除，则不应观察到 PCR 产物。仅在阳性对照泳道中应可见条带，使用 NanoDrop 分光光度计测量 RNA 样品的浓度并确定 RNA 与蛋白质的比值。若RNA样品的吸光度A260/A280比值等于或大于2.0，则表明RNA样品纯度较高。接下来，取1 μg RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA合成，用于后续RT-PCR实验，合成的cDNA样品储存于-20 °C。随后进行定量实时PCR，将样品以每组三个复孔的方式加入96孔板中。每个孔应包含一微升 CD NNA 样品，与 TAC man 基因表达试剂盒混合，使用针对 caspase three 的 TAC man 基因表达检测，在另一块板上进行。使用相同的样品，但采用针对 18 s 的 TAC man 基因表达检测。接下来，为生成用于分析的标准曲线，从三个随机选择的未暴露晶状体中提取一微升 cDNA，进行系列稀释。将样品的cDNA进行系列稀释后一同进行扩增。在96孔板上每块板进行操作。离心收集液体后，使用I cycler my iq单色实时荧光定量PCR检测系统运行反应。运行结束后，使用我的 IQ 软件。根据每块板中系列稀释样本的校准品相对浓度，建立以阈值循环数为函数的标准曲线。利用该标准曲线，根据各样本的阈值循环数确定所测样本 cDNA 的相对浓度。最后，通过将目标 cDNA 的相对浓度与内参 18S cDNA 进行比较，确定目标基因的表达水平。进行免疫组织化学染色时，先解剖眼球，解剖后将其放入 PBS 中。随后将眼球转移至含有 4% 多聚甲醛的离心管中，冰上孵育 20 分钟。使用微量移液器去除多聚甲醛。然后将眼球转移至含有1毫升冰上预冷的PBS的2毫升离心管中，在冰上孵育20分钟。接着，将眼球转移至含有30%蔗糖的离心管中。在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，使用镊子将眼球转移至装有最佳切割温度介质或 OCT 介质的杯中。将眼球置于直立位置以便切片。然后将杯子置于干冰上，冷冻保存于零下70摄氏度，直至使用前用于切片分析。开始操作时，将包埋在OCT中的眼球置于冷冻切片机的卡盘上进行冷冻切片。尽量使眼球晶状体最平坦的一侧与刀刃边缘平行对齐。从每个晶状体中央部位切下三片厚度为五微米的正中矢状切片。连续切片之间至少丢弃六片，以避免在不同切片中染色到相同的细胞核。切下一片切片后，轻轻将一张载玻片覆盖在其上方。切片应紧贴载玻片。将载玻片置于空气中自然干燥后再使用。载玻片可于负70摄氏度保存，直至染色时取出。让载玻片恢复至室温。随后根据随附文件中所述，在数小时内进行抗体染色以鉴定剪切的CAS第三阶段，用荧光显微镜观察载玻片。计数所有晶状体上皮细胞的细胞核。通过计数 DAPI 染色的细胞，记录所有晶状体上皮细胞核的数量；通过计数活化型 caspase 3 阳性的细胞核，记录 caspase 3 阳性细胞核的数量。对每张切片重复计数三次。半胱天冬酶-3是细胞凋亡执行阶段的主要蛋白酶。透射电子显微镜。研究表明，紫外辐射可诱导晶状体发生凋亡。关于细胞凋亡的实验研究证实，caspase-3 是细胞凋亡的一个可靠标志物。为确定体内紫外线辐射（UVR）暴露是否可诱导 caspase-3 的表达，通过定量聚合酶链式反应（QPCR）检测了在体内暴露于 300 纳米波长、剂量为每平方米一千焦耳的 UVR 后 1、5、24 和 120 小时晶状体中 caspase-3 mRNA 的表达水平。随后，针对每个时间点绘制了暴露侧晶状体与对侧未暴露晶状体之间 CASP3 mRNA 与 18S rRNA 的平均比值。该图展示了随时间变化的caspase 3 mRNA表达情况，反映了细胞凋亡的转录过程。在活体晶状体中，经远紫外辐射（far UVR）正交测试暴露后，120小时潜伏期与较短潜伏期相比，caspase 3 mRNA信号呈现出统计学上的显著差异。通过免疫荧光显微镜，还比较了暴露与未暴露晶状体中caspase 3的表达情况；如图所示，在暴露后24小时，细胞核被标记，表明存在活化的caspase 3。该免疫染色方法可提供有关晶状体中被凋亡标志物caspase-3标记的上皮细胞空间分布的宝贵信息。观看本视频后，您应能充分理解如何实验性诱导V-V-U-V-R白内障，以及如何利用定量RT-PCR和免疫组织化学技术研究五种UVR诱导白内障的分子机制。

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医学

表征的分子机制<em在体内</em&gt;紫外线辐射诱发白内障

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了解利用紫外线辐射诱导大鼠白内障的实验方法，通过实时定量PCR和免疫组织化学技术分析晶状体中caspase-3的表达与定位，揭示紫外线诱发白内障的分子机制。该方法为研究白内障发病机理提供了可靠的动物模型。

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