Name: 准备从大鼠脾细胞T细胞生长因子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: 学习从大鼠脾细胞制备T细胞生长因子（TCGF）的方法，用于体外扩增抗原特异性T淋巴细胞。该方法通过刀豆蛋白A刺激单核细胞产生细胞因子，为免疫学和细胞生物学研究提供经济可靠的实验方案。

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5 minutes

<ol>
<li>取Lewis大鼠脾脏（160-200 g的大鼠最佳）。在含有PBS加抗生素（PBS-PS）的培养皿中，于冰上使用细胞筛网进行充分剪碎。将组织悬液转移至50 ml离心管中，并用PBS-PS充满离心管。</li>
<li>在4°C下离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
<li>用PBS-PS洗涤细胞两次。</li>
<li>用0.15 M NH4Cl溶液（每只脾脏5 ml）重悬细胞沉淀。在冰上轻轻且持续地用移液器吹打混匀3分钟，以裂解红细胞。然后用培养基充满离心管。</li>
<li>在4°C下离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
<li>用PBS-PS洗涤细胞两次。</li>
<li>计数细胞。每只大鼠脾脏可获得2亿至2.5亿个细胞。</li>
<li>将细胞以每毫升200万个的密度接种于完全培养基中：每75 cm2培养瓶加入50 ml培养基。</li>
<li>在培养箱中培养48小时。</li>
<li>在4°C下离心15分钟，使细胞沉淀。</li>
<li>收集上清液；弃去细胞沉淀。</li>
<li>向上清液中加入15 mg/ml的甲基甘露糖苷，充分混匀。</li>
<li>过滤（0.2 mm）。</li>
<li>分装后于-20°C保存。必要时可在4°C保存10天。</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们使用Lewis大鼠的脾细胞制备T细胞生长因子（TCGF），因为我们会定期处死该品系的未免疫大鼠，以收集血清和胸腺组织，用于体外刺激Lewis大鼠T细胞系。这种TCGF也可用于促进其他品系大鼠T细胞系的生长和存活。TCGF同样可以从其他品系的大鼠中制备。

<table><tbody><tr><td>PBS，1×，无菌</td><td>试剂</td><td>GIBCO，by Life Technologies</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100×</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>取 5 ml 100× 溶液加入 500 ml PBS 中，配制 PBS-PS</td></tr><tr><td>细胞筛，70 µm 孔径</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（NH₄Cl）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0171</td><td>用无菌蒸馏水配制 0.15 M 溶液，保持低温</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>试剂</td><td>GIBCO，by Life Technologies</td><td>21870-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS，FBS）</td><td>试剂</td><td>GIBCO，by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>经热灭活处理</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>PSG</td></tr><tr><td>RPMI 维生素，100×</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠，100×</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸，100×</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>α-甲基甘露糖苷</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6882</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6882</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">配制完全培养基：向 500 ml RPMI 1640 培养基中加入以下成分，过滤除菌：10% FCS；1 瓶 PSG；5 ml RPMI 维生素；5 ml 丙酮酸钠；5 ml 非必需氨基酸；50 µM β-巯基&amp;#8211;乙醇；2 µg/ml 刀豆蛋白 A。</td></tr></tbody></table>

从大鼠脾细胞制备t细胞生长因子

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

在体外培养中维持抗原特异性T细胞系或克隆需要通过多轮抗原诱导的活化，并由细胞扩增阶段间隔开1,2。在扩增阶段向培养基中添加白细胞介素2对于防止细胞死亡是必要的，且足以维持短期T细胞系，但已被证明会增强Th1极化3。使用含有多种细胞因子混合物的T细胞生长因子（TCGF）替代白细胞介素2，在体外维持长期T细胞系方面比白细胞介素2更为有效3。此外，TCGF可在实验室中大量制备，且成本远低于重组白细胞介素2。
本文展示了如何从大鼠脾细胞培养上清液中制备T细胞生长因子（TCGF）。该实验中，我们取因采集胸腺和血液而被实施安乐死的未经处理的Lewis大鼠的脾脏。将脾脏制备成单细胞悬液，通过渗透压休克法裂解红细胞，然后将脾细胞接种于培养基中。使用刀豆蛋白A（concanavalin A）刺激细胞，这是一种有丝分裂原，可非选择性地激活所有大鼠T淋巴细胞，从而诱导细胞因子的产生。48小时后收集培养上清液，并加入α-甲基甘露糖苷以结合过量的刀豆蛋白A，防止其在后续应用中激活将要添加TCGF的T细胞系。随后，将TCGF进行无菌过滤，分装后于-20°C保存。

我们描述了用于体外扩增抗原特异性大鼠T淋巴细胞系的T细胞生长因子的制备方法。

从大鼠脾细胞制备T细胞生长因子

抗原特异性T细胞系或克隆在培养中的维持需要通过多轮抗原诱导的活化，并由细胞扩增阶段间隔分开1,2。

大家好，我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的两天里，我将向大家演示如何制备TCGF，即T细胞生长因子。因此，在日常的细胞培养中，当我们不需要精确了解培养基中细胞因子的具体成分时，我们会使用T细胞生长因子（T-cell growth factor，TCGF），即来自脾细胞（splenocyte, spl CY）培养的S上清液，其中含有促进T细胞扩增所需的各类细胞因子。制备TCGF的方法是：处死健康的Lewis大鼠后，取出其脾脏，制备单细胞悬液，通过裂解法去除红细胞，然后用刀豆蛋白A（concanavalin A）刺激单个核细胞，从而诱导T细胞分泌其生长所需的所有细胞因子。为了生成TCGF，我们需要激活这些细胞。因此，我们的操作方法是将凝集素刀豆蛋白A（concanavalin A，缩写为ConA）加入细胞培养物中。当我们将ConA加入细胞培养物时，它会结合到糖基化的T细胞受体复合物上，并同时结合多个复合物，从而引发我们称之为“成帽”（capping）的现象。这一过程将导致细胞表面的所有受体聚集在一起，形成受体簇，进而诱导T淋巴细胞产生激活信号。因此，当细胞被激活后，它们将发生母细胞化，即细胞体积增大，随后开始分泌细胞因子。最初我们认为T细胞生长因子（TCGF）主要是白细胞介素-2，但现在我们已知事实并非如此。其中还含有极少量的干扰素γ、TNFα以及可能存在的其他细胞因子，这些成分仅足以维持细胞在培养48小时后的存活。在培养过程中，细胞已产生我们所需的所有细胞因子。因此，接下来我们将去除细胞，当细胞被完全移除后，仅保留上清液，此时上清液中仍残留少量游离的刀豆蛋白A（concanavalin A），这会带来问题，因为我们希望利用T细胞生长因子来维持T细胞系的持续生长。如果我们让伴刀豆球蛋白A（conval）在体系中游离存在，它会在我们不希望的时候激活细胞。为了解决这一问题，我们将加入过量的糖分子，使其与体系中所有游离的伴刀豆球蛋白A结合。这样，伴刀豆球蛋白A将被完全抑制，无法在我们向培养体系中添加TCGF时与细胞上的其他糖基化受体结合。那么，我们开始吧。本实验的第一步是在大鼠安乐死后立即取出脾脏。接下来，我将使用无菌器械立即进行此操作。取出脾脏后，我将把它们放入添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中，所用的抗生素为青霉素和链霉素。现在我们开始操作。首先，我用70%乙醇喷洒大鼠，以确保我的培养物不会受到任何污染。然后使用我的器械，在此处皮肤上做一个小切口。接着，我移除一层肌肉，脾脏便暴露在此处。因此，我取用另一把镊子，轻柔地将脾脏拉出，避免造成损伤。我像这样去除结缔组织。现在我得到了脾脏。当然，我非常小心，避免损伤腹腔内的其他任何组织，因为肠道一旦受损，将立即导致脾脏受到污染。然后，我将脾脏转移至含有 PBS 加抗生素的离心管中，并将该离心管置于冰上保存。至此，我已从三只大鼠中采集了脾脏组织。现在我们可以开始从这些脾脏中制备单细胞悬液了。我已经取到了脾脏，并将其转移至组织培养超净台中，准备使用70微米细胞滤网制备单细胞悬液。因此，我需要准备几样物品来完成脾脏单细胞悬液的制备。我需要无菌的器械，包括一对手术镊和一把手术剪。然后将一支无菌的一毫升注射器的推杆放入培养皿中。我将把脾脏放入含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中。在另一个培养皿中，我放置了70微米的细胞筛网，并加入10毫升含抗生素的PBS。第一步是确保脾脏组织干净，因为如您所见，这里仍残留少量结缔组织，我将去除这些组织，因为它们会很快堵塞细胞筛网。为此，我只需将不需要的部分剪掉，并丢弃到培养皿的皿盖中。现在我的脾脏组织已基本清理干净，接下来我将逐一取出脾脏，放入细胞筛中，将其剪成小块，并将三个脾脏的组织混合在一起。下一步是制备单细胞悬液。当然，为了确保无菌操作，我完全不触碰细胞筛，而是使用一支无菌1毫升注射器的推杆，将脾脏组织块通过细胞筛压滤。如您在细胞分离器外部所见，我正在制备单细胞悬液。第一次研磨后，脾脏仍存在一些小块组织，但此时我已经开始收集单细胞悬液，并将其转移至一个预先置于冰上的50 mL离心管中。我将用另外10毫升含抗生素的PBS重新填充我的细胞滤筛。因此，我大约再取10毫升含抗生素的PBS，无需非常精确，因为我们只是进行洗涤操作。将其加入细胞滤筛中，然后采用相同的步骤进行处理。我回到注射器活塞处，继续稍微用力将组织通过滤网。当然，你不可能将所有组织都完全压过，因为结缔组织和一些我未能去除的小块脂肪会残留在细胞滤筛中。但你应该能将脾脏的大部分组织转移到细胞滤筛中。然后我完全重复之前的操作步骤：收集我的单细胞悬液，并将其加入同一个牙齿中。此时，细胞筛中几乎已没有残留的筛上物，流出的 PBS 也变得清澈许多。我将再简单冲洗一次，此时应该已将大部分细胞洗出。现在我已获得PLE细胞的单细胞悬液，接下来将对其进行离心，以便形成沉淀。离心8到10分钟即可。现在我们已经完成了PLE细胞的离心，得到了一个良好的沉淀。接下来，我将去除上清液，然后裂解红细胞。因此，我将把细胞沉淀重悬于氯化铵溶液中。该溶液为0.15摩尔的氯化铵溶液，每只脾脏使用5毫升。由于我有三个脾脏，我将使用15毫升氯化铵，并在冰上进行操作。为了裂解红细胞，我将轻轻吹打混匀3分钟。好的，我们将使用此处曝光度更高的图像。现在我已经分析了电细胞三分钟。接下来，我将用 PBS 填满我的离心管，或者你也可以使用培养基。这样可使溶液的渗透压恢复到细胞的正常范围。接下来，我将像之前一样以8到10分钟的时间离心细胞，使其沉淀。然后使用含有抗生素的相同PBS缓冲液洗涤细胞两次。现在，在电细胞解离后，我们已将细胞离心沉淀。请不必担心，电细胞的释放率从来不会达到百分之百。因此，沉淀物仍呈红色，但上清液会更澄清。现在我将弃去上清液，重悬沉淀，加入PBS至50毫升，离心后重复该步骤一次，共洗涤两次。然后我就可以进行细胞计数了。我已经将心肌细胞洗涤了两次，随后将其重悬于培养基中，并使用细胞计数仪完成了计数。结果符合预期。从三个脾脏中我获得了大约6亿个细胞，这是预料之中的，因为一个脾脏通常可提供2亿至2.5亿个细胞。接下来，我将把细胞接种到培养基中，接种密度为每毫升200万个细胞，培养基中已添加10%胎牛血清。接下来，我将向该培养基中加入每毫升含2 µg的刀豆球蛋白A（concanavalin A），以刺激细胞。随后，我只需将细胞放入培养箱中培养48小时。目前细胞已在培养箱中培养了48小时，正如我将展示的，它们生长状况良好。培养基已变为橙色。因此，我们现在可以完成TCGF的制备。如您所知，我已在细胞悬液中加入了ConA，以激活细胞。因此，刀豆蛋白A（concanavalin A）是一种凝集素，它将结合T细胞上所有受体的糖分子，并人为地激活所有这些细胞。我们现在面临的问题是，细胞上清液中仍残留有一些刀豆蛋白A。由于我们将在其他T细胞培养中使用snat来扩增细胞，因此我们不希望在这些细胞培养中存在con carnaval in a。为了去除它，我将添加过量的、能够与con naval in a结合的糖，即此处所示的甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷（methyl alpha D cyte）。我将加入过量的这种糖，并使其完全溶解。它将结合所有剩余的浓缩氯化钠溶液。完成这一步后，我将对细胞上清液进行无菌过滤，并将等分试样冷冻保存，以备未来几周或数月内使用。现在我们开始最后一步操作。我将细胞培养上清液加入50 mL离心管中，以便离心去除细胞。因此，我只需根据需要填充尽可能多的离心管，且我不在超净工作台内进行此操作，尽管我可以这样做。但由于最终我需要将溶液过滤，因为所添加的糖并非无菌，因此我直接在实验台上操作，这样更简便。现在，我已将所有细胞和上清液倒入50 mL离心管中。接下来，我将把它们放入离心机，离心约10分钟。离心的唯一目的是使细胞沉淀成团，从而获得澄清的上清液。细胞现已完全沉淀，上清液变得澄清，这正是我需要收集的部分。现在，我将把所有上清液收集到一个干净的150平方厘米的烧瓶中。然后，我将向该烧瓶中加入糖。在细胞离心的过程中，我已称取了足够的糖，使其添加量为每毫升上清液15毫克。我将完全静置，让其彻底溶解，之后对上清液进行无菌过滤。现在，我要向上清液中加入糖，每毫升上清液加入15毫克。重新盖上瓶盖，由于我并未在无菌条件下操作，因此少量液体进入瓶盖也无影响，混匀直至所有糖完全溶解。这应该相当快。是的，现在所有的糖都已溶解。接下来我只需对上清液进行无菌过滤，然后进行分装即可。通常我会分装成 10 到 15 毫升的等分试样，保存在 -20 摄氏度。这样的等分试样可保存数月。你也可以将 TCGF 储存在冰箱中，但此时应在接下来的 10 到 15 天内使用完毕。在过去两天里，我向您展示了如何制备T细胞生长因子，这种上清液制备方法非常简单，且成本低廉。因此，我们在实验室中经常使用它来维持T细胞系的培养，而无需购买昂贵的细胞因子混合物。祝您的实验顺利。

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