Name: 两种异核体的形成方法，发现丙型肝炎病毒的制约因素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 49 s
Description: 学习两种异核体形成方法，用于筛选表达丙型肝炎病毒显性限制因子的细胞系。该技术通过聚乙二醇或原型泡沫病毒糖蛋白诱导细胞融合，结合荧光显微镜验证，为研究HCV组装机制及病毒生命周期提供有效工具。

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我们感谢Takaji Wakita和Jens Bukh分别提供JFH1和J6CF毒株。此外，我们感谢Charles Rice提供Huh-7.5细胞和9E10抗体，感谢Steven Foung提供针对E2的特异性抗体CBH-23，并感谢Twincore实验病毒学系全体成员给予的有益建议和讨论。

通过聚乙二醇介导的细胞融合
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在15 cm细胞培养皿中，使用完全DMEM（DMEM cplt）培养基培养Huh-7.5、HeLa以及Hep56.1D原始或包装细胞系12，该培养基为添加了2 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM。根据表1所示，对稳定细胞系施加适当的筛选条件。</li>
</ol>
2. HCV RNA 的转染
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 Huh-7.5 细胞（一个汇合的 15 cm 培养皿）两次，消化后重悬于含有 2 mM ATP 和 5 mM 谷胱甘肽的 Cytomix（120 mM KCl，0.15 mM CaCl2，10 mM K2HPO4 [pH 7.6]，25 mM HEPES，2 mM EGTA，5 mM MgCl2，用 KOH 调至 pH 7.6，并经滤膜除菌）中，细胞浓度为 1.5×107 个细胞/mL。</li>
	<li>取 400 μL 细胞悬液（6×106 个细胞），加入 10 μg HCV RNA（pFKi389Luc-EI/NS3-3'_JFH1_dg 13），使用电穿孔法转染。采用电极间隙为 0.4 cm 的比色皿，在 Gene pulser Xcell 系统（Biorad）上设置参数为 975 μF 和 270 V，按先前所述方法进行转染 14。</li>
	<li>立即将转染后的 Huh-7.5 细胞转移至 10 mL 完全 DMEM 培养基中，并将全部细胞悬液接种至一个直径为 10 cm 的培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。</li>
</ol>
3. 通过聚乙二醇诱导融合
<ol>
	<li>按照 2.1 中所述收获细胞，重悬于 DMEM cplt 培养基中，并稀释至 5×105 个细胞/mL。</li>
	<li>制备 Huh-7.5、HeLa 和 Hep56.1D 包装细胞的单细胞悬液，并分别稀释至 5×105 个细胞/mL、2×105 个细胞/mL 和 2×105 个细胞/mL。需注意，包装细胞在转导两种独立的慢病毒载体后，可异位表达丙型肝炎病毒（HCV）蛋白 core、E1、E2、p7 和 NS2，这两种载体分别转导 C-E1 和 E2-p7-NS2 表达盒13, 15。</li>
	<li>在 6 孔培养板中每孔放置 2–3 片无菌玻璃盖玻片，用于后续融合效率分析。</li>
	<li>将 1 mL 携带亚基因组复制子的转染 Huh-7.5 细胞与 1 mL 包装细胞混合，接种至 6 孔板的一个孔中，在 37 °C 及 5% CO2 条件下培养 24 小时。</li>
	<li>在此时间点，细胞密度应达到 60–80% 汇合度，以便在诱导细胞融合前使细胞紧密接触，利于细胞膜融合。</li>
	<li>吸除共培养细胞的培养基，用 1 mL PBS 洗涤一次，然后小心加入 500 μL 预热的 40% PEG-1500 或 PBS 作为对照，在 37 °C 孵育 5 分钟以诱导异核体形成。</li>
	<li>吸除 PEG 溶液，用 2 mL PBS 小心洗涤 3–5 次，每次洗涤 1 分钟（min），以去除多余的 PEG，最后每孔加入 2 mL DMEM cplt 培养基，在 37 °C 及 5% CO2 条件下继续孵育。</li>
	<li>融合后 48 小时，收集各孔上清液，经 0.45 μm 滤膜过滤。</li>
	<li>通过将无细胞培养液 500 μL 接种至 naïve Huh-7.5 细胞（8×104 个细胞/孔，接种于 12 孔板，接种前 24 小时铺板），随后检测荧光素酶活性14，以测定融合异核体中感染性病毒颗粒的产生情况。</li>
</ol>
4. 免疫荧光法测定融合效率
<ol>
	<li>收集细胞培养上清液后（第 3.8 节），用 1 mL PBS 洗涤含玻璃盖玻片的孔板 1 次，每次 1 分钟。后续所有步骤均应在室温（RT）下进行，每次洗涤使用 1 mL PBS，洗涤时间为 1 分钟。</li>
	<li>用 600 μL 含 3% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定细胞 15 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。用镊子小心将盖玻片转移至 24 孔板中。</li>
	<li>用 500 μL 含 0.5% Triton X-100 的 PBS 对细胞进行透化处理 5 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>在含 5% 山羊血清的 PBS 中配制一抗溶液。使用浓度为 0.5 μg/mL 的抗 NS5A 抗体（9E10）和浓度为 6.4 ng/mL 的人源单克隆抗 E2 抗体（CBH-23）。每孔加入 250 μL，于室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，然后加入 250 μL 用含 5% 山羊血清的 PBS 稀释的二抗——Alexa-Fluor 546 或 Alexa-Fluor 488 标记的山羊抗小鼠或山羊抗人 IgG 特异性抗体，终浓度为 2 μg/mL。于室温避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 1 次，随后加入 250 μL 用 PBS 按 1:3,000 稀释的 DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）染液对细胞核进行染色，于室温避光孵育 1 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 4 次，再用 H2O 洗涤 1 次，然后将盖玻片反向置于载玻片上的一滴 Fluoromount 封片剂液滴上，避光干燥后通过间接荧光显微镜观察样品。</li>
</ol>
通过瞬时转染原型泡沫病毒（PFV）糖蛋白实现融合
5. 病毒接种物的制备
<ol>
	<li>通过转染制备高滴度病毒储备液 体外 将转录的HCV RNA导入Huh-7.5细胞，并在48 h和72 h后收集细胞培养上清液，具体方法如前所述 14. 通过有限稀释法（TCID）测定病毒滴度50) 13.</li>
</ol>
6. 细胞培养及通过转染融合性PFV糖蛋白实现细胞融合
<ol>
	<li>根据表1中的说明，在含有适当筛选剂的DMEM完全培养基中培养Lunet N、HeLa和Hep56.1D hCD81细胞。</li>
	<li>按照步骤2.1所述方法消化细胞，用DMEM完全培养基制备单细胞悬液，并按适当比例（例如Hep56.1D hCD81细胞为1:2，HeLa细胞为1:1）将Lunet N细胞与HeLa或Hep56.1D hCD81细胞系共培养，总细胞密度为每12孔板1.5×105个细胞，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>次日，使用Lipofectamine 2000，按照制造商说明，用高融合活性的PFV包膜蛋白（pczHFVenvEM066 16）对细胞进行瞬时转染。</li>
</ol>
7. 感染实验
<ol>
	<li>转染后30小时，每孔加入350 μL病毒储备液（MOI约为2.3）感染异核体，持续12小时过夜；用PBS洗涤一次，每孔加入1 mL完全DMEM培养基。在37 °C、5% CO2条件下继续孵育48小时。</li>
	<li>收集异核体培养物的上清液，经0.45 μm滤膜过滤后，接种至前一天接种于96孔板（每孔1×104个细胞）的Huh-7.5细胞，进行有限稀释实验13。</li>
	<li>72小时后，使用HCV特异性抗体（NS5A；9E10）对感染的Huh-7.5细胞进行染色，以定量检测具有感染性的子代病毒颗粒的产生情况。</li>
</ol>
8. 细胞融合的观察
<ol>
	<li>为观察融合事件，用不含添加剂的 DMEM 培养基配制 5 至 10 μM 的 CellTracker 荧光染料溶液，并在共培养前 6 小时内完成以下步骤（见第 6.2 和 6.3 节）。</li>
	<li>用 5 mL PBS 洗涤贴壁细胞一次，然后每 10 cm 培养皿加入 4 mL 染色液，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 45 分钟（分别用 CellTracker Orange CMTMR 染色 Lunet N 细胞，用 CellTracker Green CMFDA 染色 HeLa 或 Hep56.1D hCD81 细胞）。</li>
	<li>用 5 mL PBS 洗涤细胞一次，持续 1 分钟，加入完全 DMEM 培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续孵育 6 小时。</li>
	<li>按照上述第 6.2 节所述方法进行染色细胞的铺板和转染操作，但在铺板前需在培养皿中预先放置盖玻片。</li>
	<li>转染后 30 小时，用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 1 分钟，然后在室温下用 250 μL 3% 多聚甲醛固定 15 分钟。用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，持续 1 分钟，按第 4.6 节所述用 DAPI 染色 1 分钟，再用 1 mL PBS 洗涤一次，持续 1 分钟，随后用 H2O 重复洗涤，将盖玻片封片于载玻片上（见第 4.7 节）。使用荧光显微镜观察细胞。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>细胞系</td>
			<td>来源</td>
			<td>培养基与筛选条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人</td>
			<td>Huh-7.5</td>
			<td>Huh-7 肝癌细胞系的亚克隆 17</td>
			<td>DMEM cplt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Huh-7.5 [CE1][E2p7NS2]</td>
			<td>通过慢病毒基因转移导入两个独立基因表达盒，稳定表达病毒蛋白 core、E1、E2、p7 和 NS2</td>
			<td>DMEM cplt + Blasticidin 5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Huh-7 Lunet N</td>
			<td>Huh-7 肝癌细胞系的亚克隆 9</td>
			<td>DMEM cplt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>HeLa</td>
			<td>宫颈腺癌细胞系（ATCC 编号：CCL-2）</td>
			<td>DMEM cplt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>HeLa [CE1][E2p7NS2]</td>
			<td>通过慢病毒基因转移导入两个独立基因表达盒，稳定表达病毒蛋白 core、E1、E2、p7 和 NS2</td>
			<td>DMEM cplt + G418 750 μg/mL；Blasticidin 5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠</td>
			<td>Hep56.1D</td>
			<td>原发性肝细胞癌（J. Encke 惠赠） 
			成年 C57BL/6J 小鼠</td>
			<td>DMEM cplt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Hep56.1D [CE1][E2p7NS2]</td>
			<td>通过慢病毒基因转移导入两个独立基因表达盒，稳定表达病毒蛋白 core、E1、E2、p7 和 NS2</td>
			<td>DMEM cplt + G418 750 μg/mL；Blasticidin 5 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Hep56.1D hCD81</td>
			<td>通过慢病毒基因转移稳定表达人源 CD81</td>
			<td>DMEM cplt + Blasticidin 5 μg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 所用细胞系的来源及培养条件说明 Cplt：完全培养基，G418：遗传霉素，h：人源。
9. 代表性结果
在本研究中，我们采用了两种不同的体细胞融合方法，可特异性地研究限制因子对异核体中丙型肝炎病毒（HCV）复制周期完成的影响。值得注意的是，通过两种不同类型细胞融合实现的反式互补条件性设计，确保了只有在人肝细胞与非许可性细胞系之间形成的真正异核体中，才能完成病毒组装（方法1）或病毒进入及完整的HCV复制周期（方法2）。
在第一种方法中，将对丙型肝炎病毒（HCV）高度易感的 Huh-7.5 细胞瞬时转染一种表达荧光素酶报告基因以及支持亚基因组 HCV RNA 复制的 HCV 非结构蛋白的亚基因组复制子（Huh-7.5 复制子细胞）。这些细胞与表达 HCV 结构蛋白 core、E1、E2 以及辅助蛋白 p7 和 NS2 的细胞系共培养并融合。图1A 展示了实验流程的总体示意图。重要的是，在 PEG 介导的融合后，所有病毒颗粒组装所需的蛋白均应存在于形成的异核体中，可通过针对各个病毒蛋白的免疫荧光染色加以验证。图1B 展示了一个典型的融合事件，在 PEG 诱导形成异核体后，可在同一细胞质中同时检测到 Huh-7.5 复制子细胞中表达的 NS5A 蛋白和 Huh-7.5[CE1][E2p7NS2] 包装细胞中表达的 E2 蛋白的信号。当共培养的细胞改用 PBS 处理时，未发生细胞融合，因此仅观察到单阳性细胞，且无信号共定位现象。此外，为验证报告基因的表达，我们进行了针对 core 和 E2 的特异性 ELISA 检测（此前已有详细报道15）。除对照包装细胞系 Huh-7.5[CE1][E2p7NS2] 外，我们还构建了 HeLa 和 Hep56.1D 包装细胞系，分别作为人非肝源性细胞和小鼠肝源性细胞的代表。在这些细胞中，HCV RNA 的复制效率较低，且尚未证实其能够完成病毒的组装与释放。图1C 展示了融合实验的结果。在诱导融合后 48 小时收集共培养上清液，并用于感染 naïve Huh-7.5 细胞，随后进行荧光素酶活性检测。值得注意的是，当 Huh-7.5 复制子细胞与 naïve 细胞系融合或以 PBS 处理作为对照时，培养液中未检测到感染性病毒颗粒。然而，当通过 PEG 诱导 Huh-7.5 复制子细胞与包装细胞系发生细胞融合时，复制子与组成型表达的结构蛋白之间发生反式互补，从而在形成的异核体中恢复了病毒的产生，并将具有感染性的病毒颗粒释放至培养上清中。因此，我们得出结论：病毒的产生依赖于细胞融合以及包装细胞系中病毒蛋白的表达。引人注目的是，不仅 Huh-7.5 人肝癌细胞形成的异核体能够释放病毒，与人非肝源性细胞（HeLa[CE1][E2p7NS2]）和小鼠肝源性细胞（Hep56.1D[CE1][E2p7NS2]）形成的异核体同样能够实现病毒释放，表明这些细胞类型中可能存在的限制性因子并未主导性地抑制病毒的组装与释放过程。包装细胞系中结构蛋白的表达以及病毒对靶细胞的真实进入能力已在 Frentzen et al. 15 中得到证实。
一种替代的细胞融合方法被用于分析可能影响病毒复制周期中细胞进入、RNA翻译和RNA复制阶段的限制因素，并排除转染Huh-7.5复制子细胞中高病毒载量会因饱和效应而妨碍限制因子检测的可能性。为此，我们建立了一种独立的检测方法，该方法基于将异核体接种HCVcc并检测 从头合成 这些细胞中的病毒产生。如图2A所示，在细胞共培养后，通过表达一种具有融合功能的糖蛋白来诱导体细胞融合。选择该方法是因为敏感性提高，可能是由于融合效率增加所致。在共培养前，使用CellTracker染料对不同的细胞系进行染色以可视化异核体。如图2B所示，细胞质内染料均匀分布的异核体表明两种细胞已发生融合。只有在Lunet N细胞与HeLa细胞或Hep56.1D hCD81细胞形成的异核体中，所有HCV进入因子均得到表达，从而选择性地使这些异核体对HCV细胞进入具有易感性。经HCVcc攻击后，HCV在异核体中实现了完整的复制，这一点从……可以明显看出 从头合成 子代感染性病毒颗粒的产量比检测背景水平高出约10倍（图2C）。作为对照，将Lunet N细胞与Lunet N细胞融合，结果显示仅检测到接近检测限的极低水平的感染性HCV。当Lunet N细胞与未经处理的Hep56.1D细胞融合时，也获得了类似结果。在这两种情况下，均缺乏人源CD81，因此HCV无法有效感染异核体细胞。在后两种情况中检测到的极低感染性可能归因于Lunet N细胞的低水平感染和/或接种物中残留的少量感染性病毒输入。相比之下，HeLa细胞和Hep56.1D hCD81细胞表达人源CD81，从而弥补了异核体中缺失的病毒进入因子，使HCV能够进入细胞。因此，在涉及这两种细胞系的异核体培养上清中检测到的感染性HCV水平升高约10倍，很可能反映了 从头合成 异核体中感染性病毒颗粒的产生。因此，我们得出结论：HCV复制周期的完成并不受限于这些细胞系中不存在显性HCV限制因子。
<img alt="病毒-细胞融合过程；示意图、显微镜结果、蛋白质相互作用的荧光素酶检测。" src="/files/ftp_upload/4029/4029fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 异核体中丙型肝炎病毒（HCV）组装与释放的反式互补作用。 （A）PEG介导细胞融合实验流程的示意图。将JFH1荧光素酶报告复制子Luc-NS3-5B通过电穿孔转染至 naïve Huh-7.5 细胞中。次日，收集细胞并与 naïve 细胞或稳定表达HCV核心蛋白、E1、E2、p7和NS2的包装细胞共培养。共培养24小时后，使用40% PEG处理诱导异核体形成，以PBS作为阴性对照。48小时后，收集无细胞上清液用于感染 naïve Huh-7.5 细胞。通过荧光素酶活性测定病毒的感染性。（B）为检测异核体，使用抗E2和NS5A的单克隆抗体对细胞进行免疫染色。细胞内同时表达两种蛋白提示发生了细胞融合。（C）进行荧光素酶检测以定量异核体产生的病毒感染性。数据表示三次独立实验的平均值及均值的标准差。水平条带表示在未感染的Huh-7.5细胞中测定的背景相对光单位（RLU）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4029/4029fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="HCV infection process diagram with cell tracking, viral transfection, and TCID&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; analysis." src="/files/ftp_upload/4029/4029fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 异核体接种后丙型肝炎病毒复制周期的完成。 （A）实验流程示意图。将缺乏CD81的Huh-7 Lunet N细胞与缺乏或表达人CD81的指定细胞系共培养。重要的是，这些后者细胞至少缺失一种HCV入侵因子，因此无法发生有效感染。次日，通过转染PFV的融合性病毒包膜蛋白启动细胞融合。30小时后，用感染性HCV颗粒攻击细胞。为检测这些异核体介导的细胞入侵、RNA复制及病毒产生能力，在接种后48小时测定无细胞培养上清中的释放感染性。为此，采用 naïve Huh-7.5 细胞作为靶细胞进行有限稀释实验（TCID50）。(B) 为检测异核体，细胞在共培养和转染前6小时用CellTracker Green或CellTracker Orange染色。30小时后，细胞经固定并用DAPI染色。(C) 将Lunet N细胞与HeLa细胞、未处理的Hep56.1D细胞或表达人CD81的Hep56.1D细胞进行融合。这些培养物接种HCVcc（MOI为2.3）。48小时后收集培养上清液 从头合成 异核体的颗粒释放通过TCID50测定50 使用 naive Huh-7.5 靶细胞。数据为三次独立实验的平均值。水平线表示检测方法的检测下限。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4029/4029fig2large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.

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<li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li>
<li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li>
<li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029(2011).</li>
<li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li>
<li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li>
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我们提出两种在培养细胞中诱导异核体形成的方法，用于分析阻碍丙型肝炎病毒（HCV）复制的显性负性限制因素。利用这些方法，我们排除了多种人非肝源性细胞系及小鼠肝源性细胞系中存在显性组成型表达或病毒诱导的限制因子的可能性。第一种检测方法主要用于分析限制因子是否阻碍HCV的组装及感染性子代病毒的释放。在该实验中，包装细胞与HCV复制子细胞发生融合，因此仅在包装细胞中表达的潜在限制因子只能接触到已含有大量病毒RNA的细胞质。此时，病毒RNA的翻译已完成，且已形成大量具有复制活性的HCV复制复合物，因而难以检测到可能存在的对HCV翻译或RNA复制的限制作用。事实上，这些细胞中高水平的复制子RNA可能导致限制因子无法被识别，也可能因病毒因子的饱和效应而妨碍对HCV组装和/或释放限制因子的检测。为克服这一局限性，我们开发了第二种方法 转-互补实验中，丙型肝炎病毒（HCV）的细胞进入仅在异核体中实现。因此，在这一更接近自然的环境中，病毒复制及后续感染性子代病毒的产生在异核体中启动并持续进行，从而使病毒复制机制直接暴露于融合细胞内表达的所有可能的限制性机制中。由于我们观察到 从头合成 在此系统中产生感染性病毒颗粒的结果表...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA，德国科&amp;#246;尔贝</td><td>A15151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-E2 (CBH23)</td><td>由 Steven Foung 惠赠 &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma，德国施泰因海姆</td><td>A2833-106</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma，德国施泰因海姆</td><td>G4251-1G</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>Invivo Gen，美国圣地亚哥</td><td>Ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>G418（遗传霉素）</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>11811-064</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇-1500</td><td>Roche，德国曼海姆</td><td>10783641001</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma，德国施泰因海姆</td><td>G9023-5mL</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-NS5A (9E10)</td><td>由 Charles Rice 惠赠 &lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 标记的山羊抗人 IgG</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>A21089</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>A10680</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CMTMR</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CMFDA</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Sigma，德国施泰因海姆</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>其他所有化学品</td><td>Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养耗材</td><td>Sarstedt，德国&amp;#252;姆布雷希特</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

发现丙型肝炎病毒限制因子的两种异核体形成方法

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

丙型肝炎病毒（HCV）是一种嗜肝病毒，其宿主范围仅限于人类和黑猩猩。尽管已在人非肝源性细胞系和小鼠细胞系中观察到HCV RNA的复制，但其效率极低，且需要利用表达显性抗生素筛选标记的HCV复制子构建体进行长期筛选程序1-5。因此，HCV的体外研究仅限于允许病毒进入并完成病毒生命周期的人肝癌细胞系。由于HCV具有狭窄的物种嗜性，目前尚无能够维持完整HCV复制周期的免疫健全小型动物模型6-8。HCV在非人细胞（例如小鼠来源的细胞）中复制效率低下，可能是由于关键宿主依赖因子的遗传不兼容性，和/或限制性因子的表达所致。
我们研究了在源自非肝组织的人细胞系或小鼠肝细胞系中，HCV的传播是否受到显性限制因子的抑制。为此，我们建立了两种独立的条件性系统 转-依赖于体细胞融合的互补方法。在这两种情况下，病毒复制周期的完成仅能在异核体中实现。因此，成功 转-互补作用，通过测量确定 从头合成 产生具有感染性的病毒子代，表明不存在显性限制因素。
具体而言，将携带荧光素酶报告基因的亚基因组HCV复制子转染至高度易感的人肝癌细胞（Huh-7.5细胞）中。随后，这些细胞与多种表达HCV结构蛋白（核心蛋白、包膜蛋白1和2（E1、E2））以及辅助蛋白p7和NS2的人源和鼠源细胞进行共培养并融合。当通过聚乙二醇（PEG）处理诱导细胞融合后，该培养体系释放出具有感染性的病毒颗粒，这些病毒颗粒能够以受体依赖的方式感染 naive 细胞。
为了评估主导性限制因素对完整病毒生命周期（包括细胞进入、RNA翻译、复制和病毒组装）的影响，我们利用了一种人肝细胞系（Huh-7 Lunet N细胞）。 9）缺乏CD81的内源性表达，而CD81是丙型肝炎病毒（HCV）进入细胞所必需的进入因子。在未外源性表达CD81的情况下，这些细胞基本上对HCV感染具有抗性。 10 重要的是，当与表达人源CD81但缺乏至少另一种关键病毒进入因子（即SR-BI、CLDN1、OCLN）的细胞共培养并融合时，仅产生的异核体具备感染所需的全套HCV进入因子。因此，为了分析显性限制因子是否抑制HCV复制周期的完成，我们将Lunet N细胞与多种来自人和小鼠且满足上述标准的细胞进行融合。当共培养的细胞被转染原型泡沫病毒（PFV）的高融合活性病毒包膜蛋白突变体后11随后用感染性HCV颗粒（HCVcc）进行攻击， 从头合成 观察到具有感染性的病毒产生。这表明丙型肝炎病毒（HCV）在异核细胞中成功完成了其复制周期，从而排除了这些细胞系中存在显性限制因子表达的可能性。这些新型的条件性 转-互补方法将有助于筛选大量细胞系和原代细胞，以检测其是否表达HCV特异性的显性限制因子。

我们描述了两种基于异核体形成的条件性反式互补丙型肝炎病毒（HCV）组装并完成完整病毒生命周期的方法。这些技术适用于筛选表达显性限制因子的细胞系，这些因子可阻止感染性HCV子代病毒的产生。

丙型肝炎病毒（HCV）是一种嗜肝病毒，其宿主范围仅限于人类和黑猩猩。尽管已观察到HCV RNA在……中复制

本实验的目的是通过两种依赖于细胞融合的方法，研究限制性因子对特定细胞系中丙型肝炎病毒（HCV）复制周期完成过程的影响。第一种融合方法的第一步是培养人肝细胞以及HeLa A和Hep 56 1D包装细胞。随后，通过电穿孔将丙型肝炎病毒（HCV）RNA转染至肝细胞中。接着，利用聚乙二醇将HCV复制的细胞系与相应的包装细胞系进行融合。第二种融合方法的第一步是制备高滴度的HCV病毒原液。随后将不同的细胞系进行共培养，并通过转染原型泡沫病毒包膜糖蛋白来诱导细胞融合。接着，将异核体感染丙型肝炎病毒（HCV）。在采用任一种异核体形成方法后，均通过荧光显微镜观察以确认细胞融合，并对感染性病毒颗粒的产生进行定量分析。该技术的主要优势在于，适用于对大量细胞系和原代细胞进行筛选，以检测其是否表达针对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性显性限制因子。该方法有助于解答有关HCV物种特异性和嗜性的重要问题。在使用聚乙二醇诱导细胞融合之前，对该方法进行可视化演示，对于帮助理解两种融合系统的基本原理至关重要。按照标准方案，将H-C-V-R-N-A转染至HUH 7.5细胞中，并于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，收集携带亚基因组复制子的转染HUH 7.5细胞，以及Heal R和Hep 56 1D包装细胞。这些包装细胞经基因工程改造，可异源表达HCV蛋白Core、E1、E2、P7和NS2。经胰蛋白酶消化后，用完全DMEM培养基重悬细胞，并将细胞悬液稀释至以下浓度：HUH 7.5细胞为每毫升5×10⁵个细胞，Heal和Hep 56 1D细胞为每毫升2×10⁵个细胞。接下来，准备一个六孔培养板，每孔放入两到三个无菌的玻璃盖玻片。为了进一步分析融合效率，将一毫升转染的 HUH 7.5 细胞与一毫升包装细胞混合，接种至六孔板的一个孔中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。24 小时后，观察细胞密度。诱导细胞融合前，细胞密度应保持在60%至80%融合度之间，以确保细胞相互靠近，便于细胞膜融合。吸除共培养细胞中的培养基，用一毫升PBS洗涤一次。随后，小心加入500微升预热的40%聚乙二醇（PEG 1,500）。另取共培养细胞的一孔，加入500微升PBS作为对照。在37摄氏度孵育五分钟，以诱导异核体形成。孵育后，吸除PEG溶液，小心加入两毫升PBS。一分钟后吸除PBS，再加入两毫升新鲜PBS，随后用PBS洗涤三至五次，每次一分钟，以彻底去除残留的PEG。最后，向每个孔中加入2 mL DMEM完全培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下培养48小时。融合后48小时，收集每孔的上清液（SNAT），并通过0.45 µm滤膜过滤。收集细胞培养上清液后，可通过免疫荧光检测融合效率。用1 mL PBS将含有玻璃盖玻片的孔洗涤一次，持续1分钟。用 600 微升含 3% 多聚甲醛的 PBS 固定

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

两种异核体的形成方法，发现丙型肝炎病毒的制约因素

本文描述了一种灵活且高效的方法，用于表征特定细胞类型中蛋白质的定位及核质穿梭。该异核体方法利用荧光标记的融合蛋白，在细胞融合后对蛋白质定位进行成像。该方案适用于稳态下的定位分析，也可结合活细胞成像用于更动态的过程研究。...

异核体技术用于细胞类型特异性定位分析

来源：Ren, S., et al. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp.

检测感染细胞中丙型肝炎病毒复制复合体的免疫荧光实验

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。...

丙型肝炎病毒复制分析方案

HIV-1 发病机制由病毒特性与宿主遗传因素共同决定。本文介绍一种可靠的方法，可实现可重复的测量，用于评估 gag 基因序列变异在 体外...

一种基于限制性内切酶的克隆方法用于评估 体外 HIV-1 C亚型Gag-MJ4嵌合病毒的复制能力

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外...

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

本文介绍了一种利用分裂荧光素酶检测系统筛选抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统可简便地检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于此类相互作用抑制剂的鉴定。...

利用分裂荧光素酶检测系统筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂

本文描述了一种在新型基因工程293T细胞（293T-NE-3NRs，表达人源NTCP、HNF4α、RXRα和PPARα）以及传统肝细胞（HepG2-NE，表达人源NTCP）中进行乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细实验方案。...

在非肝源性293T-NE-3NRs细胞中建立乙型肝炎病毒感染模型

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10...

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。...

一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

学习两种异核体形成方法，用于筛选表达丙型肝炎病毒显性限制因子的细胞系。该技术通过聚乙二醇或原型泡沫病毒糖蛋白诱导细胞融合，结合荧光显微镜验证，为研究HCV组装机制及病毒生命周期提供有效工具。

发现丙型肝炎病毒限制因子的两种异核体形成方法

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