Name: 一个人的调查输卵管模型 C。沙眼感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解利用人输卵管离体组织建立C. trachomatis感染模型的方法。该技术通过显微分析揭示衣原体诱导的细胞损伤机制，为研究生殖道感染病理及开发治疗策略提供重要实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由德国研究基金会（DFG）卓越集群“界面炎症”（RA-If, RA-D）资助。我们感谢Kristin Wischnat提供的出色技术协助。

1. 准备 沙眼衣原体 D型血清型菌株
<ol>
 <li> 在SPG缓冲液中，用4 ml C. trachomatis D感染含有HeLa-229细胞的175 cm2细胞培养瓶（细胞已长满单层）。 </li>
 <li> 在37 °C条件下振荡培养1小时。 </li>
 <li> 加入20 ml含10%胎牛血清（FCS）和240 μl环己酰亚胺的DMEM培养基。 </li>
 <li> 在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养48小时。 </li>
 <li> 加入5 ml无菌玻璃珠，剧烈振荡以使含有C. trachomatis的HeLa-229细胞脱落并破碎。 </li>
 <li> 收集上清液，并再加入5 ml无菌玻璃珠。 </li>
 <li> 摇动三次，每次1分钟，以彻底破坏所有HeLa-229细胞并释放C. trachomatis。 </li>
 <li> 在4 °C条件下以1000 rpmi离心5分钟，去除细胞碎片。 </li>
 <li> 收集上清液，用于感染8至10个已长满HeLa-229细胞的175 cm2细胞培养瓶。 </li>
 <li> 每个培养瓶中加入4 ml SPG缓冲液和4 ml前次感染所得的上清液，在37 °C持续振荡培养1小时。 </li>
 <li> 1小时后，加入15 ml含10% FCS和230 μl环己酰亚胺的DMEM培养基，随后在37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。 </li>
 <li> 加入5 ml无菌玻璃珠，振荡使含有C. trachomatis的HeLa-229细胞脱落并破碎。 </li>
 <li> 收集上清液，并再加入5 ml无菌玻璃珠。 </li>
 <li> 摇动三次，每次1分钟，以彻底破坏所有HeLa-229细胞并释放C. trachomatis。 </li>
 <li> 在4 °C条件下以1000 rpmi离心5分钟，去除细胞碎片。 </li>
 <li> 收集上清液。 </li>
 <li> 将40 ml上清液分装至50 ml Falcon管中，在4 °C以11000 rpmi离心99分钟。 </li>
 <li> 离心后弃去上清液，用1 ml SPG缓冲液洗涤沉淀。 </li>
 <li> 将沉淀重悬于1 ml SPG缓冲液中，分装为每管20 μl至1.5 ml Eppendorf管中，于-70 °C保存备用。所制备的储备液的生物学活性已在建立的HeLa-229细胞感染模型中得到验证。</li>
</ol>
2. 人类输卵管的制备
<ol>
 <li> 女性因子宫切除术而切除的输卵管组织（HFT），术后应立即置于含有5% FCS但不含抗生素的RPMI培养基中，于4 °C保存直至处理。本研究方案已获吕贝克大学伦理委员会批准（编号09-153）。纳入研究的女性年龄为34至53岁，既往无C. trachomatis感染史。输卵管组织于剖宫产术中应产妇要求行围产期绝育时，或因黄体期出现症状性子宫肌瘤行子宫切除术时采集。所有HFT样本均经PCR检测确认C. trachomatis阴性。</li>
 <li> 在含有5% FCS但不含抗生素的RPMI培养基的培养皿中解剖HFT。整个操作过程中，组织必须始终浸没在培养基中，以防干燥。</li>
 <li> 切除并弃去结缔组织及手术过程中受损的组织。</li>
 <li> 解剖后，用小型手术刀小心切开HFT。</li>
 <li> 为后续实验准备大小为0.5 cm × 0.5 cm至1 cm × 1 cm的组织块。</li>
 <li> 进行感染实验时，将HFT样本置于含5% FCS但不含抗生素的1 ml RPMI培养基中。使用5.5×105 IFU（包涵体形成单位）的C. trachomatis对HFT样本进行感染。</li>
 <li> 将HFT样本分别在37 °C、5% CO2和21% O2条件下，以及37 °C、5% CO2和2% O2条件下孵育24小时。</li>
 <li> 孵育结束后收集样本，并置于Monti固定液中，在4 °C下固定至少三天，随后进行扫描电镜（SEM）/透射电镜（TEM）制样。</li>
</ol>
3. 透射电镜用HFT样本的制备
<ol>
 <li> 进行透射电镜观察时，将样品从Monti's固定液中取出，切成2 × 2 mm至4 × 5 mm大小的组织块。剩余组织可用于扫描电镜。 </li>
 <li> 用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织块1小时。 </li>
 <li> 在1% (w/v) 四氧化锇水溶液中4℃过夜孵育。 </li>
 <li> 用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液清洗6次，每次5分钟，以去除多余的四氧化锇。 </li>
 <li> 使用梯度浓度的乙醇水溶液（v/v）进行脱水：30%乙醇2小时，40%乙醇2小时，50%乙醇2小时，60%乙醇2小时，70%乙醇过夜，80%乙醇2小时，90%乙醇1小时，95%乙醇1小时，100%乙醇1小时。 </li>
 <li> 用环氧丙烷洗涤2次，每次15分钟，随后转移至50% (v/v) 新鲜配制的Araldite（包含所有组分）与环氧丙烷的混合液中，4℃过夜孵育。 </li>
 <li> 转移至新鲜配制的Araldite（包含所有组分）中，至少孵育1小时。 </li>
 <li> 将样品转移至平底包埋模具中，并用Araldite充满模具。 </li>
 <li> 在60 °C下使Araldite至少固化48小时。 </li>
 <li> 包埋块修整后，在超薄切片机上使用玻璃刀或Histodiamond刀切取半薄切片（700 nm），并用Richardson染色法染色。 </li>
 <li> 使用金刚石刀切取超薄切片（约70 nm），并转移至铜网上（例如150目方格铜网）。 </li>
 <li> 在自动切片染色仪中，用0.5% (w/v) 醋酸铀在纯水中的溶液染色，随后用3% (w/v) 柠檬酸铅在纯水中的溶液染色。或者，可手动染色：将铜网置于经离心饱和的醋酸铀水溶液中染色15分钟，随后在0.3% (w/v) 柠檬酸铅水溶液中染色。 </li>
</ol>
4. 扫描电镜用HFT样本的制备
<ol>
 <li> 进行扫描电镜观察时，将样品从Monti's固定液中取出，将其上皮面朝上置于1.5 × 1 cm的软木片上，并用昆虫针固定位置。</li>
 <li> 将带有样品的软木片转移至合适的金属篮中，用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液清洗30分钟。</li>
 <li> 通过将样品依次浸入浓度递增的丙酮/水混合液（v/v）中去除水分：30%丙酮处理6小时，40%处理6小时，60%处理8小时，70%过夜，80%处理2小时，90%处理2小时，100%丙酮过夜（务必确保样品始终完全浸没）。</li>
 <li> 将样品转移至新鲜的100%丙酮中，随后采用临界点干燥法进行干燥（温度40 °C，压力80 bar）。</li>
 <li> 取出昆虫针和软木片，将样品上皮面朝上用导电碳胶粘附于配备导电碳片的扫描电镜样品台，并使用液态导电银胶增强样品台与导电碳片之间的导电性。</li>
 <li> 使用溅射镀膜仪在样品表面制备一层导电的铂、金或钯镀层。</li>
</ol>
5. 使用Richardson染色法对半薄切片进行染色
<ol>
 <li> 将半薄切片在载玻片上晾干。</li>
 <li> 在60 °C条件下，用染色液对切片染色1-2分钟。</li>
 <li> 用去离子水清洗。</li>
 <li> 干燥切片并封片。</li>
</ol>
6. 代表性结果
在人类输卵管感染模型中，我们能够在常氧条件下观察到未感染对照组（图1）与C. trachomatis感染的输卵管（图2）之间上皮形态的差异。特征性的形态学变化提示病原体诱导了输卵管上皮细胞的肿胀和裂解，而这些现象在未感染的对照组中未被检测到。通过半薄切片和透射电子显微镜观察，我们证实了在ex vivo感染的人类输卵管组织中存在C. trachomatis的胞内包涵体形成（图3, 5），而在未感染的对照组中则未见此现象（图4）。由于女性生殖道在生理状态下氧浓度已较低11，且在炎症过程中会进一步下降，因此我们也在低氧条件下对本模型进行了研究。初步结果表明，该模型可用于分析不同氧浓度下沙眼衣原体的生长及其子代产生情况。由衣原体引起的上皮细胞损伤需与感染前因输卵管操作或处理不当所导致的人为假象相区分（图6）。
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="花粉粒的扫描电子显微镜图像，展示其表面纹理和形态。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 人类未感染输卵管在对照培养基中孵育一天后的扫描电子显微镜（SEM）图像（绿色箭头指示纤毛细胞，蓝色箭头指示非纤毛细胞）。
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="扫描电镜图像，细胞膜结构，3 μm 比例尺。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 感染后一天的人类输卵管组织中ex vivo C. trachomatis感染的扫描电镜（SEM）图像（白色箭头标记破裂的包涵体）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="组织学，细胞样本显微镜图像；细胞结构和形态分析，比例尺为10µm。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 半薄切片显示人输卵管在体外感染C. trachomatis后1天典型的细胞内包涵体（白色箭头）。
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="电子显微镜下的细胞结构，显示细胞器和细胞膜，比例尺为5 µm。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 对照培养基中孵育一天后的非感染人输卵管组织的透射电子显微镜（TEM）图像。
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="细胞结构显微镜图像，超微结构，透射电镜分析，细胞器，细胞生物学。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 感染后一天的人类输卵管组织中ex vivo C. trachomatis感染的透射电子显微镜（TEM）分析结果（白色箭头指示沙眼衣原体包涵体）。
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="显微镜，电子显微照片；细菌生物膜结构；表面形态；微生物研究；500 µm 比例尺。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 由于标本制备和处理不当导致的输卵管上皮损伤的扫描电子显微镜（SEM）图像（白色箭头标记破坏的上皮组织）。

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
<li>Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeipert%2C+JF+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 349, 2424-2430 (2003).</li>
<li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubal+factor+infertility%2C+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li>
<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
<li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

声明无利益冲突。

病原体感染组织所导致的损伤可视化十分困难，通常仅限于小鼠的实验性研究。我们建立了一种人输卵管组织的ex vivo感染模型，用于分析沙眼衣原体（C. trachomatis）对女性上生殖道的感染。利用该方法，我们能够在感染后一天内观察到C. trachomatis对人输卵管上皮造成的损伤。细胞肿胀和裂解是感染组织中典型的形态学改变，在C. trachomatis感染的输卵管中可见，但在未感染的对照组中则不存在。透射电镜（TEM）分析显示，衣原体在感染组织内表现出典型的胞内发育周期，可见含有再分化为原体（elementary bodies）的大包涵体，同时也存在含有体积增大的网状体（reticulate bodies）的小包涵体，后者可能提示持续性感染状态。然而，仅凭形态学特征尚不足以区分复制性感染与持续性感染，后者以代谢降低和对抗微生物药物的耐受性增强为特征10。
感染输卵管上皮细胞的破坏，是由于C. trachomatis感染的上皮细胞在完成胞内发育周期后破裂并释放出具有感染性的原体，或由于促炎性细胞因子的释放所致8。病原体引起的组织损伤以及宿主针对C. trachomatis产生的免疫反应，被认为是导致上皮细胞功能丧失、成纤维细胞重构以及最终引发输卵管性不孕的主要因素in vivo8,11。
该模型的主要局限性之一是缺乏炎症细胞，这阻碍了对C. trachomatis初次感染输卵管上皮后继发效应的分析。然而，该模型适用于研究不同环境条件（如氧含量）以及急性C. trachomatis感染中初始的宿主免疫反应8,9。下一步计划是建立一个在完整的人类输卵管中测试抗微生物药物对抗C. trachomatis的模型，并通过双光子激光扫描显微镜对在输卵管上皮中观察到的不同发育阶段的代谢状态进行表征。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-843</td><td></td></tr><tr><td>RPMI </td><td>PAA</td><td>R15-802</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma - Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG缓冲液</td><td>多种来源</td><td></td><td>见下方配方</td></tr><tr><td>Monti固定液</td><td>多种来源</td><td></td><td>见下方配方</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液</td><td>多种来源</td><td></td><td>见下方配方</td></tr><tr><td>Richardson染色液</td><td>多种来源</td><td></td><td>见下方配方</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">配方：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">1. SPG缓冲液&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 加入75 g蔗糖。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入2.47 g磷酸氢二钠。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入0.36 g磷酸二氢钠。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入0.72 g谷氨酸。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 用去离子水定容至1 L。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 调节pH至7.3。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">2. 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.35。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 加入42.80 g二甲基胂酸钠。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入68.46 g蔗糖。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 用去离子水定容至1 L，得到0.2 M二甲胂酸钠缓冲液。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 使用前用去离子水稀释至所需浓度，必要时调节pH至7.35。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">3. Monti固定液&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 加入156 ml 0.12 M二甲胂酸钠缓冲液。3.2 加入25 ml 25%戊二醛水溶液。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入19 ml 10%多聚甲醛水溶液。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 加入3 ml 3% CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;水溶液。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; 调节pH至7.35，并用去离子水定容至312 ml终体积。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">4. Richardson染色液&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 将1%亚甲蓝的1%硼砂水溶液与1%伊红II的去离子水溶液等体积混合。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

用于研究的人类输卵管模型 c. trachomatis 感染

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，C. trachomatis）引起的生殖道感染是全球女性中最常见的性传播疾病。病原体清除不力或持续存在可能导致上生殖道的上行感染，并引发感染组织的慢性炎症性损伤1,2。因此，可能出现严重的临床后遗症，如盆腔炎性疾病（PID）、输卵管阻塞和不孕症3,4。
目前对C. trachomatis的大部分研究都是在上皮细胞系（例如 HEp-2 细胞和 HeLa-229 细胞）或小鼠中进行的。然而，与基于细胞培养的模型一样，这些模型既不能反映天然组织的生理状态，也无法真实再现C. trachomatis在生殖道感染中的体内病理生理过程5。此外，由于调控衣原体内在生长的关键信号通路（例如干扰素-γ介导的JAK/STAT信号通路）在小鼠与人类之间存在根本性差异，进一步限制了这些模型的应用6,7。因此，我们及其他研究团队建立了完整的输卵管器官模型，以在离体条件下研究C. trachomatis与人类输卵管细胞之间的直接相互作用8,9。
为此，收集了接受子宫切除术女性的人类输卵管组织，并用沙眼衣原体D血清型（C. trachomatis serovar D）进行感染。感染后24小时内，采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析样本，以检测沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）引起的上皮损伤以及输卵管组织中C. trachomatis包涵体的形成情况。

我们描述了一种 离体感染 用于可视化细菌病原体与人类输卵管细胞直接相互作用的模型。该全器官组织模型的建立旨在进行相关研究 C. trachomatis 在“类生命”条件下诱导女性输卵管的病理变化。

用于研究的人类输卵管模型 C. trachomatis 感染

沙眼衣原体（C. trachomatis）引起的生殖道感染是全球女性中最常见的性传播疾病。低效的……

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）是一种革兰氏阴性专性细胞内寄生细菌。已知存在多种不同的衣原体血清型，可引起眼部或生殖道感染。由沙眼衣原体引起的生殖道感染是全球最常见的性传播疾病。1990年至2009年间，欧盟报告的感染病例接近300万例，其中2009年报告了近40万例。尽管公共卫生和性教育水平在不断提高，但生殖道沙眼衣原体新发感染病例数仍从1990年的7万例上升至2009年的40万例。所有新发感染病例中有75%报告发生在15至24岁的年轻人中。临床后遗症被认为源于病原体清除不力，可能导致感染从下生殖道向上蔓延至上生殖道，进而引起受感染组织的慢性炎症损伤。感染沙眼衣原体（chlamydia tracheitis）的女性中有10%至30%会发展为盆腔炎性疾病（PID），而多达50%的PID病例归因于沙眼衣原体感染。因此，在50%的输卵管性不孕患者和40%的异位妊娠患者中，可发现沙眼衣原体是致病病原体。在健康未感染女性中，受精卵经输卵管迁移至子宫，并在子宫内发育直至分娩。在感染患者中，沙眼衣原体可从下生殖道上行至输卵管，引发慢性炎症过程。病原体诱导的上皮细胞损伤以及中心上皮细胞功能的丧失，最终可能导致输卵管阻塞，从而减少或完全阻碍卵子从卵巢向子宫的运输。为此，收集接受子宫切除术女性的人输卵管组织并进行保存。随后对输卵管进行解剖并小心打开。根据实验设计，在相应时间点后，将组织切成小块样本，并用感染性鹦鹉热衣原体原体感染 24 至 48 小时。样本需用 Monty 固定液固定至少三天，直至进一步处理。子宫切除术女性的人类输卵管 HFT 应在术后立即保存。在4摄氏度、含5%FCS但不含抗生素的RPMI中保存，直至进行处理。整个操作过程中，在含有5%FCS但不含抗生素的RPMI培养液的培养皿中解剖人输卵管。组织应完全浸没在培养液中以防止干燥，剪除并丢弃结缔组织以及手术过程中受损的组织。解剖后，用小手术刀小心切开HFT。避免因使用镊子和手术刀操作不当而造成组织损伤。将组织切成5毫米×5毫米的小块用于感染，将HFT样本置于1毫升含5% FCS但不含抗生素的RPMI中，并加入C track。OMAS 原体 HFT 标本在普通培养箱中于 37 摄氏度、5% CO2 和 20% O2 条件下孵育，或在低氧环境（低于 5% O2）的缺氧室中孵育，最长孵育时间为 48 小时。在相应的孵育时间点后，收集标本并置于 Monty 固定液中，在 4 摄氏度下保存至少三天，直至进行扫描电镜或透射电镜的制样处理。固定后的组织被切成小块，经洗涤后与 1% 锇酸和四氧化锇在 4 摄氏度下孵育过夜。经过多次清洗和干燥步骤后，将脱水的样本转移至新配制的树脂中，在60摄氏度下聚合48小时。修块后，分别切取半薄切片和超薄切片，并将其转移至载玻片或载网上。染色后，可使用光学显微镜对半薄切片进行观察，以用于透射电子显微镜分析。将标本从Monty's固定液中取出，切成最多2×2×5毫米的组织块。随后进行洗涤，用碳酸钠CCO稀释缓冲液孵育，再经四氧化锇处理、洗涤、脱水，并通过梯度浓度的乙醇脱水后，将标本转移至50%环氧丙烷与aite的混合液中，过夜。次日，将标本转移至新配制的aite中，孵育至少一小时。然后转移至平底模具中，加入AITE并让AERD DITE在60摄氏度下聚合48小时。待包埋样品修整后，使用配备玻璃刀或更优选用金刚石刀的超薄切片机，切出约700纳米的半薄切片或70纳米的超薄切片。通过光学显微镜和透射电子显微镜对半薄和超薄切片进行观察分析，用于扫描电子显微镜检测。将标本以表皮朝上的方向用大头针固定在软木板上，用浓度递增的丙酮进行清洗和脱水。经临界点干燥器干燥后，将标本转移至扫描电镜样品台，并使用溅射镀膜仪镀上铂、金或钯。随后即可在扫描电子显微镜中进行扫描电子显微分析。将标本从Monty's固定液中取出，置于软木板上，使上皮面朝上，并用昆虫针固定位置。用碳酸钠缓冲液洗涤后，经丙酮处理，再使用临界点干燥仪将标本干燥。将标本从软木板转移至扫描电镜样品台后，采用溅射镀膜仪为标本镀上导电的铂、金或钯涂层，随后将镀膜后的标本转移至扫描电子显微镜中进行进一步分析。女性淋球菌感染的高发病率以及上行性感染所导致的巨大临床后果，是加强该领域基础与转化研究的合理依据。我们采用了此前由 St.Perus 团队建立的人类输卵管离体组织模型，以对沙眼衣原体在输卵管中诱导的细胞损伤进行形态学表征。通过该方法，可观察到不同发育阶段的胞内包涵体形成，同时可见复制期与持续性感染状态。然而，关于人类输卵管组织中存在持续性沙眼衣原体的实验性证据仍然缺乏，需要进一步分析沙眼衣原体本身、其子代以及持续性相关基因的转录上调情况。该模型的主要局限之一是缺乏炎症细胞，这阻碍了对初始KLA青光眼感染所引发的继发性效应的分析。然而，该模型似乎适用于分析输卵管上皮细胞损伤背景下诸如氧含量等环境因素，以及针对急性青光眼感染的初始宿主免疫反应。 未来目标之一是在pH值人输卵管组织模型中建立更为精细的CTU药敏试验模型，并利用双光子激光扫描显微技术，通过该模型从代谢角度明确定义CLI的不同发育阶段。

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

一个人的调查输卵管模型<em&gt; C。沙眼</em&gt;感染

输卵管（FT）被认为是浆液性卵巢癌（SOC）的另一个起源部位。本方案描述了一种用于分离和培养输卵管上皮细胞的新型方法。 离体 输卵管上皮细胞的培养。该系统可重现 体内...

离体 原代人输卵管上皮细胞的培养

Trichuris muris 感染：肠道2型免疫与炎症的一个模型

来源：O'Brien, V. P., 等，小鼠膀胱暴露于Gardnerella vaginalis诱发反复性大肠杆菌尿路感染。J. Vis. Exp.

小鼠膀胱组织样本制备以可视化细菌感染

来源：Ocean E. Clarke1, Romy A. Dop1, Tom Hasell1, Joanne L. Fothergill1, Daniel R. Neill21利物浦大学,...

一种用于模拟导管相关性尿路感染的3D打印硅胶涂层装置

本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia...

经尿道插管与细菌接种建立雄性小鼠尿路感染模型

建立雌性小鼠尿路感染模型

已建立的小鼠经尿道插管模型可用于研究膀胱病理状态，包括尿路感染，但该模型仅适用于雌性小鼠。本文介绍一种新的雄性小鼠经尿道灌注模型，将有助于推动在临床上和流行病学上存在显著性别差异的领域的研究。...

小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

我们探索了一种通过手术切除后直接取样输卵管进行细胞学检查的方法，作为卵巢癌早期检测的工具。本文中，我们介绍了一种从新鲜获取的手术标本中收集输卵管细胞的方案。...

输卵管细胞学作为卵巢癌早期检测的有前景工具

一种尿路致病性小鼠模型 E. coli (UPEC) 经尿道接种以建立潜伏性胞内膀胱储存库及随后的膀胱暴露于 G. vaginalis...

复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

本方案描述了一种从人类输卵管上皮组织中分离上皮细胞的一日法。分离得到的上皮细胞可用于二维（2D）培养，或解离为单细胞悬液，进而应用于后续实验，包括流式细胞术和单细胞RNA测序。...

一种高效提取人输卵管上皮细胞用于单细胞分析的方法

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

了解利用人输卵管离体组织建立C. trachomatis感染模型的方法。该技术通过显微分析揭示衣原体诱导的细胞损伤机制，为研究生殖道感染病理及开发治疗策略提供重要实验基础。

用于研究的人类输卵管模型 C. trachomatis 感染

探索更多视频