流感病毒从感染细胞的染色质的核糖核蛋白复合物的亲和纯化

Lyco 阴性链，RNA 病毒。流感病毒的基因组以病毒肋核蛋白复合物或 VR nps 的形式包装，其中单链基因组被核蛋白包裹并与由 PA PB 1 和 PB 2 亚基组成的姜黄聚合酶复合物结合，以从受感染的哺乳动物细胞中纯化完整的复合物。将 Hela 细胞与重组 strept 标记的流感病毒一起孵育。

一旦病毒进入细胞，病毒 RNA 在感染后在细胞核中合成，细胞使用去污剂撒谎，并使用离心和基于攻击的染色质组分方案分离成细胞质核和染色质组分。最后，通过银染从纯化的 VR NPS 的蛋白质和 RNA 组成的每个级分分析中亲和纯化 strept 标记的 VRP，表明即使紧密使用该方案，也可以分离染色质结合的 VRP。完整。因此，与亲和纯化流感病毒肋核蛋白复合物的标准方法相比，我们的方案的主要优势之一是，通过使用我们的方法，可以从感染细胞的染色质中纯化 VR NPS，已知这是流感病毒 mRNA 合成的位点。

因此，我们的方法可用于回答围绕病毒复制和转录调节的问题，例如，哪些病毒或细胞因子，以及例如病毒 mRNA 合成或病毒基因组 RNA 合成需要哪些翻译后修饰。因此，不熟悉这种方法的研究人员可能会遇到一些困难，因为亚核分级分离对生化条件非常敏感，而且不同细胞系之间也可能有很大差异。从治愈感染流感病毒 RWSN PB 两种链球菌的细胞开始此方案，其链球菌标签在基因上与 PB 2 亚基的 C 末端融合，感染倍数为 3。

用冷 PBS 洗涤细胞一次，然后加入 12 毫升冷 PBS 并将其从培养皿中取出。使用橡胶刮刀。将细胞转移到 50 毫升锥形管中，并通过离心沉淀。

该程序最困难的方面是细胞分离方案。细胞核对匀浆和混合程序非常敏感，如果作不当，很容易破坏染色质提取物。因此，不仅要遵循均质化技术，还要遵循裂解物的一般处理，这一点非常重要，正如我们在这里展示的那样。

离心吸出后，PBS 和 Resus 将细胞沉淀悬浮在 10 毫升冷蔗糖缓冲液中。将 200 μL 移液器吸头连接到 10 mL塑料血清移液管上，使细胞穿过吸头以打碎细胞团块。将悬浮液在冰上孵育 10 分钟。

定期轻轻倒置细胞以重悬它们。接下来，添加非 IET P 40 至终浓度为 0.5%，并高速涡旋 15 秒，立即在 4 摄氏度下以 3， 500 倍 G 离心 10 分钟。离心后，取出旋腹肌并将其转移到 15 毫升锥形管中。

将旋后物储存在 4 摄氏度。这是一种细胞质组分。如此处所示，沉淀应比原始细胞沉淀更小、更白。

如果方案将在稍后完成，请将细胞沉淀储存在 4 摄氏度。否则，继续在 5 毫升冷蔗糖、缓冲液中洗涤沉淀，并像以前一样离心。离心完成后，丢弃螺旋物并重新悬浮沉淀，该沉淀在 1.5 毫升冷核质提取缓冲液中包含细胞核。

将重悬的沉淀转移到带有紧密配合的研杵的冷藏全玻璃 4 毫升 dance 均质器中，然后用 20 次冲程使细胞核均质化。为避免起泡，大约 10 次冲程后阻力应增加。为了确认有效的均质化，请在相差显微镜下检查样品。

原子核不应再是圆形的，而是具有不规则的形状，看起来好像已经破裂。细胞核均质化后，将其转移到 1.5 mL 微量离心管中。将匀浆放在旋转轮上以 4 摄氏度孵育 20 分钟。

然后在微量离心机中以 16， 000 倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心 10 分钟。离心后，将螺旋物（即核质组分）转移到 1.5 毫升的试管中，并将其储存在 4 摄氏度下。然后 Reese 将沉淀悬浮在 1.5 毫升消化中，缓冲预热至 37 摄氏度。

然后将馏分在 10 摄氏度下孵育 37 分钟。接下来，加入 42 微升 5 摩尔氯化钠，使氯化钠的最终浓度达到 150 毫摩尔，然后在冰上孵育 20 分钟。在 4 摄氏度的微量离心机中以 16， 000 倍、G 离心 10 分钟。

旋转后，取出旋后物并将其储存在 4 摄氏度。这是 CH one 50 馏分。Reeses 将沉淀在 1.5 mL 冷高盐缓冲液中弯曲，并在冰上孵育 20 分钟。

4 摄氏度的微量离心机中以 16， 000 倍、G 离心 10 分钟。旋转后，取出 sup natant 并将其储存在 4 摄氏度。这是 CH 500 馏分。

取出在分馏方案期间保存的级分，并将其置于冰上。然后向细胞质组分中加入 300 微升 5 摩尔氯化钠。然后将每馏分 100 μL 填充的 Sphero 珠中的 strep T 转移到 15 mL 锥形管中。

向珠子中加入 10 体积的链球菌洗涤缓冲液。倒置试管混合，以 1000 次离心 5 分钟。G 在台式离心机中，丢弃 sna。

重复缓冲液洗涤两次，然后 Reese 在等体积的链球菌洗涤缓冲液中弯曲沉淀，向每个级分中加入 200 微升洗涤的链球菌 Act 珠浆。在 4 摄氏度下旋转试管 1 小时。然后将试管以 4 摄氏度的 1000 倍 G 离心 1 分钟，弃去旋后液。

然后向微珠中加入 1 mL 洗涤缓冲液，用于在 15 mL 试管中与细胞质组分一起孵育的微珠。加入洗涤缓冲液，将磁珠转移到 1.5 mL 试管中。洗涤珠子 1 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心管 1 分钟。

在最后一个洗涤步骤后重复两次。使用扁平移液器吸头去除洗涤缓冲液的所有痕迹。然后加入 100 μL Elucian 缓冲液，轻轻混合并将试管置于冰上 15 分钟。

在孵育过程中，偶尔通过轻轻敲击试管底部来混合珠子。15 分钟后，离心选择在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心 1 分钟。收集含有洗脱链球菌标记的 VRP 的番泻叶。

He，我们的细胞用流感病毒株 WSN 感染 9 小时，并通过 western blossoming 分析分馏裂解物，如图所示。温和的细胞核分离可有效提取细胞质蛋白（如微管蛋白），同时避免释放丰富的细胞核蛋白。请注意，用低盐提取的染色质组分富含对转录很重要的蛋白质。

虽然高盐馏分主要包含核小体以确定洗脱的细胞质组分的蛋白质组成，但来自用未标记的病毒、RWSN 或 RWSN PB 两种链球菌感染 9 小时的 R 细胞的 V NPS 通过银染分析，如细胞质洗脱液所示。这里 NP 与 PA PB 1、PB 2 的比率很高，这与 95 到 100 道尔顿之间的条带相比，主带高于 55 道尔顿证明了这一点，这表明大多数链球菌 PB 2 作为完全形成的 VRNP 的一部分被纯化，或者换句话说，捕获很少的可溶性聚合酶以比较相对产量。如本银染凝胶 v RMP 所示，在用 RWSN PB、两种链球菌或 RWSN 或银染感染 9 小时后纯化的 VR NPS，可以在感染 9 小时后从所有四种细胞组分中纯化。

核质中发现最高浓度的 v RMP，尽管也可以从细胞质和染色质中纯化相当大的一部分。观看此视频后，您应该对如何从感染细胞的细胞核中纯化高产量的完整流感病毒核糖核蛋白复合物有很好的了解。执行此程序时，请务必记住使用干净的缓冲液，并避免将样品不必要地暴露在室温下，因为这样可以避免 RNA 和蛋白质降解，以及蛋白质复合物的分解。

别忘了，与传染性流感病毒打交道可能是危险的。所有步骤均应在生物安全二级工作台下进行，直到将 NP 40 添加到裂解物中。