Name: 在OVO的HH阶段10个鸡胚Electroporations (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 了解鸡胚在体电穿孔技术，用于HH10期神经管基因操作研究脊髓发育。该方法可快速筛选基因功能，为中枢神经系统发育研究提供可靠实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

卵的处理
<ol>
<li>卵可在孵化前于13°C下保存长达一周，而不会显著降低存活率（小型葡萄酒冷藏柜非常适合此用途）。</li>
<li>孵化前，将卵升温至室温，然后放入设定为37.8°C（100°F）的加湿鸡胚孵化箱中。</li>
<li>我们通常在孵化开始后约48小时进行电穿孔，此时胚胎已达到Hamburger和Hamilton 10期。</li>
<li>孵化时间可根据所需Hamburger和Hamilton期进行调整。温度至关重要，偏离最佳孵化温度将改变孵化时间并降低胚胎存活率。</li>
<li>孵化期间，卵应侧放，以确保胚胎在电穿孔时处于正确位置。胚胎会漂浮在卵黄上方，因此在开窗前用铅笔标记卵的顶部位置有助于确定切割位置。</li>
</ol>
准备
<ol>
<li>将 Leibovitz L-15 培养基预热至 37°C。将玻璃毛细管拉制成针状。放置电极和显微操作器，并将电极连接至脉冲发生器。</li>
</ol>
窗宽窗位调节
<ol>
<li>使用带有粗针头的注射器，从鸡蛋的小端刺穿蛋壳。</li>
<li>小心将针头朝下，避免破坏蛋黄，抽出约 5ml 蛋白。</li>
<li>用一小块胶带封住穿刺孔。</li>
<li>用另一块胶带（约 4×4 cm）覆盖蛋的顶部。</li>
<li>使用弯头剪刀，小心操作以免损伤胚胎，剪出一个刚好足够大的开口，形成可供操作的窗口。</li>
</ol>
可选：为了观察神经管，可用26号针头将墨水溶液注射到胚胎下方（从血环外侧将针头插入胚胎下方）。印度墨水应使用Hanks液或类似的无菌缓冲液按1:5比例稀释。
注射与电穿孔
<ol>
<li>使用镊子将毛细管尖端折断至所需直径。</li>
<li>使用口吸移液器将质粒/Fast Green 染料吸入毛细管中。</li>
<li>将胚胎头部朝向操作者放置，以较小角度将针头插入神经管。</li>
<li>将质粒溶液注入神经管腔内，直至染料充满整个腔室。</li>
</ol>
注意：切勿使针尖直径大于神经管直径。通常情况下，可通过吸取液体时的难易程度来判断针尖是否达到理想大小。如果阻力极大，说明开口可能过小，应再次在较高位置折断针尖；如果阻力很小或几乎没有阻力，说明开口过大，应更换新的针头。
<ol>
<li>在胚胎上滴加一至两滴无菌 L-15 培养基。</li>
<li>立即将电极置于胚胎两侧，与神经管平行，以 10–24 伏电压进行 5 次脉冲，每次持续 50 毫秒，间隔 1 秒。若操作成功，可在电极附近观察到气泡产生。</li>
<li>小心移除电极，向胚胎上方滴加 5 滴 L-15 培养基，并用胶带密封蛋壳。务必确保蛋壳密封良好，因为干燥是电穿孔后胚胎丢失的主要原因。</li>
<li>将蛋放回孵育箱中，窗口朝上，继续孵育至达到所需的 H&amp;H 发育阶段。</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了对HH10期鸡胚进行神经管电穿孔的逐步操作指南。除了展示该技术外，还提供了鸡蛋的储存与操作规范。该技术在基因分析方面具有广泛的应用，其实验操作简便且成本低廉，适合众多实验室开展。

<table><tbody><tr><td>鸡胚孵育器</td><td></td><td></td><td>加湿型，设定为 37.80&amp;#x00B0;C (100F)。</td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>方波发生器或性能相当的设备</td></tr><tr><td>电极</td><td></td><td></td><td>我们的电极由直径 0.25 mm 的铂丝制成，长度为 5 mm，间距为 1 mm</td></tr><tr><td>连接电缆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>具有较大工作距离</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td></td><td></td><td>及拉针仪或商用玻璃针</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡胚蛋</td><td></td><td></td><td>受精蛋</td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粗孔针头</td><td></td><td></td><td>16–18G</td></tr><tr><td>口吸移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>印度墨汁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器/注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒 DNA</td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l，溶于含 0.05% 快绿染料的无菌 TE 缓冲液或 1X PBS 中</td></tr></tbody></table>

鸡胚hh10期在卵电穿孔实验

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

鸡胚体积较大且为体外发育，长期以来一直是发育生物学研究中的重要工具。随着分子生物学技术的发展，鸡胚已成为研究基因调控与功能的有用体系。通过将DNA或RNA构建体电穿孔导入发育中的鸡胚，可实现基因的过表达或敲低，从而在活体条件下分析基因功能。同样，报告基因构建体可用于细胞命运图谱的绘制，或用于检测推测的基因调控元件。与小鼠中的类似实验相比，鸡胚电穿孔具有快速、简便且成本低廉的优势。本视频首先演示如何在蛋壳上开窗以操作胚胎；随后，通过向胚胎下方注射稀释的印度墨水溶液使胚胎可视化；接着，使用玻璃针和移液器将DNA与快绿染料注入正在发育的神经管中，再将铂电极平行置于胚胎两侧，并利用脉冲发生器施加短暂电脉冲；最后，用封口胶带封闭蛋壳并将其放回培养箱中继续发育。此外，视频还展示了鸡蛋的正确储存与操作方法，并讨论了电穿孔后胚胎死亡的可能原因。

关键词：鸡胚，发育生物学，电穿孔，基因功能，基因调控，报告基因，神经管，印度墨水，DNA注射，胚胎操作

鸡胚体内电穿孔是一种能够对禽类胚胎进行遗传操作的技术。该技术的常见应用包括基因及假定增强子元件的功能分析。本视频展示了在HH 10期鸡胚中进行神经管电穿孔的操作过程，并讲解了注射技术以及正确的鸡蛋处理方法。

鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

鸡胚体型较大且为体外发育，长期以来一直是发育生物学研究中的重要工具。随着……的到来，

鸡胚是一个良好的模型系统，因为其胚胎易于操作，且体积较大，相比其他胚胎更易于实验操作。鸡胚电穿孔实验还可在短时间内对大量基因进行筛选。大家好，我是 Marissa Blank。我是芝加哥大学人类遗传学系Kathy Millon实验室的一名研究生。今天我将向大家介绍如何进行鸡胚和卵内电穿孔操作，我们将对汉堡-汉密尔顿第10期的鸡胚进行电穿孔，这相当于鸡胚胎发育约两天的阶段。该实验步骤在我们实验室常规进行，通常我们研究的是基因在脊髓中过表达或基因敲低所产生的效应，因为我们关注的是参与中枢神经系统发育的相关基因。今天我将向您展示的在体电穿孔技术包含多个步骤。第一步是打开蛋壳窗口，第二步是将DNA注射到神经管腔内。第三步是利用电场将DNA推入神经管的一侧。然后我会向您演示如何封闭鸡蛋，并将其放回培养箱中。好的，在开始之前，我想向您简要介绍一些关于正确处理鸡蛋的注意事项。因此，这些鸡蛋将从养鸡场购买，且为受精卵。由于这些鸡蛋含有胚胎，因此在操作时需格外小心。在孵化前，鸡蛋应保存在13摄氏度的环境中。为此，我们使用一个小型葡萄酒冷却器，当您准备孵化鸡蛋时，应先让鸡蛋恢复至室温，然后再放入孵化器中。鸡蛋放入孵化器后，应将孵化器温度维持在华氏100度左右，约等于57摄氏度。同时，保持孵化器内的湿度也非常关键，适宜的湿度对胚胎的正常发育至关重要。准备这些鸡蛋进行电穿孔的第一步是开窗。该操作的第一步是从鸡蛋中去除少量蛋清。因此，我在鸡蛋的一端贴上一小块胶带，然后使用粗针头在末端刺一个小孔，接着需格外小心，将针头朝向鸡蛋底部，以免破坏胚胎或蛋黄。我将使用注射器移除约五毫升的白蛋白。然后，我仅用另一小片透明胶带重新密封鸡蛋。在电穿孔过程中，透明胶带是一种理想的胶带，因为它无毒。下一步是在鸡蛋即将开窗的位置上方再贴一条胶带。在孵化过程中，必须将鸡蛋保持侧放，因为胚胎会漂浮到蛋黄的顶部。因此，在这个一直保持侧放的鸡蛋中，胚胎实际上就位于此处附近。在将鸡蛋放入培养箱之前，我已在蛋的顶部做了标记，以便了解胚胎在切开鸡蛋前的位置。现在，我将使用一把弯头剪刀，在蛋壳上先开一个小孔，然后切出一个窗口。切窗口时应尽可能小，以方便操作即可，如果需要，后续可以再扩大。现在我们已经完成了卵窗操作，接下来就可以进行实际的显微注射和电穿孔。为此，我们将转移至显微镜下操作。为了更好地观察胚胎，我将在胚胎下方注射一些印度墨汁。这实际上并不是我们实验室常规进行的操作。一旦完成这些实验，你通常无需使用对比剂就能看到胚胎，但会稍微难以辨认。因此，当墨水在胚胎下方扩散开时，你应该能够相当清晰地观察到神经管。因此，神经管是胚胎中部颜色较浅的区域。根据目前胚胎的朝向，其头部背向我，位于上方。这一阶段也被称为锤头阶段，你可以明显看出，因为胚胎的形状确实看起来像一个锤头。因此，在注射时，我通常会将胚胎旋转，使头部朝向我。当我注

in-ovo-electroporations-of-hh-stage-10-chicken-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在OVO的HH阶段10个鸡胚Electroporations

本视频演示了如何利用在特定增强子元件调控下通过in...

利用 in ovo 电穿孔技术解析鸡胚神经管中遗传定义神经元群体的轴突通路

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in...

在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

一种针对孵化后期（晚于汉伯格和汉密尔顿分期（HH）22期）鸡胚的基因转移方法被描述。该方法克服了传统方法的若干缺点。 在卵内...

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚 体外孵化 电穿孔

一种可实现神经管中基因表达在特定细胞类型中可追踪性下调的方法。我们展示了如何 在卵内 通过电穿孔导入基于 microRNA 的质粒以实现时空可控的 RNA...

in ovo miRNA 载体质粒电穿孔转染发育中神经管及通过 DiI 注射在开放式书本制备中评估表型

神经元网络如何在胚胎大脑中建立是发育神经生物学中的一个基本问题。在此，我们将电穿孔技术与新型遗传工具相结合，如在禽类后脑中使用Cre/Lox质粒和PiggyBac介导的DNA转座系统，以标记背侧中间神经元，并在不同发育阶段追踪其轴突投射及突触靶点。...

电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。...

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

我们报道了一种信使RNA（mRNA）电穿孔方法，该方法可在鹌鹑胚胎模型系统中快速高效地表达多种蛋白质。该方法可用于对细胞进行荧光标记，并在电穿孔后短时间内通过延时显微镜记录其在体内的运动过程。...

利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

本视频展示了从中肠胚期果蝇胚胎制备原代神经元培养物的方法。活细胞培养物的图像显示了接种后1小时的细胞状态，以及在碳酸氢盐为基础的限定培养基中生长2天后的分化神经元。这些神经元具有电兴奋性，并能形成突触连接。...

中肠胚期果蝇胚胎神经元培养物的制备

了解鸡胚在体电穿孔技术，用于HH10期神经管基因操作研究脊髓发育。该方法可快速筛选基因功能，为中枢神经系统发育研究提供可靠实验方案。

鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

探索更多视频