准备从大鼠脾细胞T细胞生长因子

大家好，我是 Christine Beaton。我是加州大学尔湾分校生理学和生物物理学系 George Chen 实验室的助理研究员。在接下来的两天里，我将向您展示如何制备 TCGF，它代表 T 细胞生长因子。

因此，对于我们的日常细胞培养，当我们不需要精确了解培养基中细胞因子的组成时，我们使用的是 T 细胞生长因子，它是来自 spl CY 培养物的 S 上清液，含有帮助 T 细胞扩增所需的细胞因子。因此，我们准备 TCGF 的方法是，当我们杀死健康的路易斯大鼠时，我们取出它们的脾脏，准备单细胞悬液，通过它们去除红细胞，然后我们将用 con carnaval 刺激单核细胞，这将诱导 T 细胞产生生长所需的所有细胞因子。为了生成 TCGF，我们需要激活细胞。

因此，我们的做法是将缩集素 conval 缩写为 corona A 添加到我们的细胞培养物中。因此，当我们将 conc 添加到 a 细胞培养物中时，它将与糖基化 T 细胞受体复合物结合，并同时与多个复合物结合，它将执行我们所说的加帽作。所以它会聚集，在细胞表面形成一个集群，这将在 T 淋巴细胞中诱导激活信号。

所以在细胞被激活后，它们会爆炸。所以它们会增大，然后开始分泌细胞因子。所以最初我们认为 TCGF 主要是白细胞介素 2，但现在我们知道事实并非如此。

它还含有非常少量的干扰素 γ TNF α 以及可能还含有非常少量的细胞因子，这些细胞因子对于在 48 小时后保持细胞存活是必需的。在培养中，细胞已经产生了我们需要的所有细胞因子。所以我们要去除细胞，当我们去除细胞，只剩下上清液时，我们在 snat 中仍然有一些游离的圆锥细胞。这将是一个问题，因为我们真的想使用我们的 T 细胞生长因子来保持 T 细胞系的生长。

如果我们把 conval 放在那里，它会在我们不希望它们被激活时激活细胞。因此，为了解决这个问题，我们将添加过量的糖，该糖将与 ate 中的所有游离浓度结合。因此，当我们将 TCGF 添加到培养物中时，它会完全失活，并且不会与细胞上的其他糖基化受体结合。

那么让我们开始吧。本实验的第一步是在安乐死后立即取出大鼠的脾脏。这就是我要立即使用无菌器械执行的作。

一旦我把脾脏取出来，我就把它们放在补充有抗生素的 PBS 中，作为抗生素，我使用青霉素和链霉素。那么让我们开始吧。因此，我用 70% 乙醇喷洒大鼠，以确保我的培养物不会受到任何严重污染。

然后用我的仪器，我要在这里的皮肤上做一个小切口。然后我去除肌肉层，脾脏就在这里出现。所以我拿其他镊子，轻轻地把脾脏拉出来，不要损坏它。

我像这样去除连接的结缔组织。所以现在我有了一个脾脏。当然，我非常小心，不要损坏腹腔内的任何其他东西，因为对肠道的任何损害都会立即导致我的脾脏受到污染。

然后我将我的脾脏转移到含有 PBS 和抗生素的试管中。而这根管子我一直放在冰上。所以现在我已经从三只老鼠身上收获了脾脏。

因此，我们已准备好从这些脾脏中制备单细胞悬液。所以现在我有了脾脏，我把它们带到组织培养室，用 70 微米的细胞训练器从它们中制备单细胞悬液。所以我需要几样东西来从脾脏制作单细胞悬液。

我需要无菌器械、一把镊子和一把剪刀。然后，我在培养皿中放置一个无菌 1 mil 注射器的柱塞。我要把我的脾脏放在 PBS 加抗生素中。

在另一个培养皿中，我将 70 微米细胞过滤器放入 10 毫升 PBS 加抗生素中。所以第一步是确保脾脏干净，因为正如你在这里看到的，还有小块的结膜组织，我要把它们去除，因为它们会很快堵塞细胞过滤器。因此，我只需切下我不想要的东西并将其丢弃到培养皿的盖子中。

所以现在我的脾脏大部分是干净的，所以我要一个一个地取脾脏，把它们放在细胞训练器里，把它们切成小块，然后我把这三个脾脏混合在一起。下一步是制备单细胞悬液。所以当然，既然我想要所有东西都准备好了，我就完全不碰细胞训练器，我用无菌的一密耳注射器的柱塞把我的脾脏压过细胞训练器。

正如您在细胞训练器外部看到的那样，我正在制备一种单细胞悬液。所以第一次我仍然有一些小块的脾脏，但我已经要取出单细胞悬液了。我已经将其转移到一个 50 mil 的管子中，我把它储存在冰上。

我将用 10 密耳的 PBS 和抗生素重新填充我的细胞过滤器。所以我用抗生素再服用 10 密耳的 PBS，不必非常精确地 10 分钟，我们只是在清洗。我把它放在细胞过滤器中，然后我使用相同的程序。

我回到我的注射器柱塞上，我再按压一下 ocid。所以，当然，你永远不可能把所有东西都通过，因为有我无法去除的结膜组织和小块脂肪会留在细胞过滤器中。但是你应该把大部分脾脏用于细胞过滤器。

然后我重复我之前所做的。我将收获我的单细胞悬液并将其添加到同一颗牙齿中。到现在为止，细胞筛选仪中几乎没有留下任何筛网，流出的 PBS 要清晰得多，我将简单地再次洗涤一次，我们现在应该已经将大部分细胞取出。

所以现在我有了 PLE 细胞的单细胞悬液，我打算将它们旋转下来，以便对它们进行调色板。所以旋转 8 到 10 分钟就足够了。所以现在我们已经旋转了我们的 PLE 细胞，我们有一个很好的调色板。

所以我要做的是去除上清液，然后去掉红细胞。所以我要悬浮肌细胞，我要加入氯化铵。所以这是一个 SU，一个 oh 点 15 摩尔氯化铵的溶液，我每个脾脏将使用 5 毫升。

所以，由于我有三个脾脏，我将使用 15 毫升氯化铵，我将在冰上进行。所以，对于红细胞，我将轻轻地上下输送它三分钟。好的，我们将在这里使用这个曝光率更高的镜头。

所以现在我已经分析了三分钟的电细胞。我要用 PBS 装满我的试管，或者您也可以使用培养基。这是为了使溶液的渗透压恢复到细胞的正常范围。

我将像以前一样将细胞旋转 8 到 10 分钟以沉淀它们。然后我将使用相同的 PBS 和抗生素清洗它们两次。所以现在我们在电细胞化后跨越细胞，不用担心我们永远不会得到 100% 的电细胞释放。

所以托盘仍然是红色的，但上清液会更清澈。现在我要清空上清液，打破托盘，加入一些 PBS，最多 50 mil，旋转并再次重复该步骤，以便进行两次洗涤，然后我就可以自己计数了。我已经洗涤了两次肌细胞，然后将它们悬浮在培养基中，并使用您的细胞仪对它们进行了计数。

不出所料。我从三个脾脏中得到了大约 6 亿个细胞，这是意料之中的，因为一个脾通常会给我们 200 到 2.5 亿个细胞。所以我现在要做的是，我将以每磨 200 万个的密度将我的细胞接种到补充有 10% 胎钙血清的培养基中。

我将向该培养基中每磨 2 微克浓度 A 中加入 2 微克以刺激细胞。之后，我只需将细胞放入培养箱中 48 小时即可。细胞现在已经在培养箱中放置了 48 小时，正如我将向您展示的那样，它们生长得非常好。

介质已变为橙色。因此，我们现在已准备好完成 TCGF 的准备工作。您还记得，我在细胞悬液中添加了 con carnaval 以激活细胞。

所以 a 中的骗局是凝集素。它将结合 T 细胞所有受体上的糖，并将人工激活所有这些细胞。我们现在面临的问题是，我们在细胞 S 上清液中仍然有一些 con carnaval。

由于我们将在其他 T 细胞培养物中使用 snat 来扩增细胞，因此我们不希望这些细胞培养物中存在 con carnaval。所以为了摆脱它，我要做的是添加过量的糖，其中 con naval 结合，这就是这里显示的甲基 α D 细胞。我要加入过量的糖，使其完全溶解。

它将把所有剩余的 conc naval 结合在一个完成后，我将对我的细胞上清液进行无菌过滤，并将 Ali 液体冷冻以备在接下来的几周或几个月内使用。那么，让我们开始最后一步。因此，我将细胞培养上清液添加到 50 mil 试管中，以便能够旋转它们以去除细胞。

所以我只是简单地填充尽可能多的试管，我不在培养罩中这样做，我可以，但是由于我最终需要任何方法来过滤我的溶液，因为我添加了糖，这不是无菌的，所以我只是在工作台上做。这更容易。我现在已经把所有的细胞和上清液倒进了我的 50 mil falcon 管中。

所以我要把它们带到离心机中，旋转大约 10 分钟。旋转它们的唯一原因是使细胞沉淀，这样我就会得到澄清的上清液。细胞现在已经跨过，所以上清液很清楚，这就是我想要收集的。

因此，我将把所有上清液收集到一个干净的 150 平方厘米培养瓶中。我要在这个瓶子里加糖。因此，当细胞旋转时，我称量了足够的糖，每毫升上清液中加入 15 毫克。

我要完全让，让它溶解，然后我要无菌过滤我的上清液。所以现在我要在每毫升上清液中加入 15 毫克的糖。我把盖子放回去，因为我不在无菌条件下工作，所以吃的是否进入盖子并不重要，所以我混合直到所有的糖都溶解了。

那应该相当快。是的，现在所有的糖都溶解了。所以我所要做的就是将无菌过滤器变成上清液，然后我要将其分装。

所以通常我会做 10 到 15 mil 的等分试样，并在零下 20 度下储存。像这样的等分试样可以储存几个月。您也可以将 TCGF 存放在冰箱中，但我会在接下来的 10 到 15 天内使用它。

在过去的两天里，我向大家展示了如何制备 T 细胞生长因子，这种上清液制作非常简单，制备成本非常低。因此，我们在实验室中经常使用它来维持培养中的 T 细胞系，而无需购买昂贵的细胞因子鸡尾酒。祝你的实验好运。