阈上的神经活动的单细胞和单穗的分辨率的光学的方法记录

FollowMe 实验的总体目标是从大量神经元中记录神经放电活动。第一步是通过荧光显微镜观察与每个动作电位相关的神经元胞体内钙离子浓度的升高来实现这一目标。采用双光子激发和随机访问扫描原理，以高空间和时间分辨率记录来自 40 个神经元胞体的钙荧光信号。

在第二步中，使用反卷积算法从荧光信号中提取精确的峰电位时间。该技术可用于记录数十个神经元的放电活动。所获得的放电数据可用于测量神经元群体之间的互信息、信号传播或神经相关性。

与现有的微电极记录等方法相比，该技术的主要优势在于能够同时记录局部神经元群体中大量神经元的放电活动。该方法有助于回答关于皮层局部神经网络功能的关键问题，例如信息编码中相关性的作用，以及皮层可塑性过程中网络动力学的改变。对于双光子激发，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于系统光学元件会引入较大的能量损耗，因此需要较高的激光输出功率以补偿这些损失。

每套系统包含两个棱镜，可在激光脉冲进入定制的光学偏转器之前为其引入负群速度色散，以补偿声光偏转器（AOD）所引入的时间色散。两个具有大孔径的AOD可在二维方向上偏转激光束。在AOD后方13厘米处放置一个每毫米100条刻线的反射式衍射光栅，用于补偿AOD引入的空间色散。当使用短激光脉冲时，激光束通过两个中继望远镜导入直立显微镜的相机端口。

虹膜光阑以规则间隔放置，用于光学元件的对准。物镜前方的二向色分光镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。反射荧光探测器和透射荧光探测器分别通过物镜和聚光镜收集荧光信号，彩色玻璃滤光片置于探测器前方，以防止激发光到达探测器。

声光偏转器（AOD）的偏转角度由配备数字-模拟转换板的计算机控制，该计算机进而驱动电压控制振荡器。光电倍增管输出的信号通过截止频率为100千赫兹的低通巴特沃斯滤波器进行传递，并以156.25千赫兹的时钟频率由模数转换器进行数字化，随后存储于计算机中用于分析。通过记录在有无激光照射、光电倍增管低增益和高增益条件下荧光信号的分布情况，来检测系统对准状况和电噪声水平。指示剂抖动的随机访问扫描依赖于对细胞内钙离子浓度升高的检测。该实验方案的第一步是通过团注法将大量神经元用钙离子指示剂的乙酰氧基甲酯（Esther）形式进行染色。

接下来，在四个位置分别记录每个神经元胞体的活动，每个位置记录 6.4 微秒。为选择目标神经元，先获取一幅由 256 × 256 像素组成的全帧图像，然后在此图像中手动选择待记录神经元的中心位置。

每个周期中，控制软件会自动在每个中心周围距离两微米的位置添加三个点。从所有40个神经元的四个位置记录荧光信号。在一个周期内完成所有神经元的记录需要1.536毫秒。

对全部40个神经元重复进行五秒钟的顺序记录。从荧光胞体钙信号中检测动作电位依赖于高信噪比。通过提高激发光强度可实现高信噪比。

然而，由于光损伤的存在，激发强度只能增加到一定限度。激发强度仅在一个非常狭窄的范围内才能同时满足光损伤较低且信噪比较高，从而能够检测到单个动作电位，以确保记录的信号处于高动作电位检测效率的窗口内。在实验过程中，会使用本实验室开发的多种在线分析软件。

接下来，从约100至200毫秒的基线噪声短时间窗口中，计算每个神经元的近似光子发射速率。通过使用该方程拟合相对荧光变化的分布，从荧光值中计算光子数量和光子发射速率；然后从同一时间窗口计算基线荧光，并将其作为时间或实验次数的函数进行绘图。通过调节激光功率，使基线的平均下降速率保持在每秒0.0002以下。

因为超过此限值后，动作电位的检测效率会迅速下降。此后，每隔10至20分钟通过采集全帧图像来验证神经元胞体的位置，必要时调整记录位置。

由于钙瞬变的衰减时间较长，神经活动产生的荧光信号在时间上往往较为滞后。在本实验中，采用去卷积方法从荧光信号中恢复出动作电位及其发生时间。此处我们利用遗传算法确定最能拟合记录到的荧光信号的动作电位序列模型。

随着算法的每一次迭代，最大似然值渐近地趋近于由荧光记录噪声所决定的最大值。在神经元的非均质群体中，动作电位引发的钙信号在不同神经元之间可能存在差异。为了对大规模数据集进行无监督分析，我们设计了一种算法，该算法考虑了神经元间动作电位引发钙信号的变异，以避免大量假阳性检测结果的出现。

在相同类型神经元和相同实验条件下进行的另一组独立实验中，记录了单个动作电位诱发的钙瞬变的振幅与衰减时间常数的联合分布。为校正缓慢的基线变化并降低去卷积的计算成本，将较长的记录数据按每个神经元每次记录分割为若干段持续时间为一至五秒的较短轨迹。去卷积算法可测试多达一百万个或更多的不同模型。为加快去卷积速度，单次实验可在最多10台不同的计算机上并行进行去卷积处理。

去卷积后，对尖峰数据进行分析和检查。以自动化方式计算刺激前-后时间直方图的尖峰概率和神经元放电率。以下是检测窗口内以极低激发速率和极高激发速率记录的荧光信号示例。

请注意，每个示例展示的是对单个脉冲刺激的响应。此处显示的是一张急性脑切片的显微照片，以及置于同一皮层层柱内的两个刺激微管。在第四层中，这些展示了神经元对重复刺激的响应，而该图显示了由记录的神经元群体所传递的香农互信息。

以下是不同皮层神经元群体之间超阈值放电活动传播的测量结果。这些是皮层神经元对丘脑皮层纤维电刺激所产生反应中检测到的放电事件。在使用随机访问扫描记录神经元活动时，至关重要的是要在检测时间窗口内进行记录。

否则，很容易得到无法使用的数据集。光学尖峰检测仍处于起步阶段，还有很大的改进空间。

经过一些改进，我们能够记录到更多的神经元。通过其他改进，我们将甚至能够在清醒且行为活跃的动物中进行记录。