Name: 代的永生化小鼠脑微血管内皮细胞株作为 em在体外 /em血脑屏障型号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解永生化小鼠脑微血管内皮细胞株的分离与培养方法，用于建立体外血脑屏障模型。该技术通过多瘤病毒中T抗原实现细胞永生化，为神经炎症和缺血性脑疾病研究提供标准化实验工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG）资助，资助编号为 FO 315/4-1 和 DFG SFB 688。

1. 脑微血管的分离
<ol>
 <li>每次制备使用五至十只任一性别的新生小鼠（3-5日龄）。</li>
 <li>根据当地IACUC/兽医建议对小鼠实施安乐死，立即取出脑组织，并转移至含有以下溶液的培养皿中：15 mM Hepes（pH 7.4）、153 mM NaCl、5.6 mM KCl、2.3 mM CaCl2x 2H2O、2.6 mM MgCl2x 6H2O、1% (w/v) BSA（以下简称缓冲液A）。</li>
 <li>除非另有说明，所有分离操作均应在室温（RT）（22-24 °C）下于超净工作台内进行。用无菌手术刀在缓冲液A中将脑组织（去除小脑和脑干的大脑部分）切碎，同时去除脑膜和毛细血管碎片。用10 ml移液器反复吹打组织碎片，直至无明显团块。将悬液转移至50 ml Falcon管中，在室温下以250 x g离心5分钟。</li>
</ol>
注意：脑膜可被识别为脑组织表面的薄而透明的膜。可用无菌镊子小心去除。
<ol start="4">
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>将沉淀物溶于 4.5 ml 缓冲液 A 中，并加入 1.5 ml 0.75% (w/v) 胶原酶/分散酶（Roche），在 37 °C 水浴中孵育 45 分钟（期间偶尔振荡）。</li>
 <li>同时，通过在四个孔中包被 IV 型胶原蛋白（0.1 mg/ml 溶于 50 mM 乙酸）来准备 12 孔板。室温孵育 1 小时使其贴壁。</li>
 <li>加入 15 ml 冰冷的缓冲液 A 终止消化反应，并充分重悬沉淀物。</li>
 <li>在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>为去除髓鞘，加入 10 ml 25% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA，Sigma，纯度 &gt; 98%），并在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 20 分钟。25% BSA 应溶于 1× PBS（PAA Laboratories）中，并通过 0.2 μm 滤膜过滤。</li>
 <li>小心弃去上清液，将沉淀物溶于 10 ml 缓冲液 A 中，并转移至新的 Falcon 管中。</li>
 <li>在室温下以 250 × g 离心 5 分钟。所得沉淀物含有内皮细胞。</li>
 <li>用 PBS 清洗 IV 型胶原蛋白包被的 12 孔板两次。</li>
 <li>将沉淀物重悬于 4 ml 生长培养基中（DMEM 含 10% 胎牛血清、50 U/ml 青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺），并将细胞悬液接种至两个孔中，每孔 2 ml。加入嘌呤霉素至终浓度为 4 μg/ml，并在 37 °C 细胞培养箱中孵育 45 分钟。此步骤可去除快速贴壁的细胞。注意：嘌呤霉素持续作用 24 小时。只有脑内皮细胞（ECs）能够代谢该药物，对其他类型的细胞而言，嘌呤霉素具有毒性14。</li>
 <li>将步骤 1.14 中含有未贴壁细胞的 2 ml 培养基转移至两个新的孔中（这些孔含有内皮细胞组分）。向步骤 1.14 中已贴壁细胞的孔中补充 2 ml 新鲜培养基（这些孔含有其他细胞类型，例如 成纤维细胞、星形胶质细胞，可平行培养并用于形态学比较）。</li>
 <li>次日更换培养基。</li>
</ol>
2. 永生化脑微血管内皮细胞
<ol>
 <li>在明胶包被的培养瓶中，使用含10%热灭活胎牛血清（FCS）、50 U/ml青霉素/链霉素和2 mg/ml G418（PAA Laboratories）的DMEM培养基培养分泌携带多瘤病毒中T癌基因的复制缺陷型病毒的GP + E-86 Neo（GPENeo）15成纤维细胞。注意：多瘤病毒中T癌基因转染可使内皮细胞（ECs）相对于非内皮细胞具有生长优势，从而在培养4至6周后形成具有内皮细胞形态的均一单层。GPENeo细胞未商业化供应，可作为共享公共材料获取（详见原始文献4,16）。</li>
 <li>为用于永生化目的的含病毒培养基，将GPENeo细胞在不含G418的培养基中培养24小时。</li>
 <li>收集10 ml GPENeo上清液，加入Polybrene（聚凝胺，即己二甲溴铵）（Sigma），使其终浓度为8 μg/ml，并通过0.45 μm滤器过滤除菌，以去除细胞碎片。</li>
 <li>移除第1部分中准备的内皮细胞培养物的生长培养基，每孔加入2 ml GPENeo上清液与Polybrene的混合物。次日重复一次，使用新鲜配制的GPENeo上清液/Polybrene混合物。注意：Polybrene用于在细胞膜上形成孔道，以促进病毒颗粒的感染。</li>
 <li>次日移除GPENeo上清液/Polybrene混合物，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞维持在生长培养基中，每3天更换一次培养基。当细胞达到汇合时，以1:2比例传代至IV型胶原包被的培养板上。</li>
 <li>通常在4至5周后可获得稳定的脑微血管内皮（cEND）细胞系。</li>
</ol>
3. 培养脑微血管内皮细胞
<ol>
 <li>从冻存管中取出细胞，在水浴中解冻后转移至15 ml离心管中，加入10 ml预热的培养基。</li>
 <li>在室温下以250 × g离心5分钟。</li>
 <li>吸除培养基，将细胞沉淀转移至预先用IV型胶原蛋白包被的T25 cm2 细胞培养瓶中，并加入预热的生长培养基（接种细胞密度应至少为1×104个细胞/ml）。</li>
 <li>次日更换培养基，待细胞达到汇合状态后（通常在5天后）进行传代。</li>
</ol>
4. cEND细胞的传代（注意：每周仅传代一次，传代比例不应高于1:4）。
<ol>
 <li>移除培养基，用 PBS 洗涤细胞。</li>
 <li>加入 3 ml 温热的胰蛋白酶-EDTA 溶液（PAA Laboratories）（用于 T75 cm2 培养瓶），于 37 °C 培养，直至细胞层完全分散（通常在 5 至 15 分钟内）。</li>
 <li>加入 5 ml 生长培养基，反复吹打混匀，转移至新的经 IV 型胶原蛋白包被的培养瓶中。</li>
</ol>
5. cEND 细胞的冻存
<ol>
 <li>按照步骤4所述方法获得细胞悬液</li>
 <li>在室温下以250 × g离心5分钟。</li>
 <li>将细胞沉淀（来自1个T75 cm2培养瓶）重悬于6 ml冻存液（95%生长培养基，5% DMSO）中。</li>
 <li>将细胞悬液分装为四份，每份1.5 ml，置于冻存管中。注意：一份冻存液可接种于T25 cm2培养瓶中。</li>
 <li>将冻存管置于液氮蒸气相温度中保存。</li>
</ol>
cEND生长培养基：450 ml DMEM，10% FCS，10 ml L-谷氨酰胺，2% MEM-Kit，2% NEAA，10 ml 丙酮酸钠，50 U/ml 青霉素/链霉素
6. 代表性结果
通过内皮细胞和血脑屏障（BBB）标志物的免疫染色，以及跨内皮电阻（TEER）和通透性的测定，对cEND和cerebEND细胞进行了表征。cEND和cerebEND细胞的形态与脑内皮细胞（ECs）的原代培养物相似，表现为紧密排列的长梭形细胞单层，在汇合时表现出生长抑制现象。免疫荧光结果显示，这些细胞在细胞间连接处表达可清晰检测水平的claudin-5、occludin和VE-cadherin蛋白（图3）4,5。将cEND细胞在血清减量培养基中培养可提高TEER值（从含10%血清时的150 Ωcm2升高至含2%血清时的500 Ωcm2），而加入氢化可的松后TEER进一步增强至800 Ωcm2，或加入胰岛素后达到1,000 Ωcm2）4。cEND细胞在血清减量培养基中培养21天后，其单层TEER值可达900 Ωcm2（图4）。TEER值使用包含通电电极和电压测量电极的装置（World Precision Instruments）进行测定。作为比较，已有报道显示原代脑微血管内皮细胞的TEER值为200–600 Ωcm2，而一种 commercially available 的小鼠细胞系bEnd.3的TEER值为100–140 Ωcm2（详见Abbot 2005年和Toth 等., 2011年17,18的近期综述）。此外，在含2% FCS的分化培养基中培养4小时后，大分子物质（如不带电荷的FITC-葡聚糖，分子量分别为4、10、70和500 kDa，或分子量为300 Da的荧光素）穿过cEND单层的通透性，相较于在含10% FCS生长培养基中维持的对照细胞显著降低：荧光素的旁细胞通量降至对照细胞的30%，FITC-葡聚糖10和70 kDa的通量降至26%，而FITC-葡聚糖500 kDa的通量则降至对照细胞的4.5%。与TEER值类似，在添加糖皮质激素（GC）的培养条件下，细胞的通透性达到最低水平4。在进一步的研究中，我们鉴定出脑血管内皮中糖皮质激素的靶基因，包括occludin、claudin-5和VE-cadherin4,7,9。GC处理可上调这些蛋白的表达，并促使VE-cadherin重排至细胞骨架。GC对紧密连接蛋白occludin和claudin-5的直接调控机制似乎是通过其启动子区域中的糖皮质激素反应元件实现的4,7,19。此外，claudin-5还被鉴定为血管内皮中一种新的雌激素作用靶点10。
内皮功能障碍是多种不同疾病的基础。我们在氧糖剥夺（OGD）条件下培养cEND细胞。OGD导致血脑屏障（BBB）功能受损，而联合使用GC和蛋白酶体抑制剂硼替佐米可恢复该功能12。OGD条件显著增加了脑微血管内皮细胞（cerebEND）的葡萄糖摄取以及葡萄糖转运蛋白的表达，而加入NMDA受体非竞争性抑制剂MK801可减轻这一效应13。
<img alt="细胞分化过程；显微镜图像；干细胞集落形成；细胞形态变化。" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 脑微血管内皮细胞（cEND）分离后一周的形态学特征。 光学显微镜图像在6倍（A）和15倍（B）放大倍数下拍摄。可见呈岛状分布的内皮细胞集落。
<img alt="细胞培养的显微镜图像；细胞形态；生物学研究；组织工程。" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 脑微血管内皮细胞（cEND）在分离和永生化一个月后的形态学特征。 光学显微镜图像在15倍放大倍数下拍摄。可见融合、均一的内皮细胞单层。
<img alt="荧光显微镜下的肌纤维结构；示意图显示排列整齐的肌节和肌丝。" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 永生化脑微血管内皮细胞表达claudin-5、occludin和VE-cadherin。CEND细胞培养于IV型胶原包被的盖玻片上，并用针对claudin-5（A）、occludin（B）和VE-cadherin（C）的抗体进行染色。图像使用蔡司Axioscop2显微镜在40倍放大倍数下拍摄。
<img alt="21天内的跨上皮电阻（TEER）图；用于测量屏障完整性，单位为 Ωcm²。" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. cEND 单层细胞跨内皮电阻（TEER）的测定。 将 cEND 细胞培养在经 IV 型胶原包被的 Transwell 小室滤膜上（孔径 0.4 μm）。待细胞达到融合状态后，使用含 2% FCS 的培养基维持培养。分别在培养 7、14 和 21 天后，利用包含通电电极和电压测量电极的装置测定 TEER 值。

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

所述方法可用于从不同品系的小鼠以及不同基因敲除小鼠品系中分离微血管内皮细胞，以研究血管内皮功能的特定变化。 作为一种永生化方法，我们采用了鼠多瘤病毒的癌蛋白——多瘤病毒中T抗原进行转化。该抗原可快速转化未成熟的内皮细胞 体内 和 体外 20,21,22文献中描述的其他内皮细胞永生化方法包括例如使用猴空泡病毒40（SV40）的大T抗原进行永生化 23腺病毒基因产物 E1A 24 或人端粒酶催化亚基的过表达 3.PymT 的永生化作用特异性针对小鼠未成熟内皮细胞，可在短时间内从新生小鼠获得均一的内皮细胞培养物。永生化会改变细胞的特性，因此使用永生化细胞系获得的结果应与原代细胞或相关实验进行比较 体内 与小鼠相关。已报道PymT永生化内皮细胞表达高水平的纤维蛋白溶解活性，这是由于尿激酶型纤溶酶原激活物的产生增加以及纤溶酶原激活物抑制剂的产生减少所致。 25. 对PymT永生化bEND5细胞系与原代ECs的直接比较表明，两者均 体外 血脑屏障模型非常适合用于T细胞黏附研究 26.
根据所述方法建立的细胞系可在低代次时使用，以通过高表达血脑屏障（BBB）和内皮细胞连接蛋白来维持屏障特性，因为细胞在传代过程中会逐渐丧失这些特性。因此，当细胞失去屏障特性后，应考虑重新制备新的细胞系。内皮细胞的接种密度应较高，因为这对细胞增殖至关重要。在原代细胞分离过程以及永生化内皮细胞的培养维持过程中均需考虑这一点。每一批新建立的细胞系都应检测其屏障特性，并检测是否存在其他细胞类型的污染。可使用抗半乳糖脑苷脂、抗胶质纤维酸性蛋白和抗平滑肌抗原抗体作为一抗对内皮细胞单层进行染色，以排除少突胶质细胞、星形胶质细胞和周细胞的污染4,27。为排除脑膜血管来源的污染，可检测血栓调节蛋白（thrombomodulin）的表达，该蛋白在全身各血管床中均有表达，唯独脑血管中不表达28。
有趣的是，从不同脑区分离得到的永生化微血管内皮细胞系在屏障特性和对促炎刺激的敏感性方面存在差异。例如，可提及大脑来源的 cEND 细胞系和小脑来源的 cerebEND 细胞系4,5。与 cEND 相比，cerebEND 中主要紧密连接组分 claudin-1 和 occludin 的表达水平较低，而 claudin-3 和 -12 的表达水平则更高。在炎症介质 TNFα 处理下，cerebEND 细胞的屏障功能受损程度显著大于 cEND 细胞5。小脑对炎症刺激更高的易损性在多发性硬化症患者以及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎中均可在in vivo条件下观察到29。这些有趣的发现表明，有必要针对不同脑区建立并表征各自的in vitro模型，以促进未来药物向脑组织的靶向递送。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>纯度 &amp;gt; 98%</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>50 &amp;mu;g/ml 溶于50 mM乙酸</td></tr><tr><td>胶原酶/分散酶</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>终浓度10%，56 &amp;deg;C加热灭活30分钟</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>储存条件：&amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MEM维生素</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>储存条件：&amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>新霉素（G418）</td><td>PAA Laboratories</td><td>P11-012</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEA）</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>储存条件：&amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（六亚甲基溴化铵）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>0.8 mg/ml 溶于PBS，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td>0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA 溶于PBS</td></tr></tbody></table>

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

上皮细胞和内皮细胞（EC）构成细胞旁屏障，保护组织免受外界和内部环境的影响。血脑屏障（BBB）由内皮细胞、星形胶质细胞终足、周细胞以及基底膜组成，负责脑实质的保护和稳态维持。体外 BBB 模型是研究 BBB 在细胞水平上结构与功能的常用工具。迄今为止，不同实验室已建立了大量不同的体外 BBB 模型。通常，这些细胞来源于牛、猪、大鼠或小鼠的脑组织（详见 Wilhelm 等1 的综述）。人源组织样本仅在少数实验室或公司中可获得2,3。由于原代细胞制备耗时，且内皮细胞培养批次间可能存在差异，因此建立永生化内皮细胞系成为当前科学研究的关注重点。
本文介绍了一种从小鼠新生脑组织中建立永生化脑微血管内皮细胞（EC）系的方法，并逐步描述了所用试剂和溶液。本实验室建立的方法可在4至5周内分离获得均一的永生化内皮细胞系。Förster实验室根据该方法分离得到了命名为cEND4（源自大脑皮层）和cerebEND5（源自小脑皮层）的脑微血管内皮细胞系，并已成功应用于血脑屏障（BBB）多种生理与病理过程的研究。利用cEND和cerebEND细胞系，我们已证实这些细胞可响应糖皮质激素4,6-9和雌激素处理10，以及TNFα等促炎介质5,8。此外，我们还在内皮细胞水平上研究了多发性硬化11和缺氧12,13的病理机制。cEND和cerebEND细胞系可作为研究血脑屏障结构与功能、内皮细胞对不同刺激的细胞反应，以及内皮细胞与淋巴细胞或肿瘤细胞相互作用的良好工具。

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。

上皮细胞和内皮细胞（EC）构成细胞旁屏障，保护组织免受外部和内部环境的影响。……

本实验的总体目标是获得一种均质化的永生化脑微血管内皮细胞培养物。首先从新生小鼠中分离脑组织并制备单细胞悬液，以此实现该目标。第二步是利用多瘤病毒中T抗原对细胞进行永生化处理。接下来，细胞培养约四周，直至形成均一的内皮单层。最后一步是利用免疫染色、蛋白质印迹和定量-定量-聚合酶链式反应（Q-Q-P-C-R）等技术对新细胞系进行表征。该技术的应用意义在于为神经炎症性或缺血性脑部疾病的治疗提供了可能，因为可借此获得临床前治疗评估以及病理生理学方面的深入认识。演示该操作的是来自我实验室的博士后Elaine Salvador博士。在超净工作台中操作，将3至5日龄新生小鼠的脑组织取出并转移至含有缓冲液A的培养皿中，每次制备需要5至10只小鼠的脑组织。从每只脑组织中去除小脑、脑干、脑膜以及毛细血管碎片。然后将脑组织转移至含有缓冲液A的第二个培养皿中。使用无菌手术刀将脑组织切成小块，再用10毫升移液器反复吸取和排出组织与缓冲液，直至无明显团块存在。此时，将悬液转移至50毫升离心管中，在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物溶于4.5毫升缓冲液A和1.5毫升0.75%（质量/体积）的溶液中。用胶原酶处理组织。将组织与胶原酶溶液置于37°C水浴中孵育45分钟，期间偶尔振荡。同时，通过将四个孔的12孔板用每毫升0.1毫克的无菌溶液包被，来准备组织培养板。胶原蛋白四和50毫摩尔乙酸可在室温下使胶原蛋白在一小时内黏附于孔板。45分钟孵育期结束后，加入15毫升缓冲液A以终止脑组织的消化，并在此溶液中充分重悬沉淀。然后以250 × g离心10分钟，并弃去上清液。接下来，为了从制备物中去除髓鞘，向组织中加入10毫升无菌的、25%（重量/体积）的BSA和PBS，然后在4°C下以1000 × g离心20分钟。离心后，小心弃去上清液，将沉淀物溶解于15毫升缓冲液A中，转移至新的50毫升离心管中，再在室温下以250 × g离心5分钟。同时，用PBS将胶原IV包被的培养板洗涤两次。第二次洗涤后，保留两个孔为空，向另外两个孔中各加入2毫升培养基。弃去上清液后，将主要由内皮细胞组成的细胞沉淀重悬于4毫升含有4微克/毫升嘌呤霉素的培养基中，并将2毫升细胞悬液接种至两个空的胶原包被孔中，在37°C孵育45分钟，以清除快速贴壁的非内皮细胞。接着，吸出不含细胞的两个孔中的培养基并弃去。然后将含有非贴壁细胞的培养基（包括内皮细胞组分）转移至这两个孔中。向之前的孔中补充两毫升新鲜培养基。这些孔中含有成纤维细胞和星形胶质细胞等其他细胞类型，可平行培养并用于形态学比较。次日，在组织培养孵育箱中将细胞孵育过夜。更换新鲜培养基，培养GPE neo成纤维细胞，该细胞在明胶包被的培养瓶中分泌含有多瘤病毒中T癌基因的复制缺陷型病毒。GPE neo多瘤病毒中T癌基因转染可使内皮细胞相对于非内皮细胞具有生长优势，从而形成具有内皮细胞形态的均一单层细胞。培养4至6周后，GPE neo细胞无法商业获取，可通过共享公共材料获得。在 GPE Neo Fiberblast 培养 24 小时后，移除 10 毫升培养基，并加入无菌的 poly brain 溶液，使其终浓度为 8 微克/毫升。将上清液混合物通过 0.45 微米滤器过滤，以去除任何细胞碎片。随后吸除内皮细胞培养物中的培养基，在过夜孵育后，向各孔中加入 2 毫升上清液 poly brain 混合物。次日用新鲜的上清液多脑混合物重复此步骤。去除上清液多脑混合物。用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入新鲜培养基。当细胞在胶原包被的培养皿中生长至汇合时，继续每三天更换一次培养基，并以1:2的比例进行传代。通常在连续培养四到五周后可获得稳定的大脑微血管内皮细胞系。当均一的内皮单层细胞完全铺满整个孔时。一旦获得稳定细胞系，将细胞转移至经IV型胶原包被的组织培养瓶中，使用3毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度孵育5至15分钟，直至细胞层分散，每周传代不超过一次。加入5毫升培养基后接种至新的培养瓶，避免传代比例高于1:4。当细胞数量足够获得一个汇合的 T75 培养瓶时，可制备细胞冻存管以供后续使用。操作步骤如下：用胰蛋白酶消化收获细胞（方法同前），然后将细胞悬液在 250 × g 条件下离心 5 分钟。在室温下，将细胞沉淀重悬于 6 毫升冻存液中，再用移液器将 1.5 毫升细胞悬液分装至 4 个冻存管中。将冻存管放入装有异丙醇的Nalgene冻存盒中，在负80摄氏度条件下保存一天。最后，将冻存管置于液氮中长期保存。将细胞冻存管在水浴中融化，然后转移至含有10毫升培养基的15毫升离心管中。将培养基预热至37摄氏度，并在室温下以250 × g离心5分钟。吸除培养基后，用适量生长培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至含有预热生长培养基的胶原蛋白IV包被的T25细胞培养瓶中。铺板时的细胞密度应至少为每毫升1×10⁴个细胞。次日更换培养基，并在细胞约五天后达到汇合时按照之前的方法继续传代，待细胞准备好后以后续实验所需的密度进行铺板。C端细胞通过内皮细胞及血脑屏障标志物的免疫染色进行表征。此图像显示了C细胞和免疫染色标记clain五的细胞形态。C细胞的形态与脑ECS原代培养细胞相似，呈紧密排列的单层细长细胞，表现出生长抑制现象。在接近汇合时，这些细胞表达了可检测水平的clain。此处的C CN细胞已使用occludin抗体进行免疫染色。我们在此处观察到VE-cadherin蛋白的表达，这些蛋白定位于细胞-细胞连接处，同样通过免疫荧光染色显示。跨内皮电阻使用包含电流通过电极和电压测量电极的装置进行测定。从该图可以看出，Cend细胞的跨内皮电阻力在培养后随时间的延长而增加。该技术为神经科学领域的研究人员利用小鼠模型探索脑血管疾病铺平了道路。

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

代的永生化小鼠脑微血管内皮细胞株作为<em在体外</em血脑屏障型号

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外...

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。...

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

维持血脑屏障的完整性对于中枢神经系统的稳态至关重要。本方案描述了 体外...

体外 检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

人血脑屏障选择性地阻止亲水性分子和病原体进入大脑。多种病理状态，包括脑膜炎和术后谵妄，均与血脑屏障通透性增加相关。本文中，我们描述了一种内皮细胞培养模型，用于通过微生物跨膜迁移来检测屏障通透性。...

通过微生物穿越微血管内皮细胞分析血脑屏障通透性

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

本方案详细描述了一种改进的方法，用于诱导人诱导性多能干细胞分化，从而获取、扩增并冻存脑微血管内皮细胞，并用于研究血脑屏障特性的体外模型 离体...

从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

一种从新生小鼠脑组织中分离和原代培养脑微血管内皮细胞（BMECs）的方案，用于建立稳定的体外血脑屏障模型...

小鼠脑微血管内皮细胞的分离与培养

了解永生化小鼠脑微血管内皮细胞株的分离与培养方法，用于建立体外血脑屏障模型。该技术通过多瘤病毒中T抗原实现细胞永生化，为神经炎症和缺血性脑疾病研究提供标准化实验工具。

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为体外血脑屏障模型

探索更多视频

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

探索更多视频

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为体外血脑屏障模型