阈上的神经活动的单细胞和单穗的分辨率的光学的方法记录
September 5th, 2012
了解脊椎动物的中枢神经系统的功能，需要从许多神经元的录音，因为皮层的功能所产生的，在神经元中的人口水平。在这里，我们描述了一个光学的方法来记录阈上的神经活动与单细胞和单穗分辨率，抖动随机存取扫描。这种方法记录体荧光钙信号与高时间分辨率从多达100个神经元。最大似然的算法deconvolves的基本阈上的神经活动，自体荧光钙信号。这种方法可以可靠地检测具有较高的检测效率和低误报率的尖峰，可以用来研究神经元群和。
FollowMe 实验的总体目标是记录来自大量神经元的神经尖峰活动。这是通过在第一步中使用荧光显微镜观察与每个动作电位相关的神经元胞体内钙浓度的增加来实现的。采用双光子激发和随机访问扫描原理，以高空间和时间分辨率记录来自 40 个神经元体的钙荧光信号。
在第二步中，使用反卷积算法从荧光信号中提取精确的加标时间。该技术可用于记录来自数十个神经元的尖峰活动。然后，脉冲数据可用于测量互信息、神经元群之间的信号传播或神经相关性。
与现有方法（如微电极记录）相比，该技术的主要优点是可以记录来自当地种群的大量神经元的神经元尖峰活动。这种方法可以帮助回答神经元局部网络水平上有关皮层功能的关键问题，例如相关性寻求信息的重要性和皮质可塑性网络动力学的变化对于双光子激发，使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。需要高激光输出功率来抵消系统光学元件引入的巨大损耗。
每个系统由两个棱镜组成的传教士在 custo 光学偏转器之前向激光脉冲施加负群速度色散，以补偿 AOD 引入的时间色散两个大孔径的 AOD 在两个维度上偏转激光束。每毫米 100 个凹槽的反射式衍射分级放置在 AOD 后面 13 厘米处，以补偿 AOD 引入的空间色散。当使用短激光脉冲时，激光束由两个中继望远镜引导到正置显微镜的相机端口中。
虹膜以规则的间隔放置，以便对准光学元件。物镜前面的二向色分束器将红外激发光传输到标本，并将标本的荧光反射到检测器上。Epi 和 Trans 荧光检测器通过物镜收集荧光信号，聚光镜彩色玻璃滤光片放置在检测器前面，以防止激发光到达检测器。
A OD 偏转角由配备数字模拟转换器板的计算机控制，该计算机反过来驱动压控振荡器。来自光电倍增器的信号通过截止频率为 100 kHz 的低通巴特沃斯滤波器中继，并由模拟数字转换器以 156.25 kHz 的时钟速率进行数字化，然后存储在计算机上进行分析、校准和电噪声测试，通过记录光电倍增器的低增益和高增益下有和没有激光的荧光信号的分布， 以及有和没有指标抖动随机访问扫描依赖于细胞内钙增加的检测。该方案的第一步是通过推注用钙指示剂的 Esther 形式对大量神经元进行染色。
接下来，在每个位置的四个位置记录每个神经元的胞体活动 6.4 微秒。要选择感兴趣的神经元，请获取由 256 x 256 像素组成的全帧。然后手动选择要在此图像中记录的神经元中心。
控制软件在每个周期中自动添加每个中心周围 2 微米距离处的三个点。从所有 40 个神经元的四个位置记录荧光信号。在一个周期内记录所有神经元需要 1.536 毫秒。
重复所有 40 个神经元的连续记录 5 秒钟。荧光体钙信号的尖峰检测依赖于高信噪比。通过增加激发强度可以实现高信噪比。
但是，由于光损伤，激发强度只能增加到一定的限度。只有一个非常小的激发强度窗口，其中光损伤较低，信噪比足以检测单个尖峰，以确保记录的信号在高尖峰检测窗口内。在实验过程中，使用了我们实验室开发的许多在线分析软件。
接下来，从大约 100 到 200 毫秒的基线噪声的短时间窗口计算每个神经元的近似光子速率。通过用该方程拟合相对荧光变化的分布，从荧光值计算光子数和光子速率，然后从同一时间窗口计算基线荧光并将其绘制为时间或试验的函数。通过调整激光功率，将基线的平均下降保持在每秒 0.0002 以下。
因为当超过此限制时，尖峰检测会迅速下降。之后，通过获取全帧图像每 10 到 20 分钟验证一次神经元体细胞位置。如果需要，请调整录制位置。
由于钙瞬变的长期衰变，神经活动产生的荧光信号通常会及时被吃掉。在此过程中，使用反卷积方法对荧光信号进行尖峰和尖峰时间。在这里，我们使用遗传算法来确定最可能的符合记录的荧光信号的尖峰序列模型。
在算法的每次迭代中，最大似然逐渐接近荧光记录的噪声给出的最大值。在同质的神经元群中，尖峰诱发的钙信号可以在神经元之间变化。对于大型数据集的无监督分析，我们设计了一种算法，该算法考虑了尖峰诱发钙信号从神经元到神经元的变化，以避免大量假阳性检测。
在相同的实验条件下，来自相同类型神经元的一组单独的实验中记录了单个尖峰诱发钙瞬变的振幅和衰减时间常数的联合分布。为了解决缓慢的基线变化并降低 decon 的计算成本，较长的记录被分成几个较短的轨迹，每个记录中的每个神经元为 1 到 5 秒，反卷积算法可以测试大量模型，多达 100 万个不同的模型或更多，以加快反卷积一个实验在多达 10 台不同的计算机上进行反卷积。同时。
解卷积后，对尖峰数据进行分析和检查。peri stimulus time histogram spike probability 和 neuron 放电速率以自动方式计算。以下是在检测窗口内以非常低激发速率记录的荧光信号和以非常高激发速率记录的另一个荧光信号的示例。
请注意，每个示例都显示了对一个峰值的响应。这里显示的是急性脑切片和放置在同一皮质柱中的两个刺激移液器的显微照片。在第 4 层中，这些显示了对重复刺激的神经反应，此图显示了由记录的神经元群发出的香农互信息。
这是超级阈值尖峰活动在不同皮层神经元群之间传播的测量。这些是皮质神经元中检测到的尖峰，对 thal 皮质纤维电刺激的反应。当使用随机访问扫描记录神经元活动时，在检测窗口内记录非常重要。
否则，很容易得到不可用的数据集。光学尖峰检测仍处于起步阶段。有很大的改进空间。
通过一些改进，我们可以记录更多的神经元。通过其他改进，我们甚至能够记录清醒和行为良好的动物。
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概述
本研究提出了一种光学方法，用于使用荧光显微镜记录多个神经元的神经元脉冲活动。该技术能够在检测与动作电位相关的钙信号时实现高时间和空间分辨率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经影像学
- 电生理学
背景
- 理解神经元群体动力学对神经科学至关重要。
- 神经元中的钙信号与动作电位相关。
- 传统方法可能无法有效捕捉大量神经元群体的活动。
- 荧光显微镜提供了一种非侵入性的方式来监测神经元活动。
研究目的
- 开发一种记录大量神经元脉冲活动的方法。
- 在检测神经活动时实现高时间分辨率。
- 在体外和体内实现对神经元群体动力学的分析。
使用的方法
- 荧光显微镜用于观察细胞内钙浓度。
- 双光子激发用于高分辨率成像。
- 抖动随机访问扫描用于记录多个神经元的信号。
- 使用反卷积算法从荧光信号中提取精确的脉冲时间。
主要结果
- 该方法可以记录多达100个神经元的钙信号。
- 实现了高检测效率和低假阳性率。
- 脉冲数据可用于测量互信息和信号传播。
- 该技术适用于在各种环境中研究神经元群体。
结论
- 开发的方法增强了对大量神经元群体活动的研究能力。
- 它提供了一种可靠的方式来高精度检测脉冲。
- 该方法可以促进进一步研究神经动力学和相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Recording suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution enables mechanistic de-risking in target validation by clarifying functional connectivity in cortical networks. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying signal propagation and mutual information between neuronal populations. The method’s scalability to up to 100 neurons positions it for early discovery workflows requiring population-level readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping spike-evoked calcium transients across local neuronal networks.
- Operational Value: Enables biological de-risking through high-fidelity detection of suprathreshold spiking activity (>97% efficiency, <0.003 false positives/sec).
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying neural correlations and information signaling in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via spike timing extraction using maximum-likelihood deconvolution.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through high temporal precision (~3 msec) and low baseline drift (<0.0002/sec).
- Scalability: Supports screening readiness with random-access scanning of 40 neurons per cycle, extensible to 100 neurons.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery to preclinical validation by measuring propagation of suprathreshold spiking between cortical populations.
- Mechanistic De-risking: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking spike detection to mutual information and signal propagation metrics.
- Disease Relevance: Applicable to in vitro and anesthetized in vivo models, supporting continuity across experimental systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing population-level neural activity readouts that inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by recording spiking activity from tens of neurons in local networks.
- Screening: Delivers assay readiness via quantitative fluorescent signals extracted from calcium transients with high signal-to-noise ratio.
- Analytics: Enables comparison of conditions through automated peri-stimulus time histograms, spike probability, and firing rate calculations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by measuring signal propagation between neuronal populations, a key biomarker of network function.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for longitudinal studies of network dynamics under pharmacological or genetic perturbation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural population dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through computer-controlled AOD scanning and parallelized deconvolution across multiple systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling quantitative assessment of neural correlations and information flow.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reproducible, high-resolution spiking data from local cortical networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, calcium imaging, and deconvolution algorithm optimization.
- Depends on infrared pulse laser systems, acousto-optical deflectors, and high-speed analog-digital conversion infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for baseline fluorescence monitoring and online signal-to-noise ratio maintenance.
- Involves adaptation considerations when transitioning from in vitro slices to anesthetized in vivo preparations.
- Limited by photo damage thresholds that constrain excitation intensity and thus spike detection sensitivity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Optical Setup
3:18
Cell Staining and Recording
4:18
Online Software Tools to Maximize Spike Detection Efficiency
5:44
Reconstruction of Spike Timings from Fluorescence Signals
7:26
Results: Studying the Cortical Function Using Dithered Random-Access Scanning
8:12
Conclusion
