Name: 核糖体束缚新生多肽的分离在体外确定沿mRNA的翻译暂停网站 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学习利用体外翻译系统分离核糖体束缚的新生多肽，通过SDS-PAGE和放射自显影技术精确定位mRNA上的翻译暂停位点，从而深入理解蛋白质合成动力学与基因表达调控机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由人类前沿科学计划资助项目 RGP0024 资助。

1. DNA 模板制备与 体外 转录
<ol>
 <li>目的基因被克隆至T7和/或例如SP6转录启动子下游。</li>
 <li>对于 体外 将模板DNA用适当的限制性内切酶在ORF终止密码子和/或mRNA 3'端下游进行线性化处理。需通过琼脂糖凝胶电泳检测限制性酶切产物，以确认质粒DNA是否完全线性化。</li>
 <li>线性化的质粒用于 体外 转录反应。可测试不同浓度的模板DNA，以确定该反应所需的最适DNA浓度 体外 转录。通常使用 Ambion 的 MEGAscript 高产量转录试剂盒（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 1 μg 线性化DNA产量为40-60 μg mRNA的 体外 转录操作按照制造商说明书进行（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰德岛）。</li>
 <li>随后 体外 通过氯化锂沉淀法纯化mRNA，具体操作按照生产商说明书进行（Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit）。</li>
 <li>通过丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步验证 mRNA 的完整性。</li>
</ol>
2. 体外 无细胞翻译
对于 体外 使用翻译 Rrabbit R网织红细胞裂解液，RRL（Promega，Madison，WI），请按照以下步骤操作：
<ol>
 <li>准备 100 μl 体外 根据制造商说明书进行翻译反应。简言之，在无核酸酶的水中加入 2 μl 甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物（1 mM），10单位RNase抑制剂（Invitrogen/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 20 μCi 放射性[35S]-甲硫氨酸（MP Biomedicals，Solon，OH）， 70 μl 兔网织红细胞裂解液（Promega，Madison，WI）</li>
 <li>在指定条件下孵育反应体系 30 °C 5分钟以预热翻译反应。加入 2 μg 将mRNA加入翻译反应体系，并在 30 °C 5 分钟。</li>
 <li>通过将翻译反应体系置于冰上以终止反应。</li>
</ol>
3. 新生多肽的分离 体外 翻译反应
<ol>
 <li>为了分离与核糖体（多聚核糖体）结合的新合成多肽，将翻译反应液铺加在 4.5 ml 含有 100 mM KCl、10 mM MgCl2 的 30% 甘油溶液（10 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.6）上方，并在 TLA-110 转子（Beckman Coulter, Inc, Brea, CA）中于 4 °C 下以 100,000 × g 离心 1 小时。</li>
 <li>小心移除上清液。</li>
 <li>将含有新合成多肽的多聚核糖体沉淀物重悬于少量（10–15 μl）1 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）中，加入终浓度为 0.5 mg/ml 的核糖核酸酶 A（Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY），于 37 °C 孵育 30 分钟。为促进肽酰-tRNA 酯键的水解，加入 NaOH 至终浓度为 10 mM，并继续孵育额外 30 分钟。</li>
</ol>
在无 mRNA 存在的情况下组装 体外 翻译反应，并在相同条件下进行（随后按前述方法分离新生肽链），可作为主要对照。在将提取物进行密度梯度离心前，用嘌呤霉素处理翻译反应体系，可作为额外的对照。
4. 在 Tris-三聚氰酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离新生多肽
<ol>
 <li>分离的新生多肽通过Tris-tricine SDS-PAGE进行分辨和分析。请注意，上样量取决于蛋白质标记效率、蛋白质翻译效率以及其他多种参数。应根据经验调整上样量，以实现对单个新生多肽链的最佳可视化和分离效果。</li>
 <li>电泳完成后，凝胶经固定并使用真空凝胶干燥仪干燥，随后进行放射自显影。通过磷屏成像系统观察新生多肽的分布情况。</li>
</ol>
5. 典型结果
牛γ-B晶状体蛋白在兔网织红细胞裂解液中进行了翻译 E. coli S30 提取系统（Promega，Madison，WI），随后分离新生多肽链。 图1 描述了分离核糖体结合新生链的步骤。本研究旨在检验翻译环境的改变（即tRNA谱系，已知在哺乳动物（RRL）和原核生物（E. coli由于不同生物体之间密码子偏好性的差异，可能会影响核糖体沿mRNA的移动，并影响翻译暂停位点的分布。核糖体移动的改变将导致翻译过程中积累的新生多肽链长度分布及其相对强度发生变化。条带的相对强度反映了暂停持续的时间。新生多肽链经分离后，在16.5% T、6% C的Tris-三羟甲基氨基甲烷（Tricine）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分辨 （图2）γ-B-晶状体蛋白是一种20 kDa的蛋白质。在兔网织红细胞裂解液（RRL）中观察到新生多肽链长度和强度不一的现象。 E. coli 系统表明，核糖体在这两个系统中沿mRNA的移动遵循不同的翻译动力学。例如，我们观察到一个明显的17.7 kDa条带 E. coli 裂解液中存在而非在RRL系统中存在，表明在mRNA的3'末端区域（编码Gamma B晶状体蛋白的C端区域）进行翻译时，存在一个额外的翻译暂停位点 E. coli 系统。我们注意到，Gamma-B 晶状体蛋白含有串联的精氨酸密码子（AGG）153 和 AGA154）在哺乳动物系统中较为常见，但已知在其中极为罕见且翻译速度极慢 E. coli 一种新型新生肽的积累 E. coli 系统（约17.7 kDa） 图 2.2) 很可能是由于核糖体在这些串联的稀有密码子处暂停所致。请注意，在缺乏 mRNA 的情况下无法观察到任何条带。图 2.3）并且嘌呤霉素处理可将新生肽链从多聚核糖体上大部分去除（图 2.3）。长期使用嘌呤霉素（puromycin）处理&gt; 15 分钟）可去除所有新生肽链（数据未显示）。这证实了所观察到的多肽产物是与核糖体结合的新生肽链，而非与多聚核糖体共同沉降的mRNP。
如上所述，密码子偏好性具有生物体和组织特异性。此处描述的代表性实例明确表明，改变翻译的环境，即tRNA库/密码子偏好性，可导致核糖体沿mRNA移动发生变化。显然，这一简单技术不仅能用于鉴定mRNA上的翻译暂停位点，还可实现不同系统之间翻译暂停位点的快速比较。
<img alt="In vitro transcription and translation diagram, mRNA extraction, polypeptide isolation process." src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 分离核糖体结合的新生多肽步骤示意图 牛γ-B晶状体蛋白ORF序列（528个碱基对）被克隆至pBSKS+载体中T7启动子的下游。对于 体外 将模板DNA用EcoRI处理以进行线性化。线性化的模板用于转录 体外 转录。DNA模板中的T7启动子被T7 RNA聚合酶识别，从而转录下游的Gamma-B Crystallin基因。使用氯化锂沉淀法纯化mRNA。纯化的mRNA用于后续实验。 体外 翻译。孵育后，将翻译反应液铺在30%甘油溶液上，并在4℃下以100,000 × g离心1小时 4 °C 在100,000 × g条件下离心，以分离核糖体结合的新生多肽。
<img alt="SDS-PAGE gel electrophoresis analyzing Gamma-B crystallin expression. Protein bands, RRL, E.coli lysate." src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 从兔网织红细胞裂解液（RRL）中分离翻译的牛γ-B晶状体蛋白新生多肽 E. coli 裂解液 2 μg mRNA 被混合进去 100 μl 含有RRL的反应 E. coli S30 提取系统（Promega，Madison，WI），按照制造商说明书操作 20 μCi [35S]-甲硫氨酸，并在 30 °C 孵育5分钟后，将翻译反应液加至含100 mM KCl、10 mM MgCl₂的30%甘油（溶于10 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.6）4.5 ml之上2，于4°C下以12,000 × g离心1小时 4 °C 以及在 TLA-110 转子（Beckman Coulter, Inc, Brea, CA）中以 100,000 × g 离心。分离得到的多聚核糖体沉淀重悬于 20 μl 含 0.5 mg/ml 核糖核酸酶 A（Invitrogen/Life Technologies，Grand Island，NY）的 1 mM Tris-HCl（pH 7.6）处理，随后按方案部分所述进行 NaOH 处理。新生多肽在 16.5% T、6% C 的 Tris-Tricine SDS-PAGE 凝胶上分离。凝胶干燥后进行放射自显影。曝光后，使用 GE Healthcare 的 Typhoon 成像扫描仪对凝胶进行扫描。 图 2.1 显示在两种不同系统（RRL 和）中进行翻译反应后分离并解析的新合成多肽的凝胶结果 E. coli). 图 2.2 使用Image Quant TL v2005软件对凝胶进行分析，此处作为示例，说明两种系统中积累的新生多肽的分子量和强度可被轻松分析与比较。 图 2.3 显示两组对照：在无 mRNA 条件下组装翻译反应，或在翻译反应经嘌呤霉素处理（5 分钟，终浓度 1 mM）后再进行离心，所分离并经 SDS-PAGE 分析的新合成多肽。

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为了获得可重复的实验结果，in vitro 转录和翻译反应所用组分的质量与浓度至关重要。在本研究中，我们使用了市售试剂盒和提取物，只要操作得当，即可获得高度可重复的数据。然而，如有需要，也可自行从选定的细胞中制备具有翻译活性的提取物。mRNA 的质量可能影响翻译效果，因此在进行 in vitro 翻译前，必须检测 mRNA 的完整性。
此外，该持续时间 体外 每种蛋白质的翻译反应都需要单独优化。这是分离新生多肽的关键步骤。延长孵育时间会导致全长蛋白质的合成以及大部分新生多肽从核糖体上释放。孵育时间可通过以下操作进行优化： 体外 在不同时间点进行翻译反应。一旦确定了全长蛋白翻译所需的最短时间，下一步则需在该时间段附近开展另一组实验，以确定孵育时间，在此期间大多数新生多肽仍与核糖体结合（即翻译起始与终止过程仍处于平衡状态）。翻译反应也可通过添加抑制翻译延伸的抗生素（如环己酰亚胺）来终止。显然，该实验系统可用于解析mRNA上主要的暂停位点，所采用凝胶系统的分辨能力将对实验结果质量产生重要影响。建议在该类实验中使用Tr...

<table><tbody><tr><td>MEGAscript T7 高产量转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>15518012</td><td></td></tr><tr><td>Trans [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]-标记物</td><td>MP Biomedicals</td><td>0151006</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 A</td><td>Invitrogen</td><td>12091</td><td></td></tr><tr><td>兔网织红细胞裂解液系统（核酸酶处理）</td><td>Promega</td><td>L4960</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; S30 提取系统（用于线性模板）</td><td>Promega</td><td>L1030</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima TLX 超速离心机</td><td></td></tr><tr><td>储存磷屏自显影技术</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon 9410 多功能成像仪</td><td></td></tr><tr><td>新生多肽分析软件</td><td>GE Healthcare</td><td>Image Quant TL, v2005</td><td></td></tr></tbody></table>

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mrna上的翻译暂停位点

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

翻译延伸速率是不均匀的。mRNA二级结构、密码子使用以及与mRNA结合的蛋白质可能改变核糖体在mRNA上的移动详见参考文献1然而，目前普遍认为同义密码子的使用是导致翻译延伸速率不均一的主要原因1同义密码子的使用频率并不相同。某些密码子的使用频率高于其他密码子，存在密码子使用偏好性。2密码子偏好性具有生物体和组织特异性2,3此外，密码子的使用频率与其对应的tRNA浓度成正比。4因此，使用频率较高的密码子通常对应更多种类的tRNA，这意味着高频密码子的翻译速度通常快于低频密码子。因此，mRNA上富含稀有密码子的区域（潜在的暂停位点）通常会减缓核糖体在mRNA上的移动速度，导致相应长度的新生肽链发生累积。5-8这些暂停位点可能对蛋白质表达、mRNA稳定性以及蛋白质折叠产生功能影响参见文献9以供审阅确实，已有研究表明，缓解此类暂停位点可改变核糖体在mRNA上的移动，进而可能影响共翻译过程的效率（体内蛋白质折叠1,7,10,11. 为了理解蛋白质折叠的过程 体内在细胞内，这一过程最终与蛋白质合成相偶联，因此必须全面了解密码子使用情况/tRNA含量对翻译延伸过程中核糖体沿mRNA移动的影响。
本文介绍了一种简单的方法，可用于定位特定mRNA在多种无细胞系统中翻译时的主要翻译暂停位点6-8该步骤基于在核糖体上分离正在积累的新生多肽 体外 目标mRNA的翻译。其原理在于，在低频密码子处，核糖体停留时间延长，导致相应长度的新生肽段积累增多。 体外 转录的mRNA用于 体外 在存在放射性标记氨基酸的条件下进行翻译反应，以检测新生肽链。为了分离核糖体结合的新生多肽复合物，将翻译反应产物铺在30%甘油溶液上，随后进行离心。多核糖体沉淀中的新生多肽进一步用核糖核酸酶A处理，并通过SDS-PAGE分离。该技术原则上可用于任何蛋白质，能够分析核糖体沿mRNA的移动情况以及主要暂停位点的检测。此外，本实验方案还可进行调整，用于研究可能影响核糖体移动、从而潜在改变蛋白质功能或构象的各种因素和条件。

本文描述了一种用于鉴定mRNA上翻译暂停位点的技术。该方法基于在体外翻译目标mRNA时，分离在核糖体上积累的新生多肽链，随后通过变性凝胶电泳对新生肽链的大小进行分析。

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

翻译延伸速率是不均匀的。mRNA二级结构、密码子使用以及与mRNA结合的蛋白质可能改变核糖体在mRNA上的移动……

本实验的总体目标是鉴定并定位在无细胞翻译系统中进行翻译的 mRNA 的主要翻译暂停位点。首先将目的基因克隆至 T7 转录启动子的调控下，然后转录并纯化 mRNA 来实现这一目标。然后，在 mRNA 和放射性标记氨基酸存在的情况下进行体外翻译，以标记合成的蛋白质和新生多肽链。最后，通过沉降速度离心法分离多聚核糖体，并利用凝胶电泳解析分离得到的新生肽链。最终，可通过 Trisine SDS 凝胶电泳结合放射自显影获得结果显示不同长度的新生多肽，从而表明在目标 mRNA 上存在翻译暂停位点。该技术相较于我们现有的方法（如微球菌核酸酶核保护分析法）的主要优势在于其极为简单、快速且高效，能够确定并鉴定出在特定细胞体系中任意MNA上的主要翻译暂停位点。该方法有助于回答翻译及翻译过程中蛋白质折叠领域中的一些关键问题，例如，像密码子使用偏好、TNA丰度以及mRNA二级结构等健康因素如何影响翻译动力学。该方法还可进一步增进我们对翻译动力学与共翻译蛋白质折叠途径中关键步骤之间关系的理解。该技术的应用有助于理解体内蛋白质折叠过程，这一过程通常被认为是在核糖体上进行翻译时伴随翻译同时发生的。尽管如此，本研究采用商业可得的细胞提取物，对γ-晶状体蛋白进行无细胞翻译。该技术还可用于通过使用来自任何细胞来源的具有翻译能力的提取物，鉴定潜在任何蛋白质中的翻译调控元件（translational IDE）。通常，初次接触该方法的研究人员会在实验方案的两个关键步骤中遇到困难。第一个是确定运行翻译反应所需的总时间，以确保大部分新生多肽仍与核糖体结合。第二个是选择合适的凝胶系统来分离大部分新生多肽，凝胶系统的选择取决于所研究蛋白质的大小。我们在二十世纪八十年代中期首次提出该方法的想法，当时我们决定研究珠蛋白分子的翻译动力学，以验证关于珠蛋白共翻译折叠的假说模型。1974年，PRO 和 Maurice 在使用尺寸排阻 CLO 色谱法分析珠蛋白 NAS 及其链时，首次注意到珠蛋白翻译的非均一性。然而，他们的分析并未达到理想的精确度，PRO 和其他研究者仅观察到翻译珠蛋白过程中存在的四个主要翻译强点位。随后，我们的分析进一步揭示了约10个额外的强点位，并建立了翻译过程中珠蛋白折叠的详细模型。本方法的可视化演示至关重要，因为此处描述的技术涉及多聚核糖体的分离，以及利用 Tri S Ds page 凝胶对新生多肽进行分析。这两个步骤对于获得高质量且可重复的结果至关重要。示范该前胶制备过程的是来自Myelo实验室的研究生Sujata For，用于体外转录信使RNA。首先从一个目的基因开始，该基因已克隆至T7和/或SP6启动子下游；使用适当的限制性内切酶将DNA模板在终止密码子下游和/或mRNA 3'端之后线性化。通过限制性酶切消化样本并进行琼脂糖凝胶电泳，以验证DNA是否已完全线性化。在确定最佳DNA模板浓度后，根据制造商说明书，使用转录试剂盒体外转录信使RNA。随后，采用氯化锂沉淀法纯化mRNA。然后使用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳验证其纯度。在无核酸酶的水中配制100微升体外翻译反应体系，加入1毫摩尔的甲硫氨酸缺失氨基酸混合物、10单位的RNA抑制剂、20微居里的放射性³⁵S-甲硫氨酸以及兔网织红细胞裂解液。接下来，将反应体系在30摄氏度孵育5分钟进行预热。然后加入两微克 mRNA，并在30°C下孵育五分钟以终止反应，随后置于冰上以分离与核糖体结合的新生多肽。将翻译反应液小心铺加到含有氯化钾和氯化镁的4.5毫升30%甘油-HCl缓冲液（pH 7.6）上，使用TLA 110转子离心机在100,000 × g、4°C条件下离心一小时。接着，小心吸去上清液，将含有新生多肽的多聚核糖体沉淀物重悬于少量含0.5毫克/毫升核糖核酸酶A的1毫摩尔Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）中，在37°C下孵育30分钟。为了增强肽的水解以及tRNA酯键的断裂，向反应体系中加入氢氧化钠，使其终浓度为10毫摩尔，并额外孵育30分钟。使用Tris-Tris SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离新生多肽，随后固定并干燥凝胶。对凝胶进行放射自显影，接着进行磷屏成像，以检测新生多肽。由于tRNA库的变化导致核糖体移动改变，应会引起翻译过程中积累的新生多肽链长度分布及其相对强度的变化，后者反映了在此处暂停时间的长短。通过Tristine SDS凝胶电泳分离并分析了γB晶状体蛋白的新生多肽链。RRL系统与大肠杆菌系统中多肽链长度和强度的差异表明，核糖体在这两种系统中沿mRNA移动的翻译动力学不同。例如，注意在大肠杆菌裂解液中出现的显著的17.7千道尔顿条带，而在兔网织红细胞裂解液系统中则不存在。γB-晶状体蛋白含有成对的精氨酸密码子，这类密码子在哺乳动物系统中较为常见，但在大肠杆菌中极为罕见且翻译速度缓慢，这表明该条带的出现是由于核糖体在这些成对的稀有密码子处暂停所致，如图所示。在没有 mRNA 的情况下无法观察到条带，而嘌呤霉素处理可去除多聚核糖体上的大部分新生肽链。此外，延长嘌呤霉素处理时间可清除所有新生肽链，从而证实所观察到的多肽产物是与核糖体结合的新生肽链，而非与多聚核糖体共沉淀的MRPs。一旦掌握该技术，可在一至两天内完成实验。实验时长主要取决于离心步骤和新生肽链凝胶电泳步骤所需的时间。在进行该实验操作时，必须在孵育结束后立即终止翻译反应。为避免新生多肽链从核糖体上释放，显然在任何步骤中都必须避免RNA的存在。RNA污染可能影响提取物的翻译效率，并导致在此操作步骤之后新生多肽链从核糖体上释放。其他目标，例如 mRNA 结合蛋白对特定 mRNA 上核糖体移动效率的影响，也可以在该技术建立后进行检测。该技术为蛋白质折叠领域的研究人员探索翻译过程中的核糖体停顿在蛋白质折叠中的作用铺平了道路，这种停顿是由翻译过程中稀有密码子的存在所引起的。此前，该技术已被用于检测钾离子取代对 mRNA 上核糖体移动以及翻译过程中蛋白质折叠的影响。观看本视频后，您应能充分理解如何通过分离与核糖体结合的新生多肽链来鉴定 mRNA 上的翻译活跃位点。请务必注意，使用放射性同位素及标记的氨基酸（例如³⁵S-甲硫氨酸）时需采取特殊防护措施，在进行本实验操作时应始终予以充分考虑。

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

核糖体束缚新生多肽的分离<em&gt;在体外</em&gt;确定沿mRNA的翻译暂停网站

对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。...

分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

本文介绍一种目前常规用于分离稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNCs）的技术。该技术利用了以下发现：当一段长为17个氨基酸的SecM“阻滞序列”被插入（或融合至C末端）几乎任何蛋白质时，可在原核生物（E.

利用SecM阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定...

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

学习利用体外翻译系统分离核糖体束缚的新生多肽，通过SDS-PAGE和放射自显影技术精确定位mRNA上的翻译暂停位点，从而深入理解蛋白质合成动力学与基因表达调控机制。

核糖体结合新生多肽的分离体外识别mRNA上的翻译暂停位点

探索更多视频

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

探索更多视频

核糖体结合新生多肽的分离体外识别mRNA上的翻译暂停位点