钙成像的急性下区片的制备

该程序的目的是对出生后脑室下区细胞的钙活性进行成像。这是通过首先小心地从出生后小鼠身上取出脑组织来实现的。第二步是制作包含脑室下区的活体急性脑切片。

接下来，脑切片加载钙敏感染料。最后一步是使用延时共聚焦显微镜对活动进行成像。最终，心室区细胞中钙活性的延时成像用于显示细胞间活动动力学，以揭示不同细胞类型和脉管系统之间的通讯模式。

这种方法可以帮助回答神经发生领域的关键问题，例如不同细胞类型如何相互交流，以及细胞如何影响脉管系统在牺牲和斩首 P 20 至 P 30 小鼠幼崽后。根据机构批准的指南，将头部放在装有解剖液的托盘区域中。用镊子稳定头部，并使用微型剪刀在颅骨和中线周围连续切割。

确保嗅球仍然附着在大脑上并且没有损坏。在背侧切开，然后用镊子从大脑中取出覆盖的颅骨。然后，在仍然用镊子握住头部的同时，使用手术刀片在 lambda 水平进行冠状切割。

使用相同的剃须刀片在大脑两侧中线外侧约 2 到 3 毫米处进行矢状切割。然后用刀片舀到大脑下方，将其从颅骨中完全取出。到目前为止，该过程应在三分钟内完成。

将少许氰基丙烯酸酯基强力胶放在振动板上。然后拿起脑组织并将其安装在外侧矢状切口形成的平坦侧面之一。在切割过程中安装琼脂糖块以稳定组织是可选的。

用乙醇冲洗 vibram 刀片以去除油，然后用蒸馏水冲洗。将刀片放入刀架中，然后将刀架安装到振动器上。设置振动器，以便在高频振动和低速下将组织切片切割成 250 至 350 微米的厚度，逐渐切开组织。

嗅球的出现是矢状段接近脑室下区的良好指标。脑室的出现和胼胝体的增厚也是随后出现脑室下区的良好指标。到达脑室下区后，使用吸头切断的塑料意大利面移液器取出每片并将其转移到切片保持室中。

带 CSF。切片需要在 A CSF 中孵育 1 小时。在此期间，可以为后续成像步骤准备移液器、染料和显微镜。

要准备移液器，请拉动 6 到 8 个玻璃移液器，使每个移液器的吸头长度约为 2 毫米，直径为 2 至 3 微米。此外，移液器支架预设为约 16 度的角度，因此可以在不接触灌注室或干扰物镜放置的情况下安装移液器。要制备钙染料，将 4.6 微升 onic F1 27、20% 的 DMSO 溶液加入 50 微克等分试样的 flu oh four 中。

最后，为了准备蠕动泵（使用蠕动泵有助于最大限度地减少图像漂移），请通过灌注管路运行 CSF 并确保管路无气泡。现在，定位真空吸头以确保从灌注室中吸出溶液。该图显示了灌注系统的设置。

溶液应处于足够的水平，以便将物镜浸入适当的工作距离，但不能太高，以免溶液溢出腔室的侧面。聆听稳定性，以验证通过浴法施用上样染料的恒定吸液。首先，通过稀释储备液制成 1 至 2 毫升的 4 至 5 微摩尔染料工作溶液。

在 A CSF 中，将切片转移到一个 35 毫米的培养皿中，该培养皿的网眼底部装满了 A CSF。使用 3 毫升塑料移液管轻轻去除 A CSF，同时加入钙染料工作溶液。然后在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳气体受控环境中孵育 30 至 60 分钟。

孵育后，将切片放回充满 A CSF 的保持室中，以洗去未进入细胞的染料。在 CSF 中 30 分钟后，将切片转移到灌注室中，对染料进行加压应用。将切片从保持室转移到显微镜设置上的灌注室。

然后用 250 微摩尔染料工作溶液回填玻璃移液器。确保移液器吸头没有气泡并放置在微型纵器上。现在将移液器降低到感兴趣的区域。

移液器的放置方式可以使吸头高于切片表面几微米，或埋在表面以下几微米处，但远离记录区域。将 pico spritzer 设置为每平方英寸不到 3 磅，然后涂抹染料一到两分钟。可能需要重复应用，具体取决于肉眼评估的标签。

当应用于切片表面时，该方案将在表面下方应用时优先标记神经母细胞，该技术将优先标记星形胶质细胞，但如果以 500 的浓度应用超过三分钟，将标记微摩尔神经母细胞。无论移液器吸头的位置如何，都应让切片在 A CSF 中洗涤并恢复 30 至 45 分钟。使用较低功率物镜定位感兴趣区域，然后切换到更高功率的水浸物镜，并评估感兴趣区域中细胞的健康状况。

在差异干涉对比下，健康细胞显得圆润丰满，并显示出微弱的流感 oh four 负荷。在验证灌注和真空正常工作后，将延时分辨率和空间分辨率设置为所需的速率。在这种情况下，大约每秒对一帧进行成像，分辨率为 5 个 12 x 5 个 12 像素。

将持续时间设置为 2 到 10 分钟后，启动运行。药物洗涤 5 到 10 分钟，然后再洗掉 5 到 10 分钟。这个来自钙活度延时记录的代表性平均图像是在脑室下区的星形胶质细胞之后拍摄的。

都承受着压力。将流感 oh 上午 4：00 深入切片。电影的收购率为 0.5。

第二个时间步，将感兴趣的区域放置在表现出活性的单元格上。以下是 Previously 所示的编号感兴趣区域的跟踪。使用移动平均线过滤跟踪并进行标准化。

垂直刻度表示 F 0 上 delta F 的两倍，其中 F 是信号强度，F 0 是平均基线信号，delta F 等于 F 减去 F 0。一旦掌握。如果作正确，这项技术可以在 4 到 5 小时内完成。