核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

本实验的总体目标是鉴定并定位在无细胞翻译系统中进行翻译的 mRNA 的主要翻译暂停位点。首先将目的基因克隆至 T7 转录启动子的调控下，然后转录并纯化 mRNA 来实现这一目标。

然后，在 mRNA 和放射性标记氨基酸存在的情况下进行体外翻译，以标记合成的蛋白质和新生多肽链。最后，通过沉降速度离心法分离多聚核糖体，并利用凝胶电泳解析分离得到的新生肽链。最终，可通过 Trisine SDS 凝胶电泳结合放射自显影获得结果显示不同长度的新生多肽，从而表明在目标 mRNA 上存在翻译暂停位点。

该技术相较于我们现有的方法（如微球菌核酸酶核保护分析法）的主要优势在于其极为简单、快速且高效，能够确定并鉴定出在特定细胞体系中任意MNA上的主要翻译暂停位点。该方法有助于回答翻译及翻译过程中蛋白质折叠领域中的一些关键问题，例如，像密码子使用偏好、TNA丰度以及mRNA二级结构等健康因素如何影响翻译动力学。该方法还可进一步增进我们对翻译动力学与共翻译蛋白质折叠途径中关键步骤之间关系的理解。

该技术的应用有助于理解体内蛋白质折叠过程，这一过程通常被认为是在核糖体上进行翻译时伴随翻译同时发生的。尽管如此，本研究采用商业可得的细胞提取物，对γ-晶状体蛋白进行无细胞翻译。该技术还可用于通过使用来自任何细胞来源的具有翻译能力的提取物，鉴定潜在任何蛋白质中的翻译调控元件（translational IDE）。通常，初次接触该方法的研究人员会在实验方案的两个关键步骤中遇到困难。

第一个是确定运行翻译反应所需的总时间，以确保大部分新生多肽仍与核糖体结合。第二个是选择合适的凝胶系统来分离大部分新生多肽，凝胶系统的选择取决于所研究蛋白质的大小。我们在二十世纪八十年代中期首次提出该方法的想法，当时我们决定研究珠蛋白分子的翻译动力学，以验证关于珠蛋白共翻译折叠的假说模型。

1974年，PRO 和 Maurice 在使用尺寸排阻 CLO 色谱法分析珠蛋白 NAS 及其链时，首次注意到珠蛋白翻译的非均一性。然而，他们的分析并未达到理想的精确度，PRO 和其他研究者仅观察到翻译珠蛋白过程中存在的四个主要翻译强点位。随后，我们的分析进一步揭示了约10个额外的强点位，并建立了翻译过程中珠蛋白折叠的详细模型。本方法的可视化演示至关重要，因为此处描述的技术涉及多聚核糖体的分离，以及利用 Tri S Ds page 凝胶对新生多肽进行分析。

这两个步骤对于获得高质量且可重复的结果至关重要。示范该前胶制备过程的是来自Myelo实验室的研究生Sujata For，用于体外转录信使RNA。首先从一个目的基因开始，该基因已克隆至T7和/或SP6启动子下游；使用适当的限制性内切酶将DNA模板在终止密码子下游和/或mRNA 3'端之后线性化。

通过限制性酶切消化样本并进行琼脂糖凝胶电泳，以验证DNA是否已完全线性化。在确定最佳DNA模板浓度后，根据制造商说明书，使用转录试剂盒体外转录信使RNA。随后，采用氯化锂沉淀法纯化mRNA。

然后使用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳验证其纯度。在无核酸酶的水中配制100微升体外翻译反应体系，加入1毫摩尔的甲硫氨酸缺失氨基酸混合物、10单位的RNA抑制剂、20微居里的放射性³⁵S-甲硫氨酸以及兔网织红细胞裂解液。接下来，将反应体系在30摄氏度孵育5分钟进行预热。

然后加入两微克 mRNA，并在30°C下孵育五分钟以终止反应，随后置于冰上以分离与核糖体结合的新生多肽。将翻译反应液小心铺加到含有氯化钾和氯化镁的4.5毫升30%甘油-HCl缓冲液（pH 7.6）上，使用TLA 110转子离心机在100,000 × g、4°C条件下离心一小时。接着，小心吸去上清液，将含有新生多肽的多聚核糖体沉淀物重悬于少量含0.5毫克/毫升核糖核酸酶A的1毫摩尔Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）中，在37°C下孵育30分钟。

为了增强肽的水解以及tRNA酯键的断裂，向反应体系中加入氢氧化钠，使其终浓度为10毫摩尔，并额外孵育30分钟。使用Tris-Tris SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离新生多肽，随后固定并干燥凝胶。对凝胶进行放射自显影，接着进行磷屏成像，以检测新生多肽。

由于tRNA库的变化导致核糖体移动改变，应会引起翻译过程中积累的新生多肽链长度分布及其相对强度的变化，后者反映了在此处暂停时间的长短。通过Tristine SDS凝胶电泳分离并分析了γB晶状体蛋白的新生多肽链。RRL系统与大肠杆菌系统中多肽链长度和强度的差异表明，核糖体在这两种系统中沿mRNA移动的翻译动力学不同。

例如，注意在大肠杆菌裂解液中出现的显著的17.7千道尔顿条带，而在兔网织红细胞裂解液系统中则不存在。γB-晶状体蛋白含有成对的精氨酸密码子，这类密码子在哺乳动物系统中较为常见，但在大肠杆菌中极为罕见且翻译速度缓慢，这表明该条带的出现是由于核糖体在这些成对的稀有密码子处暂停所致，如图所示。

在没有 mRNA 的情况下无法观察到条带，而嘌呤霉素处理可去除多聚核糖体上的大部分新生肽链。此外，延长嘌呤霉素处理时间可清除所有新生肽链，从而证实所观察到的多肽产物是与核糖体结合的新生肽链，而非与多聚核糖体共沉淀的MRPs。一旦掌握该技术，可在一至两天内完成实验。实验时长主要取决于离心步骤和新生肽链凝胶电泳步骤所需的时间。

在进行该实验操作时，必须在孵育结束后立即终止翻译反应。为避免新生多肽链从核糖体上释放，显然在任何步骤中都必须避免RNA的存在。RNA污染可能影响提取物的翻译效率，并导致在此操作步骤之后新生多肽链从核糖体上释放。

其他目标，例如 mRNA 结合蛋白对特定 mRNA 上核糖体移动效率的影响，也可以在该技术建立后进行检测。该技术为蛋白质折叠领域的研究人员探索翻译过程中的核糖体停顿在蛋白质折叠中的作用铺平了道路，这种停顿是由翻译过程中稀有密码子的存在所引起的。此前，该技术已被用于检测钾离子取代对 mRNA 上核糖体移动以及翻译过程中蛋白质折叠的影响。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过分离与核糖体结合的新生多肽链来鉴定 mRNA 上的翻译活跃位点。请务必注意，使用放射性同位素及标记的氨基酸（例如³⁵S-甲硫氨酸）时需采取特殊防护措施，在进行本实验操作时应始终予以充分考虑。