使用 Bio-Rad 总 RNA 试剂盒从神经前体细胞中提取 RNA

大家好，我是Josh Sh，加州大学欧文分校Ed Maki博士实验室的一名研究生。我将向大家演示如何使用BioRad的to RNA mini试剂盒从神经前体细胞中提取RNA。我在本实验室使用该试剂盒已有数年时间，始终能够获得稳定且高产量的结果。

我们所使用的细胞是来自胚胎皮层的急性分离的Eton半神经前体细胞，通常将它们接种在经组织培养处理的24孔板中，该孔板预先用PD L和层粘连蛋白包被，每孔接种十万个细胞。在开始操作之前，我需要提醒您，应在一个专门用于RNA实验的工作台面上进行操作。首要步骤是确保您的RNA工作台面清洁无污染。

正确清洁实验台的方法是使用这种RNA清除剂。它能够彻底清除所有RNA，因为RNA酶会降解你的RNA样本。另外，在进行提取操作时必须始终佩戴手套，因为你的皮肤上含有丰富的RNA酶。

因此这是绝对禁止的。好的，我手上的是BioRad总RA小型试剂盒。我已经取出了其中的内容，让我来为大家展示一下它们是什么。

首先是经 X 型 DEPC 处理的 PBS，以及含 70% DEPC 处理乙醇的溶液。我们还有总 RNA 裂解液，其中加入了 Dan me 型无水乙醇。第二步是低严谨性洗涤液，其中添加了 100% 乙醇，高严谨性洗涤液、DNA 稀释液、DNA 本身以及总 RNA 洗脱液。

将溶液放入70摄氏度的加热块中。我们还需要1.5毫升带盖离心管。这些管子不应含有任何DNA酶或RNA酶，因此请确保使用的管子不含这些物质。

我们有两个2毫升的无盖离心管。而最重要的是RNA柱本身，没有它，就无法进行RNA提取。

因此，为了组装这些柱子，你需要RNA柱和两个无盖的2 mL离心柱，像这样将它们组装在一起，即可准备使用。好的，最后我们始终需要的是这些细胞。这里的细胞是Eton 1.5神经前体细胞。

这些细胞是从胚胎皮层急性分离得到的。它们已在培养基中培养了几天。我已将细胞从37°C的培养箱中取出。

本方案专门用于贴壁细胞。这些细胞在经组织培养处理的0.4孔板中培养，孔板已涂覆多聚赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白。现在，我将连接真空管，抽吸去除培养基。

下一步是加入约 500 µL 的去细胞 SEA PBS。同样，我们需要使用带滤芯的吸头。PBS 的作用主要是洗去培养基。

因此，您不希望任何培养基成分进入RNA柱中，干扰RNA提取，否则将无法获得理想的得率。明白吗？接下来快速吸除PBS，因为神经干细胞对PBS敏感。现在我将向每个样本中加入350 µL裂解缓冲液。

再次确认，确保在裂解缓冲液中加入了终浓度为β的乙醇。现在我将上下吹打裂解缓冲液15次，以确保细胞充分裂解，从而释放RNA内容物。

现在，我将向每个孔中加入70%的去乙醇。加入350微升的70%去乙醇后，我将每个孔吹打10次。每个孔我都上下吹打了10次。接下来，我将移液器的量程设置为超过700微升，因为每个孔的总体积为700微升。

然后，当我收集到体积超过 700 微升的液体后，将其转移至 RNA 柱中。加入柱内溶液后，我将把 RNA 柱放入离心机，以最大转速离心 30 秒。在裂解液第一次离心 30 秒后，我会将滤液弃去，倒入一个空的容器中。

或者，有些人会使用背压软管将滤液吸出。接下来，加入700微升低严谨性洗涤缓冲液。同样，务必确保将乙醇加入其中。

现在我将全速离心30秒。离心低严谨性洗涤缓冲液后，我将弃去滤液。明白了吗？然后我将配制D，即DNA溶液。

因此，对于每个样品，您将加入 5 µL 的 DNA。对我们而言，实际上是在开始此步骤之前就将 DNA 分装好了，因为这毕竟是一种酶。

最好将它们保存为等分试样。如果整体保存，反复冻融会破坏酶的活性。因此，在加入5 µL DNA后，我将用75 µL DNA稀释液进行稀释。

加入后，DNA 溶液的总体积将达到 80 微升。现在我将向每个样本中加入 80 微升的 DNA 溶液。确保将液体加至离心柱的膜上。

因此，您需要让DNA溶液充分浸透膜。这样就可以去除DNA，从而提高RNA的得率。

加入DNA后，将柱子在室温下静置15分钟，使酶能够充分作用。同样，需孵育15分钟。好的，计时结束。

经过15分钟孵育后，我将进行离心，以最高速度离心30秒使DNA沉淀。好的，离心30秒以去除DNA后，我将弃去滤液。现在我将加入700微升高严谨性缓冲液，以洗去任何残留的DNA。

加入后，我将再次在离心机中离心30秒。离心结束后，我会去除高严谨性滤液，并将其倒入容器中弃去。然后加入700 µL的低严谨性缓冲液。

这一次，我将在Centri Beach以全速离心一分钟。因此，在第一次低严谨性洗涤一分钟后，我将弃去滤液。这一次我不会添加任何试剂，而是再次离心两分钟，以彻底去除残留的低严谨性洗涤液，因为低严谨性洗涤液中含有乙醇，这会降低RNA的得率。

现在我要从70摄氏度的加热模块中取出洗脱缓冲液。提醒一下，在开始实验前，请确保已将洗脱缓冲液置于70摄氏度，并保持其温度，这样可以提高RNA的得率。我的层析柱已经准备好了。

它们已被从离心机中取出。接下来的步骤是取出层析柱。好的，我将丢弃帽管，并将它们转移至这些离心管中。

您将向每个柱子中加入 50 µL 的 Lucian 缓冲液。确保将洗脱缓冲液加到膜上，使其充分浸润。如果操作不当，将无法获得良好的 RNA 产量。

现在让层析柱静置一到两分钟，以确保溶液充分浸润层析柱的膜。好的，已静置一分钟后，现在可以将其放入离心机中。

现在我将把柱子放入离心机中，以最大速度离心一分钟。这是最后一次离心步骤，通过此步骤可将洗脱液或RNA收集到这些带盖的收集管中。

现在，在最后一次离心后，取出管内样品，移除层析柱，丢弃柱子，盖上管盖，随后可将样品保存于-80°C冰箱中，之后可根据需要进行后续操作。我刚刚使用伯乐（BioRad）RNA试剂盒提取了RNA。接下来，我将测定所提取RNA的浓度，或使用分光光度计检测其OD值。

接下来我将向您展示这个过程。首先，我们需要配制一个稀释液混合物，即进行1比5的稀释。

我们将混合RNA和分子级纯水。首先，我会准备一个空白对照。取两微升（2 µL）用于早期洗脱RNA的洗脱液，再加入八微升（8 µL）的分子级纯水。好的？

这就是我们的空白对照。现在我将准备样品，取两微升我们感兴趣的RNA。

我们将再次加入八微升的MQ水。这样就实现了1比5的稀释，对吧？我有这个玻璃微量移液管，我会把样品放入其中，然后将该移液管装入分光光度计中。

那么我们来测量一下。在测量RNA样品的OD之前，我需要先清洁一下我的比色皿。再次说明，这是玻璃比色皿。

切勿触碰其正面，否则会在上面留下指纹，导致测量结果不准确。因此，首先我要用双蒸水清洗玻璃校准钥匙。

然后，我将使用一根真空管，抽干水分。洗涤完成后，我将用95%乙醇再次洗涤，接着再次使用真空管去除乙醇。

现在我准备加载我的空白样品。为了校正读数，我们需要先使用空白样品。因此，我将取10微升（µL）我们刚刚配制的混合液。

接下来，我将上下混匀溶液，使其充分混合。然后将其转移至分光光度计进行检测。该仪器为 Ultra Spec 3, 100 型核酸蛋白分析仪，我们将用它测定 RNA 的浓度。

打开仪器，将其放入其中一个支架中。我们将调整程序，使其仅读取 RNA。好的，再次说明，我们进行了 1:5 的稀释。

因此，我们需要将稀释倍数设置为5。好的，我已经准备就绪。接下来，我将点击“运行”以读取空白对照。

好的，现在已归零。接下来我们准备测量样品。因此，我将取出玻璃比色皿。

我将吸出空白管中的内容物。再次用双蒸水冲洗，然后用95%乙醇冲洗。

现在，我准备上样10 µL的目标样品。因此，再次确认您希望混匀样品。然后将其加入玻璃小瓶中。

现在我们可以进行检测了。在测定OD后，一个良好的产量应表现为RNA在260 nm与280 nm处的吸光度比值约为2，产量约为每毫升144微克。

尽管仪器显示每毫升72微克，但由于我们的vets中长度减半，我们必须将其乘以二。前面两厘米处已向您展示了如何从神经前体细胞中提取RNA。同样，我们使用的是BioRad的Total Mini RNA试剂盒。我们尝试过其他试剂盒，但根据提取效率，这是目前我们所使用的最佳试剂盒。

这样可以获得高质量的RNA。如果使用该试剂盒，您将获得与我们一贯结果相同的高质量数据。