Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides <em>in vitro</em> to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Sujata S. Jha; Anton A. Komar

doi:10.3791/4026

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Biology

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

核糖体束缚新生多肽的分离在体外确定沿mRNA的翻译暂停网站

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10:15 min

July 6, 2012

DOI: 10.3791/4026-v

Sujata S. Jha¹, Anton A. Komar¹

¹Center for Gene Regulation in Health and Disease, Department of Biological, Geological and Environmental Sciences,Cleveland State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

描述的一种技术，以确定mRNA的翻译暂停网站。本程序是基于对新生多肽在体外培养的靶mRNA的翻译，其次是使用变性凝胶电泳新生链的大小分析核糖体积累的隔离。

该程序的总体目标是识别和定位在无细胞翻译系统中翻译的 mRNA 的主要翻译暂停位点。这是通过首先在 T 7 转录启动子的控制下克隆目标基因来实现的。接下来转录和纯化 mRNA。

然后在 mRNA 和放射性氨基酸存在下进行体外翻译，以标记合成的蛋白质和新生多肽。最后，使用沉降速度离心分离多核糖体，并通过凝胶电泳分离分离的新生链。最终，可以通过 Tristine SDS 页面和自动放射成像获得显示不同长度的新生多肽的结果，从而表明沿目标 mRNA 存在暂停位点。

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