Name: 一个从人体细胞分泌蛋白生产的方便，一般的表达平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学习利用HEK 293T细胞表达分泌蛋白的高效方法，通过转染和无血清培养基实现重组蛋白生产。该平台支持Western blot检测，并可扩展至十层细胞工厂进行大规模制备，适用于结构功能研究与治疗开发。

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本研究得到了安大略省艾滋病治疗网络研究运营资助（ROG-G645）和加拿大卫生研究院新研究员奖（MSH-113554）对 JEL 的支持，以及多伦多大学对 HA、FCA 和 JDC 的博士后奖学金资助。作者谨此感谢斯克里普斯研究所（美国加利福尼亚州拉霍亚）的 Marnie Fusco、Dafna Abelson 和 Erica Ollmann Saphire 博士提供细胞、埃博拉病毒 GP 表达载体以及总体建议。

1. 准备工作——构建体与细胞培养
在开始实验方案之前，应针对哺乳动物细胞中的表达对目标基因进行密码子优化，并使用标准的分子生物学技术将其克隆至合适的表达载体中。为了最大限度提高成功表达的可能性，应构建目标基因的多个变异体。目前市面上有多种哺乳动物表达载体可供选择，这些载体带有不同的纯化标签（如多聚组氨酸、血凝素、链霉亲和素、HALO-Tag、谷胱甘肽S-转移酶等）。我们倾向于使用pDISPLAY载体，该载体包含强效的人巨细胞病毒启动子、Ig κ分泌信号序列、血凝素纯化标签，并具有C端跨膜锚定序列，可引导蛋白通过分泌途径定位于细胞质膜表面。通常我们在载体编码的跨膜锚定序列前方插入一个终止密码子，以使蛋白能够分泌至条件培养基中。
人胚胎肾（HEK）293T细胞广泛可得，易于培养和转染。HEK 293T细胞通常用于表达哺乳动物蛋白，但具有生物危害性，应于生物安全二级条件下操作。请穿戴适当的个人防护装备；操作应在经认证的生物安全柜内采用无菌技术进行。所有废弃物和工作表面应根据机构和政府指南进行消毒。建议在使用前检测细胞是否存在支原体污染。可通过环丙沙星（10 μg/ml）处理细胞十天以清除任何支原体属污染源。 HEK 293T细胞的常规传代培养方案另见（方框1）。
有关测试规模和大规模蛋白质表达的其他注意事项已在文献11-15中综述。
2. 小规模测试表达
在完成载体构建并制备后，可使用 HEK 293T 细胞进行小规模测试转染；以下示意图总结了该过程（图 1）。
<ol>
 <li>使用 T75 cm² 培养瓶2 或 T225 cm²2 细胞培养瓶（根据需进行的检测表达数量而定），用于培养 HEK 293T 细胞，并在细胞融合度达到 100% 时每 2–3 天传代一次（盒子 1).</li>
 <li>接种 2.5 × 105 6 孔板中每孔接种 HEK 293T 细胞，每孔加入 2 ml 含 1× 青霉素-链霉素和 10% (v/v) 胎牛血清的 DMEM 培养基，轻轻摇动培养板以确保各孔中细胞均匀分散，于 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜 37 °C 在5% CO2 加湿孵育盒</li>
 <li>当 HEK 293T 细胞达到 40% 汇合度时，弃去培养基，向孔中加入新鲜的 2 ml DMEM，含 1× 青霉素/链霉素和 10% (v/v) 胎牛血清。进行转染实验。</li>
 <li>等分试样 90 μl 无血清DMEM加入无菌的1.5 ml微量离心管中。用移液器吸取 3 μl 将GeneJuice加入无血清DMEM中，轻轻混匀（手指涡旋）。室温孵育5分钟。</li>
 <li>添加 1 μg 微型质粒DNA纯化（质粒DNA储备液浓度 = 100 ng/μL）μl) 加入 DMEM-GeneJuice 混合液中，用手指轻弹混匀，室温孵育 15 分钟。</li>
 <li>将转染混合物逐滴加入HEK 293T细胞中，轻轻摇动6孔板以使转染混合物均匀分布。将6孔板置于 37 °C 在5% CO₂环境中2 加湿孵育盒</li>
 <li>转染后24小时，向每孔加入1 ml新鲜DMEM培养基（含1×青霉素/链霉素和10% (v/v) 胎牛血清），继续培养48小时（总计72小时）。</li>
 <li>转染后三天，从每个孔中收集1 ml上清液，于室温下以16,000 g离心10分钟。随后按照文中所述步骤进行蛋白质印迹分析 盒 2. 样品可在以下条件下保存： 4 °C储存时长 4 °C 依赖于蛋白质。</li>
</ol>
3. 大规模测试表达与纯化
一旦确定了构建体，即可通过PEI转染贴壁的HEK 293T细胞，在10层细胞工厂（图2；表面积6360 cm2）中实现毫克级重组蛋白的表达。对于更初步的探索性研究，可使用较小的细胞工厂或T形瓶（表1）。
<ol>
 <li>使用MaxiPrep质粒纯化试剂盒纯化1 mg用于转染的DNA。500 ml的XL-1 Blue菌过夜培养物应至少产生1 mg的高纯度DNA。通过测定A260/A280比值检测DNA纯度，比值应高于1.8。</li>
 <li>将HEK 293T细胞扩增至2.0 × 108个细胞。每个T225 cm2培养瓶在100%汇合时平均含有约2.25 × 107个细胞。</li>
 <li>向10层细胞工厂中加入1.2 L含5% (v/v) 胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将2.0 × 108个HEK 293T细胞加入细胞工厂，并均匀分布至所有层。在细胞工厂中很难观察细胞的汇合度。作为替代方法，可使用与10层细胞工厂相同细胞数与表面积比例，在T75 cm2培养瓶中接种适量细胞，并监测该培养瓶中的细胞生长速率。有关细胞工厂操作的指导，请参见相关视频。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，以促进细胞贴壁和生长。</li>
 <li>当贴壁的HEK 293T细胞达到70%汇合时进行大规模转染。在生物安全柜中，使用无菌T75 cm2培养瓶配制PEI-DNA转染混合物（PEI与DNA的质量比为3:1）。将0.84 mg DNA与84 ml无菌1× PBS混合，然后加入2.5 ml PEI（总PEI量为2.5 mg）。室温孵育15分钟，溶液应变浑浊。</li>
 <li>缓慢将PEI-DNA转染混合物倒入细胞工厂，并均匀分布至所有层。可选：为提高表达产量，可加入丙戊酸（终浓度为4 mM）。于37 °C、5% CO2条件下孵育四天。</li>
 <li>转染后第四天收集上清液。将条件培养基在4 °C下以6000 × g离心30分钟。进一步使用0.22 μm Stericup真空滤器装置过滤上清液。10层细胞工厂可重复使用，清洁方法见方框3。关键是在收集上清液后立即开始清洗；切勿让细胞在容器表面干燥。</li>
 <li>使用Centramate切向流过滤系统将上清液浓缩至75 ml。</li>
 <li>加入500 ml PBS，再次浓缩至75 ml。重复此步骤三次，以完成样品的缓冲液置换。</li>
 <li>用1× PBS平衡1 ml抗HA亲和柱，并以重力流方式以<1 ml/min的流速上样浓缩后的样品。</li>
 <li>用30 ml 1× PBS-Tween20洗涤亲和柱。</li>
 <li>将HA肽溶解于1× PBS中（终浓度为1.0 mg/ml），并在37 °C下孵育。</li>
 <li>将1 ml HA肽溶液加入抗HA亲和柱，使肽溶液流入树脂。收集穿流液。当肽溶液到达柱床高度时停止流速。</li>
 <li>将整个抗HA亲和柱在37 °C下孵育15分钟。</li>
 <li>重复步骤12两次。</li>
 <li>向抗HA亲和柱中加入1 ml 1× PBS，使其流入树脂直至达到柱床高度。收集穿流液。</li>
 <li>用10 ml 0.1 M甘氨酸（pH 2.2）再生抗HA亲和柱。随后用10 ml PBS洗涤，并将亲和柱保存于含0.02% (w/v) NaN3的PBS中，4 °C储存。</li>
 <li>进行SDS-PAGE分析，并根据结果合并相应组分。注意：HA肽会干扰通过A280或Bradford法测定的蛋白浓度。为估算蛋白含量，可在SDS-PAGE凝胶上分别上样5、10、15、25 μg的BSA作为标准品，并比较条带强度。</li>
</ol>
可重复步骤 9-17 以从条件培养基中捕获更多的蛋白质。
4. 代表性结果
本文介绍并展示了一种便捷的表达平台，可用于生产毫克级的人源蛋白，进而用于结构与功能研究。利用6孔板中的HEK 293T细胞对人源蛋白构建体进行筛选，能够高效且有效地识别出适用于大规模表达的构建体。商业化的表达载体可通过多种转染试剂（如GeneJuice、FuGene HD或PEI）在HEK 293T细胞中高效转染。我们建议在测试表达时使用商业转染试剂（如GeneJuice或FuGene HD），因为这些试剂对表达水平较低的蛋白更具效果（图3）。用于大规模表达的构建体应通过Western blot鉴定，表现为单一且信号强的条带，并对应预期的分子量（图3）。由于糖基化存在异质性，糖蛋白可能呈现较宽的条带。我们已证实，多种大分子物质，包括病毒糖蛋白、细胞因子、细胞因子受体及其他表面蛋白，均可利用该通用表达平台进行表达与纯化，获得毫克级的蛋白产物（图4）。
<img alt="质粒DNA转染过程示意图；包括稀释、混合、孵育、HEK 293T细胞。" src="/files/ftp_upload/4041/4041fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小规模转染操作流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4041/4041fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="用于生物实验研究中细胞培养的带10层CellSTACK的培养箱。" src="/files/ftp_upload/4041/4041fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 用于大规模蛋白表达的Corning 10层CellSTACK。每层提供636 cm2的细胞贴附表面积。标准实验室CO2培养箱（6.0立方英尺）可轻松容纳四个10层细胞工厂。
<img alt="蛋白质电泳结果；实验使用 GeneJuice、FuGene HD、PEI；分子量分析。" src="/files/ftp_upload/4041/4041fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 多种分泌蛋白的小规模表达。 我们使用常见的转染试剂（GeneJuice、FuGene HD 和 PEI）进行了一系列小规模测试表达。(a) 选定的人源细胞蛋白（tetherin）、受体（IL-2R β 亚基）和细胞因子（IL-2）的 Western blot 筛选。Tetherin 是一种人类膜糖蛋白，可抑制新生 HIV-1 病毒颗粒的释放16。其胞外域以糖基化、二硫键连接的二聚体形式存在，分子量约为 36 kDa。在还原条件下（如此处所示），tetherin 以单体形式迁移，表观分子量约为 22 kDa。白细胞介素-2（IL-2）是一种细胞因子（约 17 kDa），参与淋巴细胞增殖17。它与 IL-2 受体复合物相互作用，其中 IL-2R β 亚基（约 26 kDa）是其组成部分之一18。CD21 是一种膜蛋白，参与补体系统对 B 细胞的活化与成熟过程，同时也是 Epstein-Barr 病毒的受体。CD21 的糖基化胞外域以单体形式迁移，表观分子量约为 20 kDa。(b) 选定的病毒表面糖蛋白（XMRV Env 和 ebolavirus GP）的 Western blot 筛选。XMRV 和 ebolavirus 糖蛋白（跨膜锚定区已删除）在病毒膜上以三聚体刺突形式存在，介导宿主细胞的附着与融合。XMRV Env 和 EBOV GP 的胞外域富含 N-连接聚糖，表观分子量分别迁移在 70 kDa 和 75 kDa。
<img alt="SDS-PAGE 结果；蛋白质条带；分子量标记；IL-2 受体；tetherin；BSA 对照。" src="/files/ftp_upload/4041/4041fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 来自大规模 HEK 293T 培养的人源细胞蛋白纯化产物。所有蛋白均使用 10 层细胞工厂表达，并通过抗 HA 亲和层析进行浓缩和纯化。如考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 分析所示，白细胞介素-2 受体（IL-2R）α 和 γ 亚基的胞外域分别迁移至 40 kDa 和 46 kDa 的分子量位置。Tetherin 的胞外域在非还原条件下以二聚体形式迁移，表观分子量为 36 kDa。需注意，在表观分子量约 60 kDa 处存在部分 BSA 污染。此外，tetherin、IL-2R α 和 IL-2R γ 上存在的 N-连接糖链具有异质性，导致 SDS-PAGE 凝胶中出现条带弥散现象。这些复合型 N-连接糖链可通过肽：N-糖苷酶 F 去除。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>容器</td>
 <td>表面积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6孔板</td>
 <td>9.5 cm2（每孔）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm 培养皿</td>
 <td>55 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>245 mm 培养皿</td>
 <td>500 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T75 cm2 培养瓶</td>
 <td>75 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T175 cm2 培养瓶</td>
 <td>175 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T225 cm2 培养瓶</td>
 <td>225 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>滚瓶-普通型</td>
 <td>850 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>滚瓶-扩展表面型</td>
 <td>1700 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1层 CellSTACK</td>
 <td>636 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2层 CellSTACK</td>
 <td>1272 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5层 CellSTACK</td>
 <td>3180 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10层 CellSTACK</td>
 <td>6360 cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40层 CellSTACK</td>
 <td>25,440 cm2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 用于蛋白质表达的细胞培养容器比较。
试剂配方列表
100倍浓度环丙沙星 配制10 ml溶液时，将10 mg环丙沙星溶于10 ml去离子水中。加入10 μl 6N HCl以充分溶解环丙沙星。
PEI（1 mg/mL） 配制100 mL溶液时，将100 mg的25 kDa线性PEI溶于去离子水中，并加热至80 °C。冷却至室温后，调节pH至7.2，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装后于-20 °C冷冻保存以长期储存。
1X PBS 配制1 L水溶液：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na2HPO4（无水）、0.24 g KH2PO4。调节溶液pH至7.4，定容至1.0 L。
1X PBS-吐温-20 配制1 L水溶液：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na2HPO4（无水）、0.24 g KH2PO4、1 ml 吐温-20。调节溶液pH至7.4，定容至1.0 L。
1× 转膜缓冲液 配制 1 L 水溶液：3.0 g Tris 碱，14.4 g 甘氨酸，150 ml 甲醇。
1× SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳运行缓冲液 配制1 L水溶液：3.0 g Tris碱，14.4 g甘氨酸，1.0 g SDS。
SDS-PAGE 还原性上样缓冲液 配制 10 ml 溶液：0.6 g SDS，3 ml 甘油，1.8 ml 1.0 M Tris-HCl（pH 6.8），1 mg 溴酚蓝，5%（v/v）2-巯基乙醇。
方框 1. 细胞传代培养的一般方案
<ol>
 <li>在添加了10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素（pen/strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2 湿润环境中培养HEK 293T细胞。</li>
 <li>在倒置显微镜下观察细胞。当细胞达到100%汇合度时，移除并弃去培养基。</li>
 <li>用5 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，以去除血清残留。弃去PBS冲洗液。</li>
 <li>向T225 cm2 培养瓶中加入2 ml 0.05% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA溶液（或向T75 cm2 培养瓶中加入1 ml 0.05% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA溶液），室温孵育至细胞从培养表面脱落。也可使用无菌1×PBS-EDTA溶液使HEK 293T细胞脱落。</li>
 <li>向T225 cm2 培养瓶中加入13 ml含10% (v/v) FBS的DMEM（或向T75 cm2 培养瓶中加入9 ml含10% (v/v) FBS的DMEM），以终止胰蛋白酶反应。</li>
 <li>按1:5比例传代细胞。对于T225 cm2 培养瓶，将3 ml细胞悬液加入含有1×青霉素-链霉素和10% (v/v) FBS的新鲜DMEM培养基27 ml中；对于T75 cm2 培养瓶，将2 ml细胞悬液加入8 ml新鲜生长培养基中。将培养物置于37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育。细胞应在两天内生长至100%汇合度。</li>
</ol>
方框 2. 蛋白质印迹分析
<ol>
 <li>向30 μl细胞培养上清液中加入10 μl SDS-PAGE还原样品缓冲液。将样品和预染分子量标准品加入聚丙烯酰胺凝胶中，使用1× SDS-PAGE电泳缓冲液在175 V条件下电泳1小时，或直至分子量标准品条带清晰分离。</li>
 <li>将PVDF Immobilon-P膜浸入100%甲醇中1分钟以活化。</li>
 <li>组装蛋白质印迹装置。确保PVDF膜面向正极，并用1×转膜缓冲液保持所有组件湿润。避免聚丙烯酰胺凝胶与膜之间产生气泡。</li>
 <li>用电泳槽完全充满1×转膜缓冲液，在100 V条件下转膜1小时。</li>
 <li>用含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液在室温下封闭膜1小时，或在4 °C下封闭过夜。</li>
 <li>加入单克隆一抗（例如1:1000稀释的抗HA单克隆抗体或其他合适的抗体），溶于含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液中，在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。</li>
 <li>用1× PBS-Tween20溶液洗涤膜10分钟，重复洗涤两次。</li>
 <li>加入碱性磷酸酶偶联的单克隆二抗（用含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液按1:1000稀释），在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。</li>
 <li>用1× PBS-Tween20溶液洗涤膜10分钟，重复洗涤两次。</li>
 <li>将膜放入一个小容器中，加入5 ml碱性磷酸酶底物（BCIP/NBT）溶液。显色反应应在1–5分钟内出现。当条带达到理想强度后，用去离子水洗涤并自然晾干。颜色可能随时间褪去；膜干燥后应立即进行电子扫描保存图像。</li>
</ol>
方框 3. 细胞培养器皿的清洗与回收
尽管细胞工厂设计为一次性使用，但这些容器可通过以下清洗方案进行回收，用于额外的大规模转染实验：
<ol>
 <li>从10层细胞工厂中倒出上清液后，立即加入20% (v/v) 漂白剂并剧烈震荡以使细胞脱落。室温孵育3小时。</li>
 <li>排空容器，加入新鲜的20% (v/v) 漂白剂，并在室温下过夜孵育。</li>
 <li>排空容器，用1.5 L去离子水清洗，重复三次。</li>
 <li>排空10层细胞工厂，加入0.5 L无菌1× PBS，其中添加10×抗生素/抗真菌溶液。将容器在室温下储存，并在下次使用前将通气盖更换为加液口（标准33 mm螺纹盖）。注意：清洗后所有层应完全透明，若未达到此状态，则不得使用，并根据机构指南处理废弃的细胞工厂。</li>
</ol>

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<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

10层细胞工厂是生产毫克级蛋白质的有效容器。相较于滚瓶、摇瓶或搅拌瓶等传统容器，使用细胞工厂的一个主要优势在于无需购置任何额外的实验设备。一个标准的CO2培养箱（约6.0立方英尺）可轻松容纳四个10层细胞工厂（图2）。此外，这些容器在细胞与蛋白生产过程中所需的人力和空间均少于培养皿、培养瓶或滚瓶；一个10层细胞工厂相当于7.5个常规滚瓶的产量（表1）。更重要的是，HEK 293T细胞在这些容器中适应良好，并且非常适合通过PEI进行瞬时转染，从而为商业转染试剂提供了一种低成本且高效的替代方案。尽管细胞工厂设计为一次性使用的细胞培养塑料器皿，但我们已能够多次高效地清洗并重复使用这些容器，且未出现污染问题，从而显著降低了每次使用的成本。利用10层细胞工厂进行瞬时蛋白表达，可获得约1–10 mg的纯化蛋白（图4），具体产量取决于目标蛋白及其修饰情况。从克隆和小规模表达到完成大规模表达与纯化，整个过程大约需要3–4周。总之，这是一种快速、通用的表达平台，在分泌型人源或病毒表面蛋白的生产中具有很高的应用价值。此外，该平台还可用...

<table><tbody><tr><td>碱性磷酸酶（BCIP/NBT）液体底物溶液</td><td>Sigma</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素，100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>抗HA亲和层析基质，克隆株3F10</td><td>Roche</td><td>1815016</td><td></td></tr><tr><td>抗HA小鼠单克隆抗体，克隆株16B12</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，T75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，组织培养处理</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，T225 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，组织培养处理</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，6孔，组织培养处理</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>细胞工厂，10层CellSTACK</td><td>Corning</td><td>3312</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Omega 5K 转流过滤盒</td><td>Pall</td><td>OS005C12</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Omega 30K 转流过滤盒</td><td>Pall</td><td>OS030C12</td><td></td></tr><tr><td>层析玻璃柱，1.0×10 cm</td><td>Kontes</td><td>4204001010</td><td></td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>Sigma</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Invitrogen</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂</td><td>Promega</td><td>4709691001</td><td></td></tr><tr><td>GeneJuice 转染试剂</td><td>EMD/Merck</td><td>70967-6</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 碱性</td><td>Thermo Scientific</td><td>31324</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶偶联抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血凝素（HA）肽，100 mg</td><td>Genscript</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>（序列：YPYDVPDYA；纯度95%）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>家用漂白剂（4% w/v 次氯酸钠）</td><td>多个品牌可选</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH07850</td><td></td></tr><tr><td>质粒小量提取试剂盒，PureLink Quick</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>质粒大量提取试剂盒，PureLink HiPure</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>pDISPLAY 表达载体</td><td>Invitrogen</td><td>V660-20</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（青/链），100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），无菌1倍浓度</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI），线性，25 kDa</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉干粉</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GP PES 真空过滤装置，</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m，500 ml 容量</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，0.05%（w/v）</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>丙戊酸</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>Centramate 切向流系统</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱，加湿，标准6.0立方英尺</td><td>多个品牌可选</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳及转膜装置</td><td>多个品牌可选</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱，37 &amp;deg;C</td><td>多个品牌可选</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

在细菌中进行重组蛋白表达，通常 E. coli，一直是实现毫克级蛋白质表达的最成功策略。然而，原核宿主通常不适合表达人类、病毒或真核蛋白，原因在于外源大分子的毒性、蛋白质折叠机制的差异，或细菌缺乏特定的共翻译或翻译后修饰能力。基于酵母的表达系统（P. pastoris 或 S. cerevisiae) 1,2，杆状病毒侵染的昆虫（S. frugiperda 或 T. ni) 细胞 3，以及无细胞 体外 翻译系统 2,4 已成功用于哺乳动物蛋白的生产。直观而言，最佳选择是使用哺乳动物宿主，以确保表达出具有正确翻译后修饰的重组蛋白。多种哺乳动物细胞系（人胚胎肾（HEK）293、 CV-1 细胞在 O携带复制起点的 SV40 大T抗原（COS）、中国仓鼠卵巢（CHO）及其他细胞系已成功用于过表达毫克量级的多种人源蛋白 5-9然而，使用哺乳动物细胞的优势常常被较高的成本、对专用实验设备的需求、较低的蛋白产量以及构建稳定表达细胞系所需的漫长周期所抵消。提高产量并加快蛋白生产速度，同时保持低成本，是许多学术和商业实验室关注的主要因素。
本文介绍了一种省时且经济的两步法，用于从贴壁生长的HEK 293T细胞中表达分泌型人源蛋白。该系统能够生产微克至毫克级的功能性蛋白，适用于结构、生物物理及生化研究。第一步，平行构建多个目的基因的表达质粒，并在小规模培养中瞬时转染至贴壁的HEK 293T细胞。通过商用抗体针对载体编码的蛋白纯化标签进行Western印迹分析，检测并分析分泌至细胞培养基中的重组蛋白。随后，选取适合大规模蛋白生产的构建体，利用聚乙烯亚胺（PEI）在10层细胞工厂中进行瞬时转染。将分泌至升液体积的条件培养基中的蛋白通过切向流过滤浓缩为可操作的体积，再经抗HA亲和层析进行纯化。该平台的有效性已通过其表达多种蛋白的能力得到验证，包括毫克量级的细胞因子、细胞因子受体、细胞表面受体、内在限制因子以及病毒糖蛋白。该方法还成功应用于三聚体埃博拉病毒糖蛋白的结构解析5,10。
总之，该平台具有操作简便、速度快和可扩展性强的优点，同时能够最大限度地提高蛋白质的质量和功能。此外，除标准的加湿CO2培养箱外，无需其他额外设备。该方法可快速拓展应用于更复杂的系统，例如蛋白复合物的共表达、抗原和抗体的表达、用于疫苗的病毒样颗粒的生产，或用于难转导细胞系的腺病毒和慢病毒的生产。

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。

在细菌（通常为大肠杆菌）中进行重组蛋白表达，是实现蛋白质毫克级产量最成功的策略。

在本视频中，我们介绍了一种从瞬时转染的 HEK293T 细胞中高效表达分泌蛋白的时间和成本节约方法。首先，在六孔板中培养至约 40% 汇合度的 HEK293T 细胞。然后，通过将 GeneJuice 转染试剂和目的质粒分别用无血清培养基稀释，制备转染混合物。将转染混合物加入细胞中，随后在37摄氏度下孵育，以促进蛋白表达。可通过蛋白质印迹法（Western blot）检测上清液中的蛋白。一旦鉴定出合适的构建体，即可使用10层细胞工厂进行放大实验。使用PEI作为转染试剂进行细胞转染。通过切向流过滤结合亲和层析，可从培养上清中收获蛋白质。最终，该平台可实现多种大分子以毫克级产量表达。与现有的杆状病毒昆虫细胞表达等方法相比，该技术的主要优势在于可在三周内完成大量构建体的筛选及表达放大。演示该实验流程的将是来自我实验室的三名研究生：Hello Aiden、Shada Zini 和 Jonathan Cook。首先，在六孔板中每孔接种 250,000 个 HEC 293T 细胞，每孔加入 1 毫升体积的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，然后轻轻晃动培养板，使细胞均匀分散。然后将细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育过夜。当细胞融合度达到约40%时，弃去上清液，加入2毫升新鲜培养基以制备转染混合物。首先，在一个无菌离心管中分装90微升无血清DMEM培养基。然后加入3 µL基因转染试剂（gene juice），轻轻混匀管内溶液，并在室温下孵育5分钟。接着，加入10 µL浓度为100 ng/µL的质粒DNA（经小量制备纯化）储备液，用于转染。混匀管内溶液，室温静置15分钟。进行转染时，将混合物滴加至HEK 293T细胞上，逐滴加入，并轻轻晃动培养板，使转染混合物均匀分布。然后将细胞在37摄氏度下孵育。24小时后，向每个孔中加入1毫升新鲜培养基，并继续孵育48小时。转染后第3天，收集上清液，并通过蛋白质印迹法检测目的蛋白的表达水平。一旦确定了合适的质粒构建体，即可扩大转染操作的规模。使用10层细胞工厂，向细胞工厂中加入1.2升添加了5%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。然后加入2亿个HEK 293T细胞，并将细胞均匀分布至所有层中。四个 T 225 平方厘米的细胞培养瓶在长至 100% 汇合时约含有 2 亿个细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。在 T 75 培养瓶中配制转染混合物，将 840 微克 DNA 溶于 84 毫升无菌 1 倍 PBS 中。加入2.5毫升浓度为1毫克/毫升的聚乙烯亚胺溶液（PEI），室温孵育15分钟。溶液应变得浑浊。随后，将转染混合物缓慢倒入细胞工厂中，并充分混匀。总体层数。加入丙戊酸，使其终浓度为 4 毫摩尔/升。在转染混合物加入后，可提高表达产量。将培养物在 37 摄氏度下孵育四天，以进行蛋白表达。转染后第四天收集培养基，并立即清洗细胞工厂以备重复使用；将收集的培养基在 4 摄氏度下以 6,000 G 离心 30 分钟，并通过 0.22 微米无菌杯式真空过滤装置过滤，以去除任何颗粒物质。然后使用 Centra Mate 切向流过滤系统将上清液浓缩至 75 毫升。当上清液浓缩后，可通过亲和层析纯化目标蛋白。在本实验中，我们使用此处所述的大规模系统纯化了人AAL两种受体胞外域的HA标记亚基，随后进行高亲和力抗HA层析。如本图所示的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析结果。白介素-2受体α亚基和γ亚基的胞外域在SDS-PAGE凝胶电泳中的迁移分子量分别为40千道尔顿和46千道尔顿。IL-2Rα和IL-2Rγ上存在的EnLink糖链的异质性导致电泳条带展宽。较高分子量的条带代表污染的牛血清白蛋白（BSA）。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用10层细胞工厂通过人源细胞培养表达蛋白。请注意，HC 293 T细胞具有生物危害性，须在生物安全二级条件下操作。请始终穿戴适当的个人防护装备，并根据机构及政府指南对操作表面进行消毒。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

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利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。...

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

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改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

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对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。...

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无细胞蛋白质合成系统用于构建合成细胞

学习利用HEK 293T细胞表达分泌蛋白的高效方法，通过转染和无血清培养基实现重组蛋白生产。该平台支持Western blot检测，并可扩展至十层细胞工厂进行大规模制备，适用于结构功能研究与治疗开发。

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

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