in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

本实验演示了在鸡胚中脑内进行卵内电穿孔，以研究外源基因表达对中脑发育及多巴胺能神经元分化的影响。首先，向汉堡-汉密尔顿分期11期的鸡胚中脑注射所需质粒DNA，从而将外源DNA特异性地靶向至发育中的中脑囊泡。随后使用定制的微型电极，对中脑囊泡进行电穿孔，将外源DNA特异性地导入中脑神经前体细胞中。

接下来，收集在中脑具有良好 M cherry 表达的 23 期胚胎，并制备理想的中脑横切面。最终，通过针对多巴胺能神经元标志物（如酪氨酸羟化酶）的免疫染色分析，可显示由目的基因表达所诱导的神经前体细胞向成熟多巴胺能神经元的分化。该技术相较于其他现有的卵内电穿孔方法的主要优势在于，本方案可实现细胞膜特异性的电穿孔，从而用于研究微小多巴胺能神经元的分化。

尽管该方法可为中脑发育提供研究线索，也可应用于神经系统其他部分，以进行命运图谱分析及基因表达调控的研究。为了获得汉堡-汉密尔顿11期胚胎，将每个受精卵侧向放置，并用铅笔划线标记其顶部。随后将培养盘置于预热的湿润培养箱内的摇床上。

受精后41小时起，每隔24小时检查一次湿度和水位。将鸡蛋从孵化箱中取出，于室温下保存。用70%乙醇清洁每枚鸡蛋的表面，并进行擦拭。

现在将两段各四厘米长的透明胶带并排贴在鸡蛋上，覆盖铅笔标记的虚线，形成一个较大的矩形区域。将胶带平整地贴合在蛋壳表面，然后用一个连接18号针头的10毫升注射器在胶带区域周围划出窗口轮廓。刺穿蛋壳时，针头应倾斜避开蛋黄，以免干扰或损伤胚胎。

从鸡蛋中抽取五毫升蛋清。用70%乙醇清洁针头。在刺入下一个鸡蛋前将针头晾干。

设置火焰棕色微量移液器拉针仪的参数。然后使用 P 10 移液器将薄壁毛细管拉制成注射针。用长尖端毛细移液器吸头吸取 5 至 10 微升质粒溶液。

然后将玻璃针缓慢装入无气泡的连续液柱中。将装好液体的针插入连接在显微操作仪和显微注射仪上的针夹中。现在在解剖显微镜下，使用深色背景以更清楚地观察针尖，用弹簧剪刀在绿色液体末端的位置修剪针尖。

从之前的针孔处切出一个直径为2至2.5厘米的窗口，用于提取白蛋白。切割时用手旋转鸡蛋。

在处理每个鸡蛋之间，记得用浸有70%乙醇的无尘纸清洁剪刀。如有必要，将0.22微米滤膜过滤的20%印度墨水注入PBS中位于鸡胚下方，以观察鸡胚。在解剖显微镜下观察鸡胚时，应使胚胎与针头路径平行，并将头部朝向远离针头的方向放置。

以45度角在中脑与后脑交界处缓慢刺入神经管。使用皮升注射器微注射装置，将注射持续时间设为25毫秒，开始注射。根据针尖状态调整注射时间，仅将含有快绿染料的质粒DNA注入代表中脑的神经囊泡内。

取出注射针后，在胚胎上滴加三滴青霉素-链霉素溶液。检查 B-T-X-E-M-C 八通道 30 型电穿孔仪的设置，以确保电穿孔效率。将定制的小型 L 形铂电极置于腹侧中脑位置，使其与神经管底部处于同一水平面，从而使胚胎中脑位于两个电极之间中央位置。

按一次 BTX 脚踏开关，注意观察电极周围产生的气泡。每次成功电穿孔后，小心地将电极从卵中取出并擦拭电极。用70%乙醇浸湿的擦拭布，再在胚胎上滴加三滴青霉素-链霉素溶液。

现在用一块 5 厘米 × 5 厘米的透明包装胶带覆盖窗口。不要接触卵内容物，将卵密封好后，把卵放回孵化箱中，并关闭转盘。当达到所需发育阶段时，将每种条件下的活体胚胎收集到盛有 PBS 的共用培养皿中。

接下来，使用荧光解剖显微镜。对收集的胚胎进行mCherry表达的筛选，将阳性胚胎转移至24孔板的各个孔中。每孔加入1毫升新配制的2%多聚甲醛，于4°C孵育3小时。

用 PBS 清洗固定后的胚胎 3 次，将胚胎置于 15% 蔗糖溶液中，直至其因平衡而沉降。随后在 30% 蔗糖溶液中重复平衡步骤，然后将每个胚胎包埋于 OCT 包埋剂中，并正确调整胚胎方向，以获得理想的中脑横切面，用于后续分析。

为鸡胚中脑体内电穿孔实验 hh 的后续分析，准备 18 微米厚的中脑冷冻切片。将含有 mCherry 荧光标记物、目的基因以及快绿染料示踪剂的质粒混合物注射至 11 期鸡胚中。中脑电穿孔后，继续孵育胚胎，收集 mCherry 阳性的胚胎，进行固定和包埋。

然后制备中脑冷冻切片。通过使用酪氨酸羟化酶等中脑标志物对成功注射并进行电穿孔的鸡胚进行免疫染色来分析样品。在进一步发育后，以mCherry表达作为注射标记，通常可在中脑区域观察到mCherry的表达。

随后固定表达正常 mCherry 的胚胎，进行包埋和定位，以制备中脑冷冻切片。在此，通过检测 mCherry 与带 Flag 标签的基因和多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶的共定位，来观察电穿孔神经前体细胞中多巴胺能命运的特化情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何将基因表达区域性地限制在胚胎中脑多巴胺能神经元前体细胞中，包括如何将 DNA 构建体特异性地注射至中脑区域，以及如何使用定制的小型电极精确定位电穿孔位置。

其他方法，如通过RNI介导的基因封闭或报告基因偶联的增强子表达，可用于研究神经系统特定区域和细胞类型中的基因功能及基因调控。