利用超声波血脑屏障破坏结合锰增强磁共振成像进行功能性神经影像学研究

以下实验的总体目标是利用锰增强磁共振成像（MRI）技术对小鼠的神经元活动进行成像。该方法通过单侧刺激胡须，并绘制对侧桶状皮层区的神经元反应来实现。第一步是组装并校准超声系统，该系统由信号发生器和放大器驱动的非聚焦超声换能器组成，用于实验。

在给予小鼠腹腔注射锰剂后，利用超声波联合微泡开放血脑屏障，使锰剂进入脑实质。随后，对小鼠实施神经元刺激范式，导致脑内活动较强的区域出现更高程度的锰积累。最后，通过磁共振成像获取图像，显示基于脑内不同区域锰积累水平差异所反映的T1加权磁共振图像信号强度的区域差异。

在神经科学领域，小鼠是研究脑发育和疾病遗传与分子基础的主要模型系统。该技术为这些小鼠模型中的神经活动 mapping 提供了一种无创工具。超声波破坏血脑屏障不仅可用于将锰递送至脑实质，以实现功能性神经成像，还可用于将多种其他化合物递送至脑实质，包括基于钆的对比剂或化疗药物。

通常，初次接触该方法的研究人员在超声系统校准和微泡操作方面会遇到困难。本实验操作将由本实验室的每位技术人员分别演示。超声系统包含一个单元素超声换能器，其直径足以覆盖小鼠大脑，中心频率在2兆赫范围内。

换能器由信号发生器和50分贝功率放大器驱动，以产生超声脉冲序列。在水箱中校准超声系统。将水听器置于水箱底部，并使用三轴平移平台将换能器定位在其上方。

然后向换能器施加一串短暂的正弦脉冲，并调节载物台以找到最大响应位置，该位置应位于超声波束的中心以及换能器的自然焦点处。接着，在不同输入电压范围内进行多次声压测量，并通过线性回归估算输入电压与声压之间的关系。确定产生约 0.36 兆帕峰值负声压所需的脉冲幅度。

在此步骤中，通过鼻罩输送异氟烷使动物麻醉。鼻罩装置应每次都能精确且稳定地固定动物头部，确保实验过程中头部保持颅骨水平位置。使用气动枕监测呼吸频率，并据此调整麻醉剂用量，使呼吸频率维持在每分钟85至125次之间。同时，使用直肠探头监测动物体温，并通过加热灯或吹入暖风来维持其体温。

随后，向动物插入尾静脉导管和腹腔内导管。下一步是修剪其毛发，以实现对第七对脑神经（VII）的单侧刺激，并绘制对侧桶状皮层的神经元反应图。在尽可能靠近皮肤表面的位置切断对侧的第七对脑神经（VII），注意不要刺激毛囊或周围皮肤。

然后将动物转移至超声系统，并在头皮上涂抹超声耦合剂，将含有水层的较薄塑料片覆盖于头部。通过水层用棉签轻轻探入，排出超声耦合剂中滞留的气泡。随后将超声探头置于水中，调整至其自然焦距位置，正对小鼠脑部，并用手指擦拭探头表面，去除附着的气泡。

随后，在操作过程中，将小瓶放入振荡器中振荡45秒，以制备佩林脂质微球。使用时置于室温下，但在每日最后一次使用后至次日首次使用前需存放在冰箱中。在后续使用时，再次将储存的小瓶放入振荡器中振荡。

接着，经腹腔注射0.5毫摩尔每千克的氯化锰，并等待10分钟以使其充分分布。然后手动振荡微泡试剂管1分钟，以重新悬浮微球。随后抽取30微升加上导管死腔体积的液体。

注意不要将空气注入小瓶中，因为这会破坏剩余的微泡。立即启动超声脉冲序列，并通过尾静脉导管尽快注射微球，尽量减少延迟。继续超声处理三分钟。

然后关闭超声系统。待脑内锰水平稳定约40分钟后，关闭异氟烷并移除鼻罩。此时，开始进行神经元刺激范式以定位桶状皮层。

以每秒1至5赫兹的频率，将画笔在对侧振动阵列上以圆周运动持续刺激90分钟。刺激结束后恢复麻醉状态，并继续维持小鼠体温，滴定异氟烷浓度以使呼吸频率保持在每分钟85至125次。随后，将小鼠放入磁共振成像线圈中，并转移至磁共振成像系统。

然后获取高分辨率的三维T1加权图像，如图所示。在给予T1弛豫时间缩短的对比剂（如锰剂或基于钆的对比剂）后，血脑屏障被破坏，与未进行BOMA的脑组织相比，T1加权成像中脑实质信号增强。第一列为在七只动物中通过单侧刺激risi产生的神经元活动图谱。

两个不同位置的差异图显示，与刺激侧相对的大脑半球在 brissy 刺激后 MRI 信号增强。在第二列中，p 值图显示了这些差异的相对显著性。在第三列中，相应的大脑图谱示意图表明，这些活跃区域对应于初级感觉皮层的须部代表区。

经过练习，该技术操作可在约两小时或更短的模拟时间内完成。进行该操作时，需注意在注射前应充分振荡微泡试剂瓶，并注意避免向瓶内注入空气。此外，必须确保超声耦合剂中或超声探头下方没有空气气泡残留。

本演示中，我们选择刺激胡须，但显然该技术可调整用于研究任何感兴趣的刺激。按照该操作步骤，动物可完全恢复，从而允许进行纵向研究。