Name: 基因改造的Picoeukaryote Ostreococcus金牛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解利用电穿孔技术对海洋单细胞藻类Ostreococcus tauri进行遗传转化的方法。该技术可建立稳定的转基因细胞系，为研究植物基因调控网络提供简化基因组模型。

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SynthSys 是由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）与工程和物理科学研究理事会（EPSRC）资助项目 D019621 支持的综合系统生物学中心。欧盟第六框架计划“海洋基因组学”卓越网络向 FYB 提供的资助支持了基因转化方法的开发。

1. 藻类材料的制备
<ol>
	<li>将Ostreococcus细胞培养于人工海水中（ASW）。将海盐（通常约为每升40克）溶解于去离子水中，使盐度达到30 ppt（使用盐度计测定）。按照表1-3所述添加富集培养基11,12、微量元素和维生素。培养基随后通过0.22 μm滤膜过滤除菌。</li>
	<li>用于维持培养时，Ostreococcus菌株OTTH95需每7天在新鲜ASW中以1/100的比例无菌传代，并在配备月光蓝滤光片的植物培养箱中持续光照下培养。光照强度应接近20 μmol m-2 s-1，温度维持在20 °C。细胞无需持续振荡，但每隔2至3天需轻轻摇动一次以防止细胞聚集。</li>
	<li>每次转化实验需使用50 ml细胞，细胞密度为20-30 × 106 ml-1，该密度通常在传代后5-7天达到。可通过流式细胞术或血细胞计数板（最低40倍放大）估算细胞密度及无菌状态。</li>
</ol>
2. 电穿孔
<ol>
	<li>准备用于转化的 DNA。每次转化需要 5 μg 纯度高、已线性化的质粒 DNA，浓度为 1 μg/μl，溶于无菌去离子水中。为获得该 DNA，作者推荐使用 Qiagen midi prep 试剂盒，但其他方法也可能同样有效。使用一种在载体骨架上具有切割位点、但在转基因或筛选基因中无切割位点的酶对产物进行消化。通过乙醇沉淀进一步纯化并浓缩所得的线性 DNA，然后将沉淀物重悬于适当体积的高质量无菌去离子水中。</li>
	<li>为每次转化准备含有 5 μg DNA 的微量离心管。对每种待转化的细胞系，均需设置一个不含 DNA 的对照管。将这些离心管置于冰上，并为每次转化准备好一个 2 mm 电穿孔杯。</li>
	<li>为每次转化准备 2.2 ml 重悬缓冲液。将甘露醇溶解于 ddH2O 中制成 1 M 溶液，加入 0.1 % Pluronic F68 并过滤除菌。</li>
	<li>向细胞中加入 Pluronic F68 至终浓度为 0.1%，在 10 °C 条件下，于 50 ml 锥底离心管中以 8000×g 离心 10 分钟收集细胞。立即通过移液上下吹打，将细胞重悬于 1 ml 重悬缓冲液中，并转移至微量离心管。在 10 °C 条件下以 8000×g 离心 10 分钟，迅速操作，并重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>使用剪切过的吸头，将每次转化所得的最终细胞沉淀重悬于 40 μl 重悬缓冲液中。将 40 μl 重悬细胞液加入冰上放置的各管线性化 DNA 中，轻柔混匀后转移至电穿孔杯中。</li>
	<li>将电穿孔杯放入电穿孔仪中。将参数设置为 6 kV cm-1、600 Ω 和 25 μF，进行电穿孔。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞在电穿孔杯中室温孵育 10 分钟，并利用此时间准备组织培养瓶。标记培养瓶，并向每个瓶中加入 30 ml 新鲜 ASW。从每个培养瓶中取出 1 ml 培养基，轻柔地加入对应的电穿孔杯中。孵育 2 分钟后，小心移除含有细胞团的 ASW，缓慢而轻柔地将细胞团直接吹入培养瓶的 ASW 中。</li>
	<li>细胞通常保持为团状结构。此时应避免震荡或扰动聚集的细胞。将细胞在培养箱中恢复 1–2 小时，然后通过轻轻摇动培养瓶使细胞重悬。此时细胞应能自由分散，无可见团块。让细胞在培养箱中过夜恢复。</li>
</ol>
3. 在半固体培养基平板中包埋细胞
<ol>
	<li>第二天，将含有搅拌子的瓶子中的2.1%低熔点琼脂糖溶于ddH2O中，进行高压灭菌。将该溶液置于盛有水的大烧杯中，使用加热磁力搅拌器保持65–90 °C的熔融状态。每项转化实验准备8个培养皿（直径55 mm）以及8个15 ml离心管，每管含9 ml人工海水（ASW）并添加所需的筛选剂。若使用Nourseothricin或G418，浓度为2 mg/ml。</li>
	<li>从培养箱中收集转化后的细胞。在无菌超净工作台内，向其中一根离心管的9 ml液体中加入1 ml沸水浴处理的低熔点琼脂糖。盖紧管盖，通过倒置混匀。随后加入0.5 ml新鲜转化的细胞，迅速混匀后立即倒入培养皿中。对剩余7根离心管重复此操作，然后继续处理下一批转化用的培养瓶。</li>
	<li>将培养皿在超净台中敞口放置1小时，使琼脂糖凝固。随后盖上皿盖，将培养皿转移至大号方形培养皿中，每个方形皿可放置4个圆形培养皿。用Parafilm封口膜密封方形培养皿。注意：培养皿中的凝胶不会完全固化，因此凝胶非常脆弱。操作时应小心避免破坏凝胶。将所有方形培养皿放入培养箱中培养。</li>
</ol>
4. 转化菌落的筛选
<ol>
	<li>转化平板上应在10至21天后出现菌落，而对照转化平板上不应出现菌落。使用带有切口吸头的200 μl移液器挑取菌落。选择独立的菌落，吸取绿色菌落，注意避免混入邻近菌落的细胞。</li>
	<li>将细胞转移至含有筛选剂的2 ml液体培养基中，置于24孔板内。若使用Nourseothricin，浓度为1.75 mg/ml。通过上下吹打混匀。每轮转化挑选24至50个菌落。用封口膜密封培养板，放入培养箱中培养。</li>
	<li>一周后，将每孔100 μl培养物转移至含筛选剂的新鲜ASW培养基（2 ml）中，继续在24孔板中培养7天。存活的细胞系可用于后续研究。应通过PCR和Southern印迹分析基因组中的稳定整合及插入拷贝数。可用于此目的的基因组DNA可通过任何适用于植物DNA提取的小规模标准方法获得。</li>
</ol>
5. 典型结果
以1/100比例传代的细胞在培养7天后达到每毫升2500万个细胞的密度。使用适当参数对细胞进行电穿孔，得到的时间常数在10至14毫秒之间。当将细胞转移至培养瓶中的培养基时，应形成细胞团块。1小时后轻轻振荡，细胞应易于重悬。将1 ml转化后的细胞加入0.2% LMP琼脂中，应形成均匀但仅呈半固体状的凝胶。菌落通常在10至21天后出现。按照上述方案转化5 μg线性化DNA时，每个转化平板通常可获得50–100个菌落，而阴性对照平板上无菌落生长。挑取的菌落中约80%可通过液体培养基中的抗生素抗性实现阳性筛选，并用于后续研究。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>终浓度</td>
			<td>贮存液</td>
			<td>配制1升所需体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3</td>
			<td>8.83 × 10-4 M</td>
			<td>75 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>3.63 × 10-5 M</td>
			<td>2.68 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-甘油磷酸</td>
			<td>1 × 10-5 M</td>
			<td>2.16 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SeO3</td>
			<td>1 × 10-8 M</td>
			<td>1.29 mg/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-碱（pH 7.2）</td>
			<td>1 × 10-3 M</td>
			<td>121.1 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K 微量金属溶液</td>
			<td> </td>
			<td>表 2</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 维生素溶液</td>
			<td> </td>
			<td>表 3</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. O. tauri 生长培养基成分11, 12。 配制总体积为1升、盐度为30 ppt的人工海水，并按上表所示从储备液中加入各组分。培养基需经滤膜除菌，且在一周内使用。除维生素溶液外，所有化合物的储备液可混合成混合母液，每升培养基添加6 ml该混合液。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>终浓度</td>
			<td>储备液</td>
			<td>配制1升所需用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA • 2H2O</td>
			<td>1 x 10-4 M</td>
			<td> </td>
			<td>41.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 • 6H2O</td>
			<td>1 x 10-5 M</td>
			<td> </td>
			<td>3.15 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4 • 2H2O</td>
			<td>1 x 10-8 M</td>
			<td>6.3 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 • 7H2O</td>
			<td>1 x 10-9 M</td>
			<td>22.0 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2• 6H2O</td>
			<td>1 x 10-9 M</td>
			<td>10.0 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 • 4H2O</td>
			<td>1 x 10-8 M</td>
			<td>180.0 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4• 5H2O</td>
			<td>1 x 10-8 M</td>
			<td>9.8 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 微量金属溶液11,12。用去离子水（dH2O）定容至1升，加热溶解。分装溶液后冷冻保存。表中所列终浓度是指在培养基中的最终浓度，而非微量金属溶液中的浓度。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>终浓度</td>
			<td>储存液</td>
			<td>配制1升所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素B12</td>
			<td>1 × 10-10 M</td>
			<td>1 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素</td>
			<td>1 × 10-9 M</td>
			<td>0.1 g/L dH2O</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐酸硫胺素 • HCl</td>
			<td>1 × 10-7 M</td>
			<td> </td>
			<td>200 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. f/2维生素溶液11。 用去离子水（dH2O）定容至1升，过滤除菌，分装后冻存。表中所列终浓度是指在最终培养基中的浓度，而非维生素溶液本身的浓度。
<img alt="基因编辑过程示意图：克隆、线性化、电穿孔、菌落生长培养。" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 转化实验流程的图示概览。 通过电穿孔法对Ostreococcus tauri进行遗传转化的流程示意图。
<img alt="微生物生长实验，接种后天数，延时图像，带刻度的培养瓶。" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 培养物生长情况。 细胞每隔 7 天在新鲜人工海水（ASW）中以 1/100 的比例进行无菌传代，并在配备月光蓝滤光片的植物培养箱中持续光照条件下培养。光照强度应接近 20 μmol m-2s-1，温度维持在 20 °C。细胞不需要持续振荡，但每隔 2 至 3 天需轻轻摇动一次，以防止细胞聚集。
<img alt="显示细菌培养生长的培养皿实验；实验室环境中的科学观察。" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 0.2% LMP 琼脂糖上的菌落形成。将 4 个平板转移至一个大的方形培养皿中，并用封口膜密封（左上）。当菌落形成后，直接挑选游离的（理想为圆锥形）菌落（右上），并用 200 µL 移液枪将其吸出。阴性对照中应无菌落生长（右下）。

<ol><li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li>
<li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+ultrastructure+of+O.+tauri%3A+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749(2007).</li>
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<li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li>
<li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light%2Fdark+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).</li>
<li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li>
<li>Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).</li>
<li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li>
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<li>Djouani-Tari, elB. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus%3A+Application+to+circadian+clock+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471(2011).</li>
<li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

细胞状态和培养的无菌性对转化实验至关重要。尽管细胞通常在12小时光照、12小时黑暗的周期中培养，但在这些条件下生长的细胞转化效率往往不足。在反复的离心和重悬步骤中，细胞应始终易于重悬。若细胞发生聚集或出现黏液状物质，则建议重新开始实验。通常情况下，每个转化平板上可观察到约50个菌落，而阴性对照平板上应无菌落生长。若转化效率较低，应调整培养条件以确保细胞处于最佳状态。影响转化效率的因素包括实验室环境温度（应接近20 °C）和操作速度（从细胞离心[2.3]到恢复培养[2.7]的整个操作应耗时约1小时）。此外，所有溶液均需在每次转化前新鲜配制。用于制备平板时，低熔点琼脂糖（LMP agarose）的浓度尤为关键。Ostreococcus细胞在高浓度琼脂糖中无法生长，在低浓度下则会扩散。
已有三类用于Ostreococcus的转化载体被发表6，预计近期将有更多载体被开发并发表。现有载体Pot-Luc6允许使用任意选择的启动子，并结合C端萤火虫荧光素酶标签，从而实现更快的转基因株系筛选以及可追踪的表达模式；而Potox载体6则携带来自Ostreococcus高亲和力磷酸盐转运蛋白（HAPT）基因的强诱导型13启动子，可用于目的基因的过表达。Potox-Luc载体源自Potox，额外携带一个荧光素酶标记，可用于过表达株系的间接筛选14。这些载体上有效的筛选标记为诺尔斯曲霉素（Nourseothricin）和G148。然而，Ostreococcus细胞对多种抗生素具有高度抗性，因此筛选转基因Ostreococcus细胞所需的化合物浓度高于常规模式系统（2 mg/ml）。
尽管该过程看似效率较低，但此实验所需的大量细胞和质粒DNA并不会构成显著障碍。更大的局限在于，每一个对抗性筛选标记具有抗性的生成细胞系都必须单独分析，以确认整个构建片段已整合到DNA中。我们已观察到一些实例，其中筛选标记成功表达并不意味着目的基因的实际插入；即可能发生部分整合。显然，基因组的随机插入也意味着利用该方法无法控制插入位点，目前正致力于开发基于同源重组的方法。然而，据我们所知，此处描述的方法是当前唯一经过表征的、可用于生成基因修饰的Ostreococcus细胞的方法。
由于Ostreococcus tauri最近才被用作实验模式生物，目前大多数针对这些细胞的研究方法仍可能随着参与该领域研究的科研群体不断扩大而持续发展和完善。本实验方案旨在帮助研究人员开始对Ostreococcus的研究，但绝不声称涵盖了有关该微藻基因组转化的全部知识。作者相信，读者可根据自身需求对本方案进行调整，因为不同实验室在培养箱条件（光照强度或光质）及其他参数上可能存在细微差异，这些因素通常需要在各自实验室中进行优化，以获得本方案所需的健康藻种。在熟练掌握本文所述技术后，可构建相应的载体，以在多种启动子调控下产生发光、荧光或其他标签融合的藻株。这一令人振奋的新型实验平台将有助于研究在复杂性降低的真核生物中，复杂的生化问题是如何被解决的，同时该系统也极大地方便了药理学研究方法的实施3。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;培养基成分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海水盐</td><td>来自 &lt;a href=&quot;http://amazon.co.uk&quot; target=&quot;_blank">amazon.co.uk&lt;/a&gt; 或 &lt;a href=&quot;http://rocketaquatics.co.uk&quot; target=&quot;_blank">rocketaquatics.co.uk&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>S5506-250G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>A9434-500G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>甘油-2-磷酸二钠盐水合物</td><td>G9422-100G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SeO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>84920-250G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>超纯 Tris</td><td>15504-020</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>BPE120-500G</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>157740</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>31439-100G-R</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Z0251</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>31277</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>203734-5G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>C8027</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>维生素 B&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;（氰钴胺）</td><td>V2876</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>47868</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素 &amp;#8729; HCl</td><td>T4625</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>A9518-25G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>新霉素</td><td>N6386</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>K4000</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养用耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1810.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1813.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>T175 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1812.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>TPP 瓶顶过滤器，1L，完整套装</td><td>99950T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>TPP 瓶顶过滤器，500ml</td><td>99500T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>TPP 瓶顶过滤器，250ml</td><td>99250T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>TPP 瓶顶过滤器，150ml</td><td>99150T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>海水水族箱用盐度计</td><td>DSG-10</td><td>Daeyoon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;转化用化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>S6021-1KG</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 溶液</td><td>P5556-100ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ClonNat</td><td>51000</td><td>Werner</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>16520-050</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;转化用耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1810.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1813.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>T175 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶</td><td>83.1812.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Greiner 50ml 离心管</td><td>227261</td><td>GBO</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔杯，0.2 cm 间隙，50 个</td><td>165-2086</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td>圆形 PS 培养皿，3 个通气孔，H14.2 &amp;#934;55</td><td>391-0895</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>带四个通气孔的方形聚苯乙烯培养皿，经辐照灭菌，透明，120mm</td><td>FB51788</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>月光蓝光滤片</td><td>183</td><td>Lee Lighting</td><td></td></tr></tbody></table>

微真核生物 ostreococcus tauri 的基因组转化

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

阻碍植物科学快速发展的常见问题包括细胞、组织和整个生物体的复杂性，尤其是高等植物中基因组的高度冗余，这影响了简单的遗传学研究。新型模式生物Ostreococcus tauri是目前已知最小的自由生活的真核生物，其基因组大小和细胞结构显著简化1,2，表现为每个细胞中大多数细胞器（线粒体、叶绿体、高尔基体堆）仅有一个，基因组中仅包含约8000个基因。此外，其单细胞特性和易于培养的特性为化学生物学研究方法提供了理想的平台。近年来，Ostreococcus已成功用于研究昼夜节律调控的基本机制3-6。该模式生物的研究成果不仅影响了植物科学，也对哺乳动物生物学产生了影响7。这一实例凸显了在绿色谱系中的简单真核生物中进行快速实验，如何通过在复杂性显著降低的背景下生成可验证的假设，从而加速对更复杂生物体的研究，而这些方法在技术上仅在此类简化系统中可行。基因组信息以及基因修饰能力是任何模式物种研究中的基本工具。该物种的基因组1、转录组8和蛋白质组9数据均可免费获取，但此前报道的Ostreococcus遗传转化方法6,10目前全球仅有少数实验室掌握。
本文详细阐述了通过电穿孔法将过表达载体导入该新型模式生物进行遗传转化的实验方法，以及将转化细胞包埋于低浓度琼脂糖中以筛选源自单个转化细胞的转化株系的技术流程。在成功应用上述方法后 Ostreococcus 生物节律研究，对昼夜节律研究日益增长的兴趣 Ostreococcus 可来自植物科学内外的多个研究领域，包括生物技术领域。从事保守生化通路研究的广泛生物学与医学科学领域的研究人员可考虑开展相关研究 Ostreococcus，摆脱了较大模式物种的基因组和生物体复杂性。

本文介绍了通过电穿孔法对单细胞海洋绿藻Ostreococcus tauri进行遗传转化的方法。该真核生物作为高等植物的有效模式系统，具有显著简化的基因组和细胞结构，且易于进行细胞培养和化学生物学研究。

微真核生物 Ostreococcus tauri 的基因组转化

阻碍植物科学快速发展的常见问题包括细胞、组织和整个生物体的复杂性，以及基因组水平的高度复杂性……

本实验的总体目标是建立并筛选新型模式生物奥地利奥库斯藻（Austria Occus Tori）的稳定转基因品系，该生物为一种海洋微型真核藻类。首先，从每次转化所需的50毫升高密度藻类培养液中制备细胞沉淀，作为第一步；第二步是将细胞与线性化DNA混合，随后进行电穿孔转化。将转化后的细胞在新鲜培养基中稀释并过夜培养后，加入0.2%低熔点琼脂糖和一种选择性试剂，将混合物倒入小型培养皿中。最后一步是在持续蓝光条件下培养两到三周后，挑取生长出的菌落。最终通过液体培养基中的筛选以及后续的分子分析（如PCR和Southern印迹）来验证目标构建体已成功整合到转基因品系的基因组中。与拟南芥等现有模式生物相比，使用该生物体的主要优势在于可大幅降低基因组复杂性，从而能够在几乎不存在遗传冗余的背景下研究调控网络。尽管在我的实验室中我们已利用嗜热丝毛藻（osteo occus）来研究植物生物钟，但它也可用于研究许多其他复杂的细胞网络。因此，该技术的意义远不止局限于植物生物学领域。本方法的可视化演示至关重要，因为尽管各个步骤看似相对简单，但细胞的正确操作和高效的工作流程对于获得良好结果必不可少。本实验的部分操作将由来自实验室的研究助理Culin Kish进行示范。Austria Occus细胞在人工海水中或SW中进行培养，以制备SW溶液，即每升溶解40克。将海盐加入去离子水中，配制成盐度为千分之30（PPT）的溶液，使用盐度计测定。加入营养强化剂、微量元素和维生素，然后通过0.22微米滤膜过滤灭菌。将奥地利小球藻（Austria cocus）菌株O TT H 95的细胞置于该海水培养基中，在持续光照条件下培养。在配备月光蓝滤光片的植物培养箱中，光照强度应接近20微摩尔每平方米每秒，温度维持在20摄氏度。细胞培养无需持续振荡，但每两到三天需轻轻摇动一次，以防止细胞聚集。为维持培养，需每七天在新鲜的 a SW 中以 1:100 的比例对细胞进行无菌传代。每次转化需要 50 毫升细胞，细胞密度为每毫升 20 至 30 × 10⁶ 个细胞。该密度应在传代后五至七天内达到。至少在40倍显微镜下使用血细胞计数板可估算细胞密度和活率。更优选通过流式细胞术确定细胞密度和活率。此处展示了健康与非健康培养物的示例。每个生物参数图均以侧向散射光（SSC）为纵坐标，以每个细胞的红色荧光（FL3）为横坐标。FL3代表叶绿素的红色荧光，而SSC可反映细胞的相对大小。健康细胞位于集胞藻门（Austria Occus）区域窗口内，而正在死亡的细胞或污染的细菌则位于该窗口之外。理想情况下，应有超过99%的细胞位于奥地利Occus窗口内。为了实现高效的遗传转化，每次转化需要五微克纯化的线性化质粒DNA，浓度为每微升一微克。该质粒已在无菌去离子水中被一种酶线性化，该酶切割所用载体的骨架部分，但不切割转基因或筛选基因。将含有DNA的微量离心管与每个转化所需的两毫米电穿孔小瓶一同置于冰上。每种待转化的细胞系均需设置一个无DNA的对照组。对于每次转化，将50毫升细胞转移至带有锥形底部的试管中，加入0.1%泊洛沙姆F-68（Pluronic acid F 68），并在10摄氏度下以8,000 × g离心10分钟。为立即沉淀细胞，迅速弃去上清液，并向细胞中加入1毫升Resus重悬缓冲液。通过反复吹打使细胞重悬，转移至微量离心管中，在10摄氏度下以8,000 ×g离心10分钟。第二次离心后需快速操作，再次洗涤细胞一次。用剪切过的P 200枪头将每个沉淀重悬于40 µL重悬缓冲液中。在冰上，将40 µL重悬的细胞加入到各管线性化DNA中。轻轻混匀后转移至电穿孔管中。将vete放入电穿孔仪中。将参数设置为每倒数传感器六千伏、600欧姆和25微天。电穿孔后对细胞进行电刺激操作。将细胞在室温下的比色杯中孵育10分钟。在此期间，标记组织培养瓶，并向每个培养瓶中加入30毫升新鲜a SW。从每个培养瓶中取出1毫升a SW，轻轻加入相应的vete中，孵育2分钟。接下来，轻柔地取出含有细胞团的 a SW，并缓慢而轻柔地直接吹打至另一个 a SW 中。在培养瓶中，细胞通常会保持为一个较大的细胞团。此时需注意不要摇动或扰动已聚集的细胞。将细胞置于培养箱中静置恢复 1 至 2 小时。最后，通过手动摇晃锥形瓶使细胞重悬。此时，细胞应能自由重悬，无可见的细胞团块。将转化后的菌液置于培养箱中过夜培养以恢复生长。在电穿孔后的第二天，将含有磁力搅拌棒的瓶子中的双蒸水配制的 2.1% 低熔点琼脂糖溶液进行高压灭菌。在加热磁力搅拌器上，用一个较大的烧杯装水，将物质保持在 65 至 90 摄氏度的熔融状态。每次转化需准备八个 50 毫米的培养皿和八个 50 毫升的离心管，每管中含有 9 毫升 SW 培养基。这是所需的选择条件。从培养箱中取出转化后的细胞。该操作中最困难的部分是在不因过热而破坏细胞完整性的前提下，将转化细胞加入低浓度琼脂糖凝胶中。因此，必须在无菌操作台中快速且高效地完成接下来的几个步骤。向一支含有 9 毫升 SW 的试管中加入 1 毫升接近沸腾的低熔点琼脂糖。在其中一支试管中，盖紧管盖并倒置混匀。接着，加入 0.5 毫升新鲜转化的细胞。迅速盖紧管盖并倒置混匀，然后将内容物倒入培养皿中。用剩余的七支试管重复此过程，然后继续进行下一个转化烧瓶的操作。将培养皿在超净工作台中打开放置一小时，使琼脂凝固。随后盖上培养皿，并小心转移至大的方形培养皿中，每个方形培养皿可放置四个圆形培养皿。由于培养皿尚未完全凝固，凝胶非常脆弱。处理培养皿时需小心，避免破坏凝胶。用封口膜密封方形培养皿，并将其放入培养箱中。菌落出现后，使用200微升移液器，配以切尖的吸头。在无菌操作台中挑取菌落时，选择孤立的菌落，吸取一个绿色菌落，注意不要混入邻近菌落的细胞。将细胞转移到含有筛选剂的2毫升液体培养基中。在24孔板中，通过反复吹打混匀。每种转化挑选24或48个菌落后，用封口膜密封培养板，并转移至培养箱中。一周后，将每个孔中的100微升转移至含有筛选剂的2毫升新鲜SW培养基中。在24孔板中继续培养额外七天。存活的细胞系可用于后续研究，在转染5微克线性化DNA时使用。采用本方案后，每个转化平板在两到三周后应出现 20 至 60 个菌落。大约 80% 挑取的菌落通过液体培养基中的抗生素抗性被成功筛选出，并用于后续研究。后续可采用 PCR 或 Southern 印迹等方法，以验证沟基因插入的数量和位置。该技术使昼夜节律钟和细胞周期领域的研究人员能够深入了解各自系统的复杂组分与行为。在这一新型模式生物奥地利涡虫（Austria Caucus. Tori）中，通过观看本视频，您应已对如何构建转基因奥地利涡虫品系有了充分理解。

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基因改造的Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus金牛</em

本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P.

在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

来源：Stefan, A., et al., 大肠杆菌中蛋白共表达的多重优势。J. Vis. Exp. (2015)本视频演示了用携带抗生素抗性基因的质粒转化Escherichia...

使用高压电穿孔法进行细菌的制备与转化

使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

蛋白质共表达是重组表达的一种有力替代方法 体外 蛋白质复合物，并有助于进行生物化学和遗传学检测 体内。本文报道了蛋白质共表达的应用 大肠杆菌 以获取蛋白质复合物，并调节细胞的突变频率。...

Escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

基因枪转化是一种通过同源重组将DNA稳定整合到机会性病原体Cryptococcus neoformans基因组中的方法。我们将演示将一个编码乙酸激酶与荧光标签mCherry融合的基因构建体通过基因枪转化导入 C.

将荧光标记基因通过基因枪法转化至机会性真菌病原体 Cryptoc游戏副本occus neoformans

本文介绍了一套统一的方法，可用于开发、转化、施用和检测益生酵母Saccharomyces...

小鼠经口灌胃益生酵母的转化及其从胃肠道免疫组织中的回收

合成生物学可通过共翻译插入非经典氨基酸，实现具有前所未有特性的蛋白质的工程化。本文介绍了如何通过选择性压力整合（SPI）在E.

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

此处，我们介绍用于操作的实验方案 罗伊氏乳杆菌 DSM20016，详细描述了菌株生长、质粒转化、菌落PCR、荧光报告蛋白检测以及质粒小提的有限操作，同时涵盖常见问题及解决方案。这些实验方案可用于在DSM20016中检测报告蛋白的表达，或进行验证 通过 若不涉及报告基因，则采用菌落PCR。...

Limosilactobacillus reuteri DSM20016 中电穿孔与转化验证的方法

在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S.

延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

本方案采用一种生物发光报告基因，可实现对转录活性的检测 Saccharomyces eubayanus...

体内利用酵母生物发光报告系统监测代谢转换过程中的转录活性

了解利用电穿孔技术对海洋单细胞藻类Ostreococcus tauri进行遗传转化的方法。该技术可建立稳定的转基因细胞系，为研究植物基因调控网络提供简化基因组模型。

微真核生物 Ostreococcus tauri 的基因组转化

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