Name: 阈上的神经活动的单细胞和单穗的分辨率的光学的方法记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习使用双光子激发和随机扫描荧光显微镜技术记录大量神经元的钙信号活动，并通过反卷积算法精确提取锋电位时间。该方法可同时监测多达100个神经元，适用于研究神经群体动态和信息传播。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Randy Chitwood 博士对稿件的审阅。本工作由 Whitehall 基金会和 Alfred P. Sloan 基金会授予 HJK 的资助支持。

1. 光学装置（图1）
<ol>
 <li>进行双光子激发时，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于光学元件会引入较大的损耗，因此需要较高的激光输出功率（在某些情况下，波长为890 nm时输出功率&gt;2W）以补偿这些损耗。</li>
 <li>预啁啾系统由两个棱镜组成，可在声光偏转器（AODs）之前为激光脉冲施加负群速度色散（GVD），以补偿AODs引入的时间色散1。</li>
 <li>两个具有大孔径的声光偏转器（AODs）（对于数值孔径NA为0.8的40倍水浸物镜，孔径为10 mm）可在二维方向上偏转激光束。</li>
 <li>在AODs后方13 cm处放置一个每毫米100条刻线的反射式衍射光栅，用于在使用短激光脉冲时补偿AODs引入的空间色散。</li>
 <li>通过两个中继望远镜将激光束导入直立显微镜的相机端口。</li>
 <li>在光路中定期放置光阑，用于对光学元件进行对准。</li>
 <li>物镜前方的二向色分光镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。</li>
 <li>背向和透射荧光探测器（光电倍增管，PMTs）通过物镜收集荧光信号，若适用，也可通过聚光镜收集。</li>
 <li>在探测器前方放置彩色玻璃滤光片（BG-39，3–5 mm），以防止激发光到达探测器。</li>
 <li>AOD偏转角度由配备有数模转换器板卡（时钟频率为156.25 kHz）的计算机控制，该板卡进而驱动压控振荡器。</li>
 <li>光电倍增管输出的信号经由一个低通巴特沃斯滤波器（截止频率100 kHz）传递，并由模数转换器（时钟频率156.25 kHz）进行数字化，随后存储于计算机中用于分析。</li>
 <li>通过在有无激光照射、光电倍增管增益高低以及有无指示剂等不同条件下记录荧光信号的分布情况，来检测对准状态和电噪声。当高增益且有指示剂时荧光信号分布的宽度明显大于其他条件下荧光信号分布的宽度时，表明扫描系统已正确安装并进行了良好屏蔽（图2）。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
 <li>抖动式随机访问扫描依赖于细胞内钙离子浓度升高的检测。可通过团注法将钙离子指示剂的酯化形式（例如 Oregon Green 488 Bapta-1 AM）注入神经组织，从而对大量神经元进行染色5。</li>
 <li>从每个神经元胞体的多个位置进行记录，每个位置记录时间较短（“抖动”模式：4 个位置，每个位置 6.4 μsec，每个周期内每个神经元的总记录时间为 25.6 μsec，图 3C）。为选择感兴趣的神经元，首先获取一幅包含 256×256 像素的全帧图像（图 3A），并在该图像中手动选定待记录神经元胞体的中心位置。控制软件将自动在该中心周围距离 2 μm 处添加三个记录点。</li>
 <li>在每个周期中，从 40 个神经元分别记录荧光信号（图 3B）。此过程在整个记录期间重复进行（5 秒记录 = 3,255 个周期，1 个周期 = 1.536 msec）。</li>
</ol>
3. 用于提高尖峰检测效率的在线软件工具
<ol>
 <li>从细胞体荧光钙信号中检测尖峰依赖于细胞体荧光钙信号具有较高的信噪比（S/N）。通过提高激发强度可实现较高的信噪比。然而，由于光损伤的限制，激发强度只能增加到一定限度。只有在非常有限的激发强度范围内，才能实现高效的尖峰检测，此时荧光信号具有高信噪比，同时仅观察到极轻微的光损伤3。为了确保记录期间所获取的信号处于高效尖峰检测的范围内，我们通过在线分析监测光子速率（见公式3.2）以及基线荧光的下降情况。</li>
 <li>每个神经元的近似光子速率通过基线噪声的短时间窗口（100–200 ms）进行计算。通过将相对荧光变化的分布（σ）拟合至以下公式，由荧光值计算出光子数（Nλ）和光子速率（λ = Nλ / Δt）：</li>
</ol>
<img alt="Static equilibrium equation, σ(ΔF/F) with Gaussian distribution, formula analysis, physics concept." src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
该方程表示光子散粒噪声的泊松分布，通过变量变换转化为相对荧光变化：ΔF/F = (G*Nλ(t)-G*Nλ,0)/G*Nλ,0 其中 G 表示光电倍增管及所有其他电子元件的总增益。需要注意的是，该方程无法准确确定所探测到的光子数量 体内 记录，因为除了光子散粒噪声外，还存在其他噪声来源（如运动伪影）。尽管如此，该方程对于 体内 记录以估算噪声。
<ol start="3">
 <li>基线荧光根据相同的时间窗口计算，并作为时间或试验次数的函数进行绘制。通过调节激光功率，使基线的平均下降速率保持在每秒0.0002以下，因为当超过此限值时，动作电位检测效率会迅速下降。</li>
 <li>每10至20分钟，通过重新获取全帧图像来确认神经元胞体的位置。如有需要，可对记录位置进行调整。位置调整可同时针对所有神经元，也可针对单个神经元进行。</li>
</ol>
4. 从荧光信号重建尖峰时间（去卷积）
<ol>
 <li>由于钙瞬变的衰减时间较长（数百毫秒），神经活动产生的荧光信号常在时间上发生叠加。反卷积方法可从荧光信号中重建出动作电位及其发生时间。</li>
 <li>为了确定最可能产生所记录荧光信号的动作电位序列，需比较不同模型。本文采用遗传算法，筛选出最有可能性的模型，从而确定动作电位序列及其发生时间。</li>
 <li>在神经元的异质性群体中，动作电位引发的钙信号在不同神经元之间可能存在差异。为实现对数据集的无监督分析，我们设计了一种算法，能够考虑不同神经元之间动作电位引发钙信号的变异。</li>
 <li>为避免大量假阳性检测结果，可限制动作电位引发钙信号模型中允许的振幅和衰减时间常数范围。单次动作电位引发的钙瞬变的振幅与衰减时间常数的联合分布，需在相同类型神经元、相同实验条件下，通过同步的电生理与光学记录在独立实验中获取。</li>
 <li>为校正缓慢的基线漂移并降低反卷积计算成本，较长的记录被分割为若干段较短的片段，每段持续1–5秒。</li>
 <li>对于每个神经元和每次记录，反卷积算法可能需测试大量模型（最多可达1,000,000个或更多）。为加快反卷积速度，单个实验可在最多10台计算机上并行处理。</li>
 <li>反卷积完成后，对动作电位数据进行分析和检查。自动计算刺激前后的时程直方图、动作电位概率以及放电率（单位神经元的平均动作电位数）。</li>
</ol>
5. 代表性结果
成功的峰电位检测依赖于记录到的荧光胞体钙信号具有较高的信噪比。单纯使用高激发速率（高激光功率）可能会对生物样本产生光效应的不利影响（光损伤）。在抖动式随机访问扫描中，光损伤表现为基线荧光的降低以及峰电位诱发的钙荧光信号减弱。峰电位诱发信号的下降可迅速导致无法检测到峰电位。只有在非常狭窄的激发强度范围内，才能从荧光信号中实现高效的峰电位检测。该范围的上限受光损伤限制，下限则因荧光信号信噪比较低而受限。对于急性脑片中的皮层神经元，我们在距脑片表面约100 μm深处进行记录时，所使用的激光功率可产生约400,000–1,500,000 光子/秒的光子速率。当使用高亲和力指示剂——此处为Oregon Green 488 BAPTA-1时，该信号强度足以检测单个峰电位。图3E展示了一个在极低激发速率下记录的荧光信号示例、一个处于检测窗口范围内的记录示例，以及一个在极高激发速率下记录的示例。
与其他能够以单细胞和单峰电活动分辨率记录神经活动的技术相比，抖动式随机访问扫描可以从同一局部神经元群体中记录更多数量的神经元，且相较于螺旋电极/多电极记录等方法具有更低的侵入性。因此，抖动式随机访问扫描可用于记录大量神经元的活动，以测量由超阈值活动所传递的互信息6（图4A）、神经元群体中神经活动的变化（皮层可塑性），以及超阈值活动在神经元群体中的传播过程14（图4B）
<img alt="用于发射分析的光学激发装置示意图，包含激光器、棱镜和光栅。" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 微抖动随机访问扫描装置的光学设计。
<img alt="荧光信号图；激光/无激光、PMT增益、染料比较用于光子分析。" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 校准与测试：在不同条件下记录的荧光信号分布。A) 无激光照射且光电倍增管（PMT）增益较低时的信号分布；B) 在较高PMT增益下但无激光照射时，由于光电倍增管的暗电流，分布范围更宽；C) 开启激光并在高PMT增益下记录的信号分布。B图所示分布与此分布之间的差异表明激发光已到达PMT探测器；D) 从神经元胞体在高增益下记录的荧光信号分布。若无其他噪声源贡献，则该分布仅由光子散粒噪声产生。
<img alt="荧光图像处理、神经元扫描路径、抖动示意图、时间ΔF/F曲线结果" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. A) 全帧荧光图像用于检测和选择神经元胞体位置；B) 一个周期的扫描路径；C) 抖动原理示意图：在每个胞体（圆圈）内，先记录多个位置信号，然后将光束移至下一个胞体；D) 两个D/A通道输出示意图。对每个神经元胞体，从胞体内4个不同位点（s1-s4）记录荧光信号。每个位点的位置由其x和y坐标确定。所有位点及所有神经元的x和y坐标按顺序发送至数模转换器。当光束在两个神经元胞体之间移动时，不采集信号（空白）；E) 荧光信号示例。注意每个示例显示的是单个动作电位的响应（通过膜片钳全细胞贴附记录测得）。
<img alt="神经信号传播示意图；神经元反应分析；互信息数据；脑部研究。" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 使用抖动式随机访问扫描研究皮层功能。A) 测量神经元群体传递的互信息。上方图像显示急性脑切片的显微照片，以及两个刺激微电极放置在同一皮层柱第4层（L4）中的位置。中间图表显示每次刺激重复时的神经元反应。下方图表显示记录的神经元群体所传递的香农互信息。B) 测量皮层神经元群体之间超阈值放电活动（信号传播）的传播。上方图表说明实验设计，中间图像为荧光图像，虚线表示桶状结构边界，下方图表显示在对丘脑皮层纤维施加电刺激后检测到的放电事件（三角形）。

<ol><li>Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+functional+imaging+of+single+neurons+using+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy.</a> J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73(1990).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+%5BCa2%2B%5Di+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li>
<li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+compensation+for+spatial+and+temporal+dispersion+of+acousto-optical+deflectors+for+two-dimensional+scanning+with+a+single+prism%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism.</a> Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).</li>
<li>Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+neuronal+activity+at+high+frame+rate+with+a+digital+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).</li>
<li>Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+inference+from+calcium+imaging+using+sequential+Monte+Carlo+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods.</a> Biophys. J. 97, 636-655 (2009).</li>
<li>Yaksi, E., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+firing+rate+changes+across+neuronal+populations+by+temporally+deconvolved+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging.</a> Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).</li>
<li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8(2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

抖动式随机访问扫描通过检测神经元胞体内每个动作电位所引发的细胞内钙离子浓度升高，间接探测超阈值放电活动。细胞内钙离子浓度的升高由荧光钙染料进行检测。抖动式随机访问扫描的局限性主要源于钙荧光信号的信噪比较低。而信噪比又受到光损伤的限制，因此无法使用高激发频率。由于信噪比有限，某些神经元中的动作电位检测会失败，且在持续性或高频放电活动中的检测也可能失败。例如，在记录过程中 体内，当放电频率在 40 Hz 及以上时，尖峰检测显著降低 4尖峰检测减少的原因在于，随着峰间间隔变短，正确模型与错误模型之间的似然性差异变得越来越小。此外，抖动式随机访问扫描仅适用于胞体钙信号升高与放电活动高度相关的神经元群体7 这并不适用于所有脑区和细胞类型（例如蝌蚪嗅球中的颗粒细胞）8).
作为此处所用光学设计的替代方案，可以使用单个棱镜来补偿声光偏转器（AOD）的空间和时间色散，而无需使用两个棱镜和一个衍射光栅4,9。单棱镜设计的优点是激光功率的透过率更高。作为此处所用频率发生器模拟控制的替代方案，也可采...

<table><tbody><tr><td colspan="4">光学元件按从激光器开始的顺序列出</td></tr><tr><td>钛：蓝宝石激光器</td><td>Coherent 公司</td><td>Chameleon Ultra 2</td><td>建议使用高功率输出（&amp;gt;2W，900 nm）</td></tr><tr><td>消色差透镜 f = 30 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AC254-030-B</td><td>650–1050 nm 范围的抗反射（AR）涂层</td></tr><tr><td>消色差透镜 f = 100 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>透镜 f = 75 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LA1608-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>透镜 f = 175 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LA1229-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>消色差透镜 f = 300 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AC254-300-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>消色差透镜 f = 100 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>消色差透镜 f = 100 mm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650–1050 nm</td></tr><tr><td>声光偏转器</td><td>IntraAction 公司</td><td>ATD 6510CD2</td><td></td></tr><tr><td>反射式衍射光栅</td><td>Newport 公司</td><td>53-011R</td><td>100 条/mm，适用于带宽为 65 MHz、扫描角为 45 mrad 的声光偏转器</td></tr><tr><td>21.6 mm 布儒斯特棱镜</td><td>Lambda Research Optics 公司</td><td>IBP21.6SF10</td><td></td></tr><tr><td>有色玻璃</td><td>Schott 公司</td><td>BG-39</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Technology 公司</td><td>Z532RDC</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增模块</td><td>滨松公司</td><td>H9305-03</td><td></td></tr><tr><td>DAC-ADC 板卡</td><td>国家仪器公司</td><td>PCI-6115</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 Bapta-1 AM</td><td>Invitrogen 公司</td><td>O-6807</td><td></td></tr></tbody></table>

以单细胞和单峰分辨记录超阈值神经活动的光学成像

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

脊椎动物中枢神经系统中的信息传递通常由神经元群体而非单个神经元完成。此外，高于阈值的放电活动传播也涉及神经元群体。因此，直接研究皮层功能的实证研究需要以高分辨率记录神经元群体的活动。本文描述了一种光学方法及去卷积算法，可实现对多达100个神经元的单细胞和单峰电活动分辨率的神经活动记录。该方法依赖于检测皮层神经元在高于阈值的电峰（动作电位）期间伴随发生的细胞内胞体钙浓度瞬时升高。通过使用声光偏转器（AODs）的快速随机访问扫描技术，实现了光学记录的高时间分辨率。1双光子激发钙敏感染料可在不透明的脑组织中实现高空间分辨率2通过最大似然法从荧光钙信号记录中重建动作电位。同步进行的电生理与光学记录结果表明，该方法能够可靠地检测动作电位&gt;97% 的峰电位检测效率），且假阳性峰电位检测率较低（&lt; 0.003 峰电位/秒），且具有高时间精度（约 3 毫秒） 3. 这种光学尖峰检测方法可用于记录神经活动 体外 在麻醉动物中 体内3,4.

理解脊椎动物中枢神经系统功能需要对大量神经元进行记录，因为皮层功能是在神经元群体水平上产生的。本文描述了一种光学方法，可实现单细胞和单动作电位分辨率的阈上神经活动记录，即抖动式随机访问扫描技术。该方法能够以高时间分辨率记录多达100个神经元的胞体荧光钙信号。通过最大似然算法，从胞体荧光钙信号中反卷积出潜在的阈上神经活动。该方法可高效率、低假阳性率地可靠检测动作电位，适用于神经元群体活动的研究

关键词：中枢神经系统，神经元群体，光学记录，单细胞分辨率，单动作电位检测，钙成像，抖动式随机访问扫描，最大似然反卷积 体外 和 在体.

脊椎动物中枢神经系统中的信息传递通常由神经元群体而非单个神经元完成。此外……

FollowMe 实验的总体目标是从大量神经元中记录神经元的放电活动。第一步是通过荧光显微镜观察每个动作电位发生时神经元胞体中细胞内钙离子浓度的升高，从而实现这一目标。利用双光子激发和随机访问扫描原理，可以以高空间和时间分辨率记录来自40个神经元胞体的钙荧光信号。在第二步中，使用反卷积算法从荧光信号中提取精确的峰电位时间。该技术可用于记录数十个神经元的放电活动。随后，可利用这些放电数据来测量神经元群体之间的互信息、信号传播或神经相关性。与现有的微电极记录等方法相比，该技术的主要优势在于能够同时记录局部神经元群体中大量神经元的放电活动。该方法有助于回答关于皮层局部神经网络功能的关键问题，例如信息编码中相关性的作用，以及皮层可塑性过程中网络动力学的改变。对于双光子激发，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于系统光学元件会引入较大的损耗，因此需要较高的激光输出功率以补偿这些损失。每个系统由两个棱镜组成的预啁啾器，在激光脉冲到达声光偏转器（AOD）之前的光路中引入负群速度色散，以补偿AOD引入的时间色散。两个具有大孔径的AOD实现激光束的二维偏转。在AOD后方13厘米处放置一块每毫米100条刻线的反射式衍射光栅，用于补偿AOD引入的空间色散。使用短激光脉冲时，激光束通过两组中继望远镜导入直立显微镜的相机端口。虹膜光阑以规则间隔放置，用于光学元件的对准。物镜前方的二向色分光镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。通过物镜和聚光镜的落射与透射荧光探测器收集荧光信号，彩色玻璃滤光片置于探测器前方，以防止激发光到达探测器。声光偏转器（AOD）的偏转角度由配备数字-模拟转换板的计算机控制，该转换板进而驱动电压控制振荡器。光电倍增管输出的信号通过截止频率为100千赫的低通巴特沃斯滤波器，再由模拟-数字转换器以156.25千赫的时钟频率进行数字化，随后存储于计算机中用于分析。通过记录在有无激光照射、光电倍增管低增益和高增益条件下以及有无指示剂存在时荧光信号的分布情况，来检测系统对准和电噪声水平。随机访问扫描依赖于对细胞内钙离子浓度升高的检测。本实验方案的第一步是通过团注法将大量神经元用钙指示剂的乙酰氧基甲基酯（ester）形式进行染色。接下来，在四个位置分别记录每个神经元胞体的活动，每个位置记录 6.4 微秒。为选择目标神经元，先获取一个由 256 × 256 像素组成的完整帧图像，然后在此图像中手动选择待记录神经元的中心位置。每个周期中，控制软件会自动在每个中心周围距离两微米的位置添加三个点。从所有40个神经元的四个位置记录荧光信号。在一个周期内完成所有神经元的记录需要1.536毫秒。对全部40个神经元重复进行五秒钟的顺序记录。从荧光胞体钙信号中检测动作电位依赖于高信噪比。通过提高激发光强度可实现高信噪比。然而，由于光损伤的存在，激发强度只能增加到一定限度。只有在一个非常有限的激发强度范围内，光损伤较低且信噪比足以检测单个动作电位，才能确保记录到的信号处于高动作电位检出率的窗口内。在实验过程中，会使用本实验室开发的多种在线分析软件。接下来，从约100至200毫秒的基线噪声短时间窗口中，计算每个神经元的近似光子速率。通过用该方程拟合相对荧光变化的分布，从荧光值中计算光子数量和光子速率；然后从同一时间窗口计算基线荧光，并将其作为时间或实验次数的函数进行绘图。通过调节激光功率，使基线的平均下降速率保持在每秒0.0002以下。因为超过此限值后，动作电位的检测效率会迅速下降。此后，每隔10到20分钟通过采集全帧图像来验证神经元胞体的位置。如有需要，调整记录位置。由于钙瞬变的衰减时间较长，神经活动产生的荧光信号在时间上常常发生重叠。本实验步骤中，采用去卷积方法从荧光信号中恢复出动作电位及其发生时间。此处我们使用遗传算法来确定最符合记录荧光信号的放电序列模型。随着算法的每一次迭代，最大似然值渐近地趋近于由荧光记录噪声所决定的最大值。在非均质神经元群体中，动作电位引发的钙信号在不同神经元之间可能存在差异。为了对大规模数据集进行无监督分析，我们设计了一种算法，该算法考虑了神经元间动作电位引发钙信号的变异，以避免大量假阳性检测结果的出现。在相同类型神经元和相同实验条件下进行的另一组独立实验中，记录了单个峰电位诱发的钙瞬变的幅度和衰减时间常数的联合分布。为了校正缓慢的基线变化并降低去卷积的计算成本，将较长的记录数据按每个神经元每次记录划分为若干段较短的轨迹，每段持续时间为一至五秒；去卷积算法可测试大量模型，最多可达一百万个或更多不同的模型。为加快去卷积速度，可同时在最多10台不同的计算机上并行对一个实验数据进行去卷积处理。去卷积后，对尖峰数据进行分析和检查。自动计算刺激前后的时程直方图尖峰概率以及神经元放电率。以下是检测时间窗口内以极低激发速率和极高激发速率记录的荧光信号示例。请注意，每个示例展示的是对单个脉冲的响应。图中显示的是急性脑切片的显微照片，以及放置在同一皮层柱内的两个刺激电极。在第四层中，这些展示了神经元对重复刺激的响应，该图显示了由记录的神经元群体传递的香农互信息。以下是不同皮层神经元群体之间超阈值放电活动传播的测量结果。这些是皮层神经元在丘脑皮层纤维电刺激下的反应中检测到的放电事件。使用随机访问扫描记录神经元活动时，非常关键的是要在检测时间窗口内进行记录。否则，很容易得到无法使用的数据集。光学尖峰检测仍处于初级阶段，还有很大的改进空间。经过一些改进，我们能够记录更多神经元的活动。通过其他改进，我们将能够在清醒且行为正常的动物中进行记录。

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

阈上的神经活动的单细胞和单穗的分辨率的光学的方法记录

视网膜神经节细胞通过一系列动作电位将视觉信息从眼睛传递到大脑。本文演示如何记录单个神经节细胞的动作电位 体内...

单单位 在体内的 大鼠视交叉记录

我们介绍了利用硅探针在活动中的啮齿类动物体内进行大规模多单细胞单位和局部场电位记录的方法。文中详细展示了驱动器的制作、探针与驱动器的连接以及探针植入过程，以便于轻松重复操作。...

通过可移动硅探针在行为啮齿类动物中进行大规模神经元记录

本文描述了一种用于监测膜电位变化的成像技术，其空间分辨率达到亚微米级，时间分辨率达到亚毫秒级。该技术基于激光激发电压敏感性染料，可对轴突及轴突侧支、终末树突分支以及单个树突棘中的信号进行测量。...

脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

本视频演示了使用尖端精细的玻璃微电极和专用设备记录单个脑神经元电活动信号的方法。将微电极小心插入大鼠脑内，并施加轻微震动以穿入神经元，从而记录神经元内部的电活动信号。...

单个神经元细胞内信号的活体记录

本视频演示了一种通过使用电压敏感染料染色的脑片来观察神经元活动变化的方法。该染料通过改变其荧光强度来反映神经元膜电位的变化。通过施加电刺激并结合先进的成像技术，该方法能够基于电压敏感染料的荧光信号实现对神经元膜电位实时变化的可视化追踪。...

使用电压敏感染料染色的脑片中神经元活动的光学记录

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

学习新的刺激-反应关联会激活广泛的神经过程，最终反映为单个神经元放电输出的变化。本文描述了一种行为学实验方案，可在单次实验过程中持续记录动物在习得、消退及重新习得条件反应时的单个神经元活动。...

记录鸽子在自由移动状态下经历三个学习阶段的单个神经元动作电位

本文介绍了我们在麻醉小鼠皮层中从已鉴定的抑制性中间神经元获取稳定且分离良好的单细胞单位记录的策略。表达ChR2的神经元通过其对蓝光的反应来识别。该方法使用标准的细胞外记录设备，是钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济替代方案。...

光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

我们介绍了一种使用电压敏感染料对脑片进行可重复且稳定的光学记录方法。本文描述了利用常规海马脑片制备技术进行电压敏感染料染色及光学信号记录的过程。...

使用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录

本方案介绍了一种利用吸收型电压敏感染料和光电二极管阵列，在非转基因无脊椎动物物种中以单细胞分辨率成像神经元群体活动的方法。该方法可实现快速的工作流程，可在一天内完成成像与分析。...

基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态

学习使用双光子激发和随机扫描荧光显微镜技术记录大量神经元的钙信号活动，并通过反卷积算法精确提取锋电位时间。该方法可同时监测多达100个神经元，适用于研究神经群体动态和信息传播。

以单细胞和单峰分辨记录超阈值神经活动的光学成像

探索更多视频