在OVO在鸡胚中脑多巴胺神经元发育中的基因功能研究电穿孔

评估的功能和在发展中脑多巴胺能神经元的基因调控，我们描述了一种方法，涉及

本实验证明在雏鸡中脑的卵电穿孔中研究外源基因表达对中脑发育和多巴胺能神经元分化的影响。首先，将所需的质粒 DNA 注射汉堡 Hamilton 第 11 期雏鸡胚胎的中脑，以特异性地将外源 DNA 靶向发育中的中脑囊泡。然后使用定制的小电极，对中脑囊泡进行电穿孔，以将外源性 DNA 特异性地递送到中脑神经祖细胞中。

接下来，收获在中脑中具有良好的 M cherry 表达的第 23 阶段胚胎，并产生最佳的中脑横切面。最终，多巴胺能神经元标志物（如酪氨酸羟化酶）的免疫染色分析可以显示由目标基因表达诱导的神经祖细胞分化为成熟的多巴胺能神经元。与其他现有的卵内电穿孔方法相比，该技术的主要优点是该方案可以实现膜特异性电穿孔以研究味邂多巴胺能神经元分化。

虽然这种方法可以提供对中脑发育的见解，但它也可以应用于神经系统的其他部分，以进行命运映射分析，以及研究基因表达的调节。为了获得汉堡汉密尔顿，第 11 阶段胚胎，将每个受精卵放在侧面，并用铅笔破折号标记顶部。然后将托盘放在预热加湿培养箱中的摇杆上。

受精后 41 小时每 24 小时检查一次湿度和水位。从培养箱中取出鸡蛋并在室温下储存。用 70% 乙醇清洁每个鸡蛋的表面并擦拭。

现在将两块 4 厘米的透明胶带并排放在鸡蛋上，在铅笔破折号上形成一个大矩形。将胶带滑到鸡蛋上，用连接到 18 号针头的 10 毫升注射器框住窗户。刺穿蛋壳，使针头远离蛋黄，以免干扰或损坏胚胎。

从鸡蛋中提取 5 毫升白蛋白。用 70% 乙醇清洁针头。在刺穿下一个鸡蛋之前擦干针头。

输入火棕色微量移液器拉拔器的设置。然后用 P 10 移液器将薄壁毛细管拉入注射针中。将 5 至 10 微升质粒溶液加入长头毛细管移液器吸头中。

然后将玻璃针缓慢加载到没有气泡的连续柱中。将加载的针头放入连接到微型机械手和微型注射器的持针器中。现在在解剖显微镜下，使用深色背景以更好地观察针头，用弹簧剪刀在绿色液体停止的位置修剪针头。

从前一个针孔切出一个直径为 2 到 2 厘米半的窗口。用于绘制白蛋白。切割时用一只手旋转鸡蛋。

记得在鸡蛋之间用浸有 70% 乙醇的 kim 湿巾清洁剪刀。继续在解剖显微镜下观察雏鸡胚胎 如有必要，通过在雏鸡胚胎下注射 0.22 微米过滤的 20% 印度墨水中的 PBS 来观察胚胎。将胚胎平行于针头路径放置，头部远离针头。

在中脑后脑交界处以 45 度角缓慢刺穿神经管。使用 pico spritzer 微型注射器开始注射 持续时间设置为 25 毫秒。根据针头的修剪调整时间，仅用含有快速绿色染料的质粒 DNA 填充代表中脑的神经囊泡。

取出注射针后，将三滴笔链球菌溶液滴在胚胎上。验证 B-T-X-E-M-C eight 30 电穿孔的设置，以实现高效电穿孔。在腹侧中脑位置，定制的小型 L 形铂电极与神经管底部处于相同的水平水平，使得胚胎中脑位于两个电极之间。

按下 BTX 脚踏开关一次，注意电极周围产生的气泡。每次成功电穿孔后，小心地从鸡蛋中取出电极并擦去电极。用 70% 乙醇覆盖的化学湿巾，在胚胎上再滴三滴笔链球菌溶液。

现在用一条 5 厘米 x 5 厘米的透明包装胶带盖住窗户。在不接触鸡蛋内容物的情况下，将鸡蛋密封好，将鸡蛋放回孵化器中，并关闭转盘。当达到所需的阶段时，将活胚胎收获到针对每种条件的普通 PBS 填充培养皿中。

接下来，荧光解剖显微镜。筛选收获的胚胎的 m cherry 表达，将阳性胚胎转移到 24 孔培养皿的单个孔中。它们每人将用 1 毫升新鲜制备的 2% 对位甲醛浸泡，并在 4 摄氏度下孵育 3 小时。

在 PB S3 中洗涤固定的胚胎，将胚胎置于 15% 蔗糖中，直到它们在平衡时同步。在 30% 蔗糖中重复平衡，然后将每个胚胎正确嵌入 OCT 定向胚胎中以产生最佳中脑。用于后续分析的截面。

准备厚中脑的 18 微米厚的低温恒温器切片，用于在 ovo 电穿孔测定 HH 中胚胎雏鸡中脑的下游分析。第 11 阶段雏鸡胚胎注射 m 樱桃荧光标记物和目标基因的质粒混合物以及注射过程的快速绿色染色跟踪器。中脑电穿孔后，胚胎进一步孵化，收获 m cherry 阳性胚胎，固定和包埋。

然后准备中脑冷冻切片。使用成功注射和电穿孔的雏鸡胚胎中的中脑标志物（如酪氨酸羟化酶）进行免疫染色，对样品进行分析。使用 m cherry 表达作为注射标志物进一步发育后，M cherry 表达通常在中脑区域可见。

然后将表现出适当 m cherry 表达的胚胎固定、包埋并定向以制备中脑冷冻切片。在这里，通过 m cherry 和 flag 标记基因与多巴胺能神经元标志酪氨酸羟化酶的共定位来检查电穿孔神经祖细胞中多巴胺能命运的规范。观看此视频后，您应该对如何在区域上将基因表达限制在胚胎中脑多巴胺能神经元祖细胞有很好的了解，包括如何将 DNA 构建体特异性注射到中脑区域，以及如何使用小型定制电极精确定位电穿孔遵循此程序。

其他方法，例如 RNI 介导的锁定或与报告基因相关的增强子的表达，可以用于研究神经系统特定区域和细胞类型的基因功能和基因调控。