建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

本实验的总体目标是获得一种均质化的永生化脑微血管内皮细胞培养物。首先从新生小鼠中分离脑组织并制备单细胞悬液，以此实现该目标。第二步是利用多瘤病毒中T抗原对细胞进行永生化处理。

接下来，细胞培养约四周，直至形成均一的内皮单层。最后一步是利用免疫染色、蛋白质印迹和定量-定量-聚合酶链式反应（Q-Q-P-C-R）等技术对新细胞系进行表征。该技术的应用意义在于为神经炎症性或缺血性脑部疾病的治疗提供了可能，因为可借此获得临床前治疗评估以及病理生理学方面的深入认识。

演示该操作的是来自我实验室的博士后Elaine Salvador博士。在超净工作台中操作，将3至5日龄新生小鼠的脑组织取出并转移至含有缓冲液A的培养皿中，每次制备需要5至10只小鼠的脑组织。从每只脑组织中去除小脑、脑干、脑膜以及毛细血管碎片。

然后将脑组织转移至含有缓冲液A的第二个培养皿中。使用无菌手术刀将脑组织切成小块，再用10毫升移液器反复吸取和排出组织与缓冲液，直至无明显团块存在。此时，将悬液转移至50毫升离心管中，在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物溶于4.5毫升缓冲液A和1.5毫升0.75%（质量/体积）的溶液中。

用胶原酶处理组织。将组织与胶原酶溶液置于37°C水浴中孵育45分钟，期间偶尔振荡。同时，通过将四个孔的12孔板用每毫升0.1毫克的无菌溶液包被，来准备组织培养板。

胶原蛋白四和50毫摩尔乙酸可在室温下使胶原蛋白在一小时内黏附于孔板。45分钟孵育期结束后，加入15毫升缓冲液A以终止脑组织的消化，并在此溶液中充分重悬沉淀。然后以250 × g离心10分钟，并弃去上清液。

接下来，为了从制备物中去除髓鞘，向组织中加入10毫升无菌的、25%（重量/体积）的BSA和PBS，然后在4°C下以1000 × g离心20分钟。离心后，小心弃去上清液，将沉淀物溶解于15毫升缓冲液A中，转移至新的50毫升离心管中，再在室温下以250 × g离心5分钟。同时，用PBS将胶原IV包被的培养板洗涤两次。

第二次洗涤后，保留两个孔为空，向另外两个孔中各加入2毫升培养基。弃去上清液后，将主要由内皮细胞组成的细胞沉淀重悬于4毫升含有4微克/毫升嘌呤霉素的培养基中，并将2毫升细胞悬液接种至两个空的胶原包被孔中，在37°C孵育45分钟，以清除快速贴壁的非内皮细胞。接着，吸出不含细胞的两个孔中的培养基并弃去。

然后将含有非贴壁细胞的培养基（包括内皮细胞组分）转移至这两个孔中。向之前的孔中补充两毫升新鲜培养基。这些孔中含有成纤维细胞和星形胶质细胞等其他细胞类型，可平行培养并用于形态学比较。

次日，在组织培养孵育箱中将细胞孵育过夜。更换新鲜培养基，培养GPE neo成纤维细胞，该细胞在明胶包被的培养瓶中分泌含有多瘤病毒中T癌基因的复制缺陷型病毒。GPE neo多瘤病毒中T癌基因转染可使内皮细胞相对于非内皮细胞具有生长优势，从而形成具有内皮细胞形态的均一单层细胞。培养4至6周后，GPE neo细胞无法商业获取，可通过共享公共材料获得。

在 GPE Neo Fiberblast 培养 24 小时后，移除 10 毫升培养基，并加入无菌的 poly brain 溶液，使其终浓度为 8 微克/毫升。将上清液混合物通过 0.45 微米滤器过滤，以去除任何细胞碎片。随后吸除内皮细胞培养物中的培养基，在过夜孵育后，向各孔中加入 2 毫升上清液 poly brain 混合物。

次日用新鲜的上清液多脑混合物重复此步骤。去除上清液多脑混合物。用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入新鲜培养基。

当细胞在胶原包被的培养皿中生长至汇合时，继续每三天更换一次培养基，并以1:2的比例进行传代。通常在连续培养四到五周后可获得稳定的大脑微血管内皮细胞系。

当均一的内皮单层细胞完全铺满整个孔时。一旦获得稳定细胞系，将细胞转移至经IV型胶原包被的组织培养瓶中，使用3毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度孵育5至15分钟，直至细胞层分散，每周传代不超过一次。加入5毫升培养基后接种至新的培养瓶，避免传代比例高于1:4。

当细胞数量足够获得一个汇合的 T75 培养瓶时，可制备细胞冻存管以供后续使用。操作步骤如下：用胰蛋白酶消化收获细胞（方法同前），然后将细胞悬液在 250 × g 条件下离心 5 分钟。在室温下，将细胞沉淀重悬于 6 毫升冻存液中，再用移液器将 1.5 毫升细胞悬液分装至 4 个冻存管中。

将冻存管放入装有异丙醇的Nalgene冻存盒中，在负80摄氏度条件下保存一天。最后，将冻存管置于液氮中长期保存。将细胞冻存管在水浴中融化，然后转移至含有10毫升培养基的15毫升离心管中。

将培养基预热至37摄氏度，并在室温下以250 × g离心5分钟。吸除培养基后，用适量生长培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至含有预热生长培养基的胶原蛋白IV包被的T25细胞培养瓶中。

铺板时的细胞密度应至少为每毫升1×10⁴个细胞。次日更换培养基，并在细胞约五天后达到汇合时按照之前的方法继续传代，待细胞准备好后以后续实验所需的密度进行铺板。C端细胞通过内皮细胞及血脑屏障标志物的免疫染色进行表征。

此图像显示了C细胞和免疫染色标记clain五的细胞形态。C细胞的形态与脑ECS原代培养细胞相似，呈紧密排列的单层细长细胞，表现出生长抑制现象。在接近汇合时，这些细胞表达了可检测水平的clain。

此处的C CN细胞已使用occludin抗体进行免疫染色。我们在此处观察到VE-cadherin蛋白的表达，这些蛋白定位于细胞-细胞连接处，同样通过免疫荧光染色显示。跨内皮电阻使用包含电流通过电极和电压测量电极的装置进行测定。

从该图可以看出，Cend细胞的跨内皮电阻力在培养后随时间的延长而增加。该技术为神经科学领域的研究人员利用小鼠模型探索脑血管疾病铺平了道路。