两种异核体的形成方法，发现丙型肝炎病毒的制约因素

该程序的目的是研究限制因子对任何给定细胞系中丙型肝炎病毒复制周期完成的影响，使用两种依赖于 heca 形成的方法，第一种方法从培养人肝细胞开始，然后治愈 A 和 Hep 56 1D 包装细胞，然后通过电穿孔将丙型肝炎病毒或 H-C-V-R-N-A 转染到肝细胞中。随后在第二种融合方法中通过聚乙二醇将 HCV 复制细胞系 fsed 到相应的包装细胞系中。第一步是生产高滴度 HCV 原液。

然后共培养不同的细胞系，并通过转染原型泡沫状病毒糖蛋白诱导细胞融合。接下来，异源 carons 感染 HCV。在任一异质 carion 形成方法之后，进行荧光显微镜检查以确认融合并量化感染性颗粒的产生。

该技术的主要优点是它可用于筛选大量细胞系和原代细胞的 HV 特异性显性限制因子的表达。这种方法可以帮助回答有关 HCV 的物种特异性和名称的关键问题。该方法的视觉演示对于促进理解两个融合系统的基本概念至关重要 在聚乙二醇诱导细胞融合之前。

按照标准方案用 H-C-V-R-N-A 转染 HUH 7.5 细胞，并在第二天在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 24 小时。收获转染的含有亚基因组复制子的 HUH 7.5 细胞以及 heal R 和 he 56 1D 包装细胞。这些包装细胞经过工程改造，可在胰蛋白酶消化后异位表达 HCV 蛋白核心 E 1、E 2、P 7 和 NS 2，将细胞重悬于 DMEM 完全培养基中，将细胞悬液稀释至以下浓度，HUH 7.5 至 5 倍，10 至 5 个细胞/毫升，并愈合和 hep 56 个 1D 细胞至 2 倍 10 至 5 个细胞/毫升。

接下来，准备一个六孔培养板，每孔有 2 到 3 个无菌玻璃盖玻片。为了进一步分析融合效率，将 1 毫升转染的 HUH 7.5 细胞与 1 毫升包装细胞混合，并接种到六孔板的一个孔中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时，24 小时后。检查细胞密度。

在诱导细胞融合之前，细胞密度应在 60% 至 80% co fluency 之间，以便细胞靠近细胞膜，以融合来自共培养细胞的抽吸培养基并用 1 毫升 PBS 洗涤一次。然后小心地加入 500 微升预热的 40% 聚乙二醇或 PEG 1， 500。将 500 微升 PBS 加入另一个共培养细胞孔中作为对照，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟以诱导异质细胞形成，吸出 PEG，并在 1 分钟后小心加入 2 毫升 PBS，吸出 PBS 并加入 2 毫升新鲜 PBS 洗涤液和 PB S3 至 5 次，每次洗涤 1 分钟，以去除多余的 PEG。

最后，向每个孔中加入 2 mL DMEM、完全培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。融合后 48 小时。收集每个 SNAT 并通过 0.45 微米过滤器过滤，收集细胞培养物后，可以通过免疫荧光测定 SNAT 融合效率，用 1 毫升 PBS 洗涤含有玻璃盖玻片的孔一次，持续 1 分钟。

用 600 μL 3% Paraldehyde 的 PBS 溶液固定细胞 15 分钟。最后一次洗涤后，用 PBS 洗涤 3 次，每次洗涤 1 分钟。使用镊子小心地将盖玻片转移到含有 500 微升 0.5%Triton X 100 PBS 溶液的 24 孔板渗透性细胞中，持续 5 分钟。

随后用 PBS 洗涤 3 次，向每个溶液中加入 250 μL 一抗溶液。使用浓度为 0.5 μg/mL 的抗 NS 5 a 抗体和 6.4 ng/mL 的人单克隆抗 E two 抗体。45 分钟后在室温下孵育 45 分钟，用 PBS 洗涤 3 次。

接下来，向每个孔中加入 250 微升二抗，山羊抗小鼠或与 Alexa 5 46 或 Alexa 4 88 层偶联的二抗 IgG 特异性抗体用作每毫升 2 微克的浓度。30 分钟后，在室温下避光孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤一次。

随后，用 250 μL DPI 在 PBS 中稀释 1 至 3000 对细胞核进行染色。在室温下避光孵育 1 分钟，用 PBS 洗涤 4 次，用水洗涤 1 次。最后，将安装盖倒置在显微镜载玻片上的一滴植物上，让它们在黑暗中干燥。

要开始此过程，请收获并制备以下细胞的单细胞悬液。缺乏 CD 81 内源性表达的 Luna NA 人肝细胞系。He r 包装细胞和稳定表达人 CD 81 的 Hep 56 1D 细胞以 1 比 1 的比例与 He r 细胞共培养 Luna n 细胞，与 Hep 56 1D HCD 81 细胞以 1 比 2 的比例共培养 1.5 倍，每 12 个细胞中有 5 个细胞。

第二天在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。根据制造商的说明，使用 lipectomy 2000 用高度 FU 基因的 PFE 包膜蛋白瞬时转染细胞。转染 PFE 糖蛋白 30 小时后，用 350 μL 先前制备的病毒储液接种异源 caron，MOI 约为 2.3。

第二天早上在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 12 小时。用 PBS 洗涤一次，每孔加入 1 毫升 DMEM 完全培养基，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时，48 小时后收获异质 carion 培养物的旋囊，通过 0.45 微米过滤器过滤旋囊。接下来，使用螺旋酸盐接种前一天接种在 96 孔板中的 HUH 7.5 细胞，在有限稀释测定中孵育 72 小时，然后定量感染性后代颗粒的产生。

可视化融合事件的程序必须在共培养前 6 小时完成，用 5 毫升 PBS 洗涤贴壁细胞一次，然后每 10 厘米培养皿加入 4 毫升适当的 DI 溶液，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞 45 分钟，用 5 毫升 PBS 洗涤细胞一次，用 5 毫升 PBS 孵育 1 分钟，然后加入 DMEM 完全培养基，在 37 摄氏度下孵育 6 小时和 5% 的二氧化碳。在该种子之后，向 12 孔板的每个孔中加入盖玻片，并如前所述转染染色细胞。转染后 30 小时，用 1 mL PBS 小心洗涤细胞 1 分钟，然后在室温下用 250 μL 3% Paraldehyde 固定细胞 15 分钟。

一种方法是用 1 毫升 PBS 洗涤细胞一次 1 分钟，然后用 dappy 染色 1 分钟，然后用水 PBS 洗涤细胞一次，用水面封盖玻片、太阳镜、载玻片洗涤一次，以研究限制因素对 HCV 复制周期完成的影响。在异源蛋白中，HUH 7.5 细胞首先用表达荧光素酶转基因和 HCV 非结构蛋白的亚基因组复制子瞬时转染，然后共培养并融合到表达 HCV 结构蛋白核心和辅助蛋白的细胞系。在该图中描述了使用针对 E 2 结构蛋白和 NS 5 A 非结构蛋白的单克隆抗体的细胞或免疫染色的代表性结果。

上图中的图像显示，在用 MS 的 PEG 信号处理后，在同一细胞质中同时检测到 5 A 和 D，表明自融合。相比之下，下面板中的显示显示，当用 PBS 处理共培养细胞时，没有诱导融合。因此，未观察到信号的共定位以量化异源 carons snet 产生的病毒感染性，在融合诱导后 48 小时从共培养物中收集，并用于接种初始 HUH 7.5 细胞用于随后的荧光素酶测定。

在此图表中，显示了三个独立实验的 meme 值。灰色水平条表示在未感染的 HUH 7.5 细胞中确定的相对光单位或 RLU 的背景。值得注意的是，当 HUH 7.5 复制细胞与初始细胞系融合或用 PBS 作为对照处理时，在培养液中未检测到感染性。

然而，当 PEG 诱导 HUH 7.5 复制子和包装细胞系之间的细胞融合时，感染性病毒颗粒被释放到培养液中。这表明病毒生产需要包装细胞系中病毒蛋白的细胞融合和表达，不仅是 HUH 7.5 人肝癌细胞的异源，而且与人非活细胞和小鼠肝细胞的异源也允许病毒释放，这表明组装和释放不受这些细胞类型中可能的限制因子的主导抑制。在另一种方法中，细胞培养后基因糖蛋白的表达诱导体细胞融合。

通过在共培养和转染前用细胞追踪染料对单独的细胞系进行染色来观察异源蛋白细胞，在转染后 30 小时固定基因蛋白细胞并用 DPI 染色，代表性结果如图所示。两种细胞类型的融合由细胞质内染料均匀分布的异源携带表示，如此处所示。相比之下，下图中的图像显示没有细胞，双染色细胞质表明没有细胞融合。

最终图表显示，所有 HCV 进入因子仅在 Luna N 细胞的异源载体中表达，其中 hela 或 Hep 56 1D 细胞表达人 CD 81。在这里，培养物接种了感染性 HCV 颗粒。48 小时后收集培养液，并使用初始 HUH 7.5 靶细胞通过极限稀释测定法测定异源细胞中从头释放的颗粒，显示了三个独立实验的平均值，灰色水平条表示测定的检测限。

将 A 作为对照的月球 N 细胞与月球 N 细胞融合，导致感染性 HCV 水平非常低，接近检测限。当月球 N 细胞与初始 HEP 56 1D 细胞融合时，获得了类似的结果。在这两种情况下，人 CD 81 都不存在，因此 HCV 无法有效地感染异种。

相比之下，在具有 heer 的月球 10 细胞视图和与表达人 CD 81 的 HEP 56 1D 细胞融合的月球手细胞中观察到传染性病毒后代的从头产生大约是测定背景的 10 倍。这表明 HCV 在 RetroCars 中成功完成了其复制周期，从而排除了这些细胞系中显性限制因子的表达。一旦掌握，如果执行得当，可以在一周内完成完整的实验程序。

看完这个视频后，您应该对如何生成异质随身携带来识别可能的 HV 限制因素有一个很好的了解。不要忘记，与丙型肝炎病毒一起工作可能非常危险，在执行此程序时应始终考虑高生物安全性等预防措施。