Name: La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Aprende a preparar Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata mediante estimulación con concanavalina A. Este método permite expandir linfocitos T específicos de antígeno para estudios inmunológicos.

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<ol><li> Tome el bazo de ratas Lewis (ratas entre 160-200g son los mejores). Dilacerate sobre el hielo en un plato de Petri que contiene PBS + antibióticos (PBS-PS) con un filtro de la célula. Poner en un tubo de 50 ml. Rellenar con PBS-PS. </li><li> Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células. </li><li> Lavar las células dos veces. </li><li> Resuspender el precipitado en NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por bazo). Mezclar suavemente y de forma continua con una pipeta de 3 minutos sobre el hielo para lisar los eritrocitos. Llenar el tubo con el medio. </li><li> Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células. </li><li> Lavar las células dos veces. </li><li> Contar las células. Un bazo de ratas da 200-250 million células. </li><li> Sembrar las células en 2 millones por ml en medio completo: 50 ml por cada 75 cm2. </li><li> Se dejó crecer durante 48 horas en la incubadora. </li><li> Giro 15 min a 4 ° C para precipitar las células. </li><li> Recoger el sobrenadante; deshacen de las células. </li><li> Añadir 15 mg / ml a mannoside de metilo para el sobrenadante. Mezclar bien. </li><li> Filtro (0,2 mm) </li><li> Alícuota y almacenar a -20 ° C. Puede mantenerse a 4 ° C durante 10 días si es necesario. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Preparamos TCGF a partir de esplenocitos de ratas Lewis ya que regularmente la eutanasia a las ratas ingenuo de esta cepa de la cosecha de suero y thymi para estimular Lewis rata líneas de células T in vitro. Este TCGF se puede utilizar para promover el crecimiento y la supervivencia de las líneas de células T a partir de cepas de ratas otros. TCGF también puede ser preparado a partir de otras cepas de ratas.

Para preparar el medio de cultivo completo agregar lo siguiente a una botella de 500 ml de RPMI 1640 y estéril filtro: FCS al 10%, una botella de PSG, 5 ml de RPMI vitaminas, 5 ml de piruvato de sodio, 5 ml no aminoácidos esenciales; 50 uM beta-mercaptoetanol, 2 ug / ml Concanavalina A.

la preparación de factor de crecimiento celular t a partir de esplenocitos de rata

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Mantenimiento de antígeno específico de líneas de células T o clones de la cultura requiere rondas de antígeno de la activación inducida por separado por las fases de expansión celular 1,2. Además de la interleucina 2 a los medios de cultivo durante la fase de expansión es necesaria para prevenir la muerte celular y suficiente para mantener a corto plazo líneas de células T, pero se ha demostrado que aumenta la polarización Th1 3. Sustitución de la interleucina 2 por el factor de crecimiento de las células T (TCGF), que contiene una mezcla de citoquinas es más eficaz que la interleucina 2 en el mantenimiento a largo plazo las líneas de células T in vitro 3. Por otra parte, TCGF se pueden preparar fácilmente en grandes cantidades en el laboratorio y es mucho más barato que la interleucina 2 recombinante. Aquí, se muestra cómo preparar TCGF a partir de sobrenadantes de esplenocitos de ratas cultura. Para este procedimiento, se cosecha el bazo de ratas Lewis ingenuo sacrificados por el timo y la extracción de sangre. Preparamos una sola célula suspensiones de los bazos, Lyze los glóbulos rojos por choque osmótico, y las semillas de los esplenocitos en medio de cultivo. Las células son estimuladas con concanavalina A, un mitógeno que no activa selectivamente los linfocitos T de rata, que induce la producción de citoquinas. El sobrenadante se recoge la cultura 48 horas más tarde andexcess concanavalina A se une a la alfa metil mannoside para evitar la activación de líneas de células T a la que se añadirá TCGF. El TCGF entonces esterilizada por filtración, alícuotas, y almacenadas a -20 ° C.

Se describe la preparación del factor de crecimiento de las células T utilizados para la expansión in vitro de antígenos específicos de las líneas de linfocitos T de rata.

La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

El mantenimiento de líneas celulares o clones de linfocitos T antígeno-específicos en cultivo requiere ciclos de activación inducida por antígenos separados por fases de expansión celular 1,2. ...

Hola, soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y en los próximos dos días les mostraré cómo preparar el TCGF, que significa factor de crecimiento de linfocitos T.Por lo tanto, para nuestro cultivo celular de rutina, cuando no necesitamos un conocimiento preciso de la composición de las citocinas en el medio de cultivo, utilizamos el factor de crecimiento de células T, que es un sobrenadante S proveniente de un cultivo de bazo de ratas Lewis que contiene las citocinas necesarias para ayudar a la expansión de las células T. Así, la forma en que preparamos el FCT es: cuando sacrificamos ratas Lewis sanas, extraemos sus bázos, preparamos una suspensión de células individuales, eliminamos los glóbulos rojos mediante lisis y luego estimulamos las células mononucleares con concanavalina A, lo que inducirá a las células T a producir todas las citocinas necesarias para su crecimiento. Para generar el FCT, necesitamos activar las células.Entonces, la forma en que lo hacemos es agregar lectina convalina, abreviada como conA, a nuestro cultivo celular. Cuando agregam

preparing-t-cell-growth-factor-from-rat-splenocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Expansión ex vivo de células T tumor-reactiva por medio de la 1/Ionomycin briostatina y la formulación de la cadena gamma común de citoquinas

Este vídeo muestra el cribado de compuestos inmunomoduladores mediante un ensayo basado en fluorescencia. Los linfocitos T transgénicos derivados de ratones con casetes de expresión de proteínas fluorescentes verdes se tratan con estos compuestos. Las señales de GFP aumentadas y reducidas permiten identificar los efectos estimulantes e inhibidores de los compuestos, respectivamente.

Ensayo basado en fluorescencia que utiliza linfocitos modificados genéticamente para el cribado de compuestos inmunomoduladores

El video muestra un ensayo basado en citometría de flujo para analizar la inmunodominancia en linfocitos T citotóxicos o respuestas CTL. Las células diana fluorescentes inyectadas exhiben una fluorescencia variable correspondiente a epítopos inmunogénicos. La recolección y clasificación posterior al bazo revela una reducción de las células fluorescentes de alta intensidad, lo que confirma la inmunodominancia en las respuestas a CTL.

Ensayo para evaluar la inmunodominancia en las respuestas citotóxicas de los linfocitos T

Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

Una técnica ex vivo para generar células T receptoras de antígenos quiméricos específicos de tumores

Este video muestra una técnica para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno a través de la transducción retroviral. Los linfocitos T CD8+ murinos activados se añaden a una placa de micropocillos recubierta con fragmentos de fibronectina recombinante. A continuación, se introducen vectores retrovirales que contienen ARN transgénico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico del antígeno, y se centrifuga la placa para facilitar la...

Una técnica para la generación de células CAR-T específicas de antígenos

Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Aquí, presentamos un protocolo para distinguir murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) linfocitos de células T CD4 + de ingenuo, incluyendo el aislamiento de las células CD4 + T de ingenuo, diferenciación de THGM, y Análisis de las células THGM diferenciadas. Este método puede ser aplicado a los estudios de la regulación y función de las células THGM.

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM)

Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .

Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

MALT1 regula la inmunidad innata pero cómo esto ocurre sigue siendo mal definida. Utilizamos el inhibidor selectivo de la paracaspase del MALT1 MLT-827 a desentrañar la contribución de MALT1 al innato señalización corriente abajo de los receptores de lectina-como Toll-like o tipo C, demostrando que MALT1 regula la producción de citocinas mieloide y aguas abajo de los receptores de lectina-como de tipo C, selectivamente.

Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Presentamos protocolos mejorados para la transducción retroviral de receptores de tráfico y el homing competitivo para estudiar el posicionamiento de linfocitos específicos de órganos y microambientes mediados por receptores. Este método ofrece información valiosa sobre los mecanismos de tráfico de células inmunitarias y tiene aplicaciones potenciales en futuras investigaciones básicas y terapéuticas.

Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Aprende a preparar Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata mediante estimulación con concanavalina A. Este método permite expandir linfocitos T específicos de antígeno para estudios inmunológicos.

La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

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