鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

鸡胚是一个优良的模型系统，因为其胚胎非常易于操作，且体积较大，相比其他胚胎更易于实验操作。鸡胚电穿孔实验还可在短时间内筛选大量基因。大家好，我是 Marissa Blank。

我是芝加哥大学人类遗传学系Kathy Millon实验室的一名研究生。今天我将向大家介绍如何进行鸡胚和卵内电穿孔操作，我们将对汉堡-汉密尔顿第10期的鸡胚进行电穿孔，这相当于鸡胚胎发育约两天的阶段。该实验步骤在我们实验室常规开展，通常用于研究基因在脊髓中过表达或敲低后的效应，因为我们关注的是参与中枢神经系统发育的相关基因。

今天我将向您展示的在体电穿孔技术包含多个步骤。第一步是打开蛋壳窗口，第二步是将DNA注射到神经管腔内。

第三步是利用电场将DNA推入神经管的一侧。然后我会向您演示如何封闭鸡蛋，并将其放回培养箱中。好的，在开始之前，我想向您简要介绍一些关于正确处理鸡蛋的注意事项。

因此，这些鸡蛋将从养鸡场购买，且为受精卵。由于这些鸡蛋含有胚胎，因此在操作时需格外小心。在孵化前，应将鸡蛋保存在13摄氏度的环境中。

为此，我们使用一个小型葡萄酒冷却器，当您准备孵化鸡蛋时，应先让鸡蛋恢复至室温，然后再放入孵化器中。鸡蛋放入孵化器后，应将孵化器温度维持在华氏100度左右，即约57摄氏度。同时，保持孵化器内的湿度也非常关键，适宜的湿度对胚胎的正常发育至关重要。

准备这些鸡蛋进行电穿孔的第一步是开窗。该操作的第一步是从鸡蛋中去除少量蛋清。因此，我在鸡蛋的一端贴上一小块胶带，然后使用粗针头在末端刺一个小孔，接着需格外小心，将针头朝向鸡蛋底部，以免损伤胚胎或蛋黄。

我将使用注射器移除约五毫升的白蛋白。然后，我将使用另一小块透明胶带重新密封鸡蛋。在电穿孔过程中，透明胶带是一种理想的胶带，因为它无毒。

下一步是在鸡蛋的顶部（即将开窗的位置）再贴一条胶带。在孵化过程中，必须将鸡蛋保持侧放，因为胚胎会漂浮到蛋黄的上方。因此，在这个一直保持侧放的鸡蛋中，胚胎实际上就位于此处附近。

我在将鸡蛋放入培养箱之前，已在蛋的顶部做了标记，以便在打开鸡蛋前了解胚胎的原始位置。现在，我将使用一把弯头剪刀先开一个小孔，然后切出一个窗口。窗口应尽可能小，以便进行操作，且如有需要，之后可随时将其扩大。

现在我们已经完成了卵窗操作，接下来就可以进行实际的显微注射和电穿孔了。为此，我们将移至显微镜下操作。为了能够清晰地观察胚胎，我会在胚胎下方注入一些印度墨汁。

这实际上并不是我们实验室常规进行的操作。一旦完成这些实验，你通常无需使用对比剂就能看到胚胎，但会稍微难以辨认。因此，随着墨水在胚胎下方扩散，你应该能够相当清晰地观察到神经管。

因此，神经管是胚胎中部颜色较浅的区域。根据目前胚胎的朝向，其头部背向我，位于上方。这一阶段也被称为锤头阶段，你可以明显看出，因为胚胎的形状确实看起来像一个锤头。

因此，在注射时，我通常会将胚胎旋转，使头部朝向我。当我注射胚胎时，目标区域是头部略微扩张位置的正下方。因此，我会集中注意力，将针头指向此处附近，并在此阶段进行注射。

你还可以在这里看到体节沿着神经管的两侧形成。好的，再次说明，这是头部，而这是神经管，将来会发育成脊髓。现在我们的胚胎已经准备就绪了。

我们将实际进行注射操作。进行注射所需的工具首先是玻璃毛细管。我们使用这些玻璃毛细管，并通过毛细管拉制仪将其拉制成玻璃针。

然后取此玻璃针。为了获得合适的注射孔径，需要将针尖折断。此操作既可在显微镜下进行，也可直接用肉眼完成。

因此，我通常只使用一把标准的5号镊子，然后将毛细管的尖端折断。如果折断的位置太靠后或太高，可能会导致开口尺寸不合适。如果开口过大，你会明显察觉到：当你试图将液体吸入毛细管时，不会感受到任何阻力。

因此，通常可以通过将液体吸入毛细管时所感受到的阻力大小来判断孔径是否合适。我们使用的另一件设备是口吸移液管。口吸移液管由三个部分组成。

有一个吹嘴，是一段由乳胶或硅胶制成的软管，具有柔韧性，然后是用于固定毛细管的部分。你需要将针头插入橡胶垫圈中以固定它。使用这些玻璃针时需要格外小心，因为它们非常锋利，如果刺伤自己，可能会折断一小段玻璃并残留在皮肤下，这会非常疼痛。

我发现，用于盛装含有快绿染料的血浆DNA的最佳管子是小型PCR管。现在，我将用毛细管吸取一些染料。好的。操作时请注意，不要让针头底部触碰到管底，否则会将其碰碎，就需要重新开始。

好的，现在针头已装好，准备进行注射。我已将胚胎在显微镜下调整至头部朝向我。

我将取含有快绿染料以及DNA的玻璃针，以较小的角度插入神经管，将针尖置入神经管的管腔内。操作时需注意不要穿透到对侧，否则染料会被注入胚胎下方。

现在，我已在显微镜下将胚胎调整至头部朝向我的位置。接下来，我将取一支装有快绿染料和DNA的针头，以较小的角度刺入神经管，从而填充神经管的管腔。

进行此操作时，需注意不要推进过度而穿透神经管的另一侧，否则会将DNA注入胚胎下方。如果染料渗漏到胚胎下方，现在可以看到神经管内已略微充满这种快绿染料。理想情况下，应避免这种情况发生。

你只需要确保神经管被充分填充，但你应该能够从头部到尾部全程填充神经管。现在我们已经将DNA注入神经管，接下来就可以进行电穿孔操作了。电穿孔装置就在我旁边的这个位置。

因此它由多个部分组成。第一部分是铂电极。铂电极固定在电极夹持器中，而电极夹持器由显微操作器固定，后者可用于升降电极，同时保持其正确位置。

电极连接至电缆，电缆再连接至脉冲发生器。通过脉冲发生器在电极之间产生短暂的电脉冲，从而将DNA强制导入神经管的一侧。对胚胎进行电脉冲处理时，通常使用25伏的脉冲电压。

我们进行五次持续50毫秒的脉冲，整个过程持续五秒钟。因此，这只是五次短暂的电脉冲。现在，电极已通过显微操作仪准确定位在胚胎正上方。

我将轻柔地将电极下放到胚胎上，使其与神经管平行。然后加入少量培养基，以帮助提高电流传导效率。最后对胚胎 Rio 施加电脉冲。

可以看到电极上有气泡形成，这是一个良好的迹象，表明电极确实起作用了，并且你已经建立了所需的连接。现在我将轻轻地将电极从胚胎中抽出，此时胚胎已准备就绪，可以进行封合。

现在我已经向您展示了如何对卵进行电穿孔。最后一步也非常重要，那就是将卵重新封合，以便其能够继续发育。正如我之前提到的，湿度对于胚胎的进一步发育非常关键。

因此，必须确保胚胎已正确密封。为此，只需取另一小段胶带覆盖住小孔，但需格外小心，确保胶带边缘完全密封，以防止蛋内湿度流失。随后，将蛋重新放回培养箱中，继续培养至需要分析的发育阶段即可。

综上所述，今天我向大家演示了如何处理汉堡氏第10期的鸡胚，特别是如何操作这些鸡胚的神经管。我刚刚展示的实验方案中的关键步骤首先是打开鸡胚的壳窗，同时不对其造成损伤；其次是将DNA注射到神经管中，同样要避免对鸡胚造成损伤。

第三，电极的正确放置对于在电穿孔步骤中将DNA准确导入目标位置至关重要。最后，我想提醒大家，在将胚胎放回孵育箱之前，必须妥善封闭蛋壳。当我们注射DNA时，通常使用带有GFP报告基因的质粒，并且一般将该GFP报告基因作为目的基因表达的指示标志。

电穿孔后，通常可在6至12小时内观察到GFP表达。然而，这并不一定意味着目的蛋白已达到最佳表达水平。因此，在进行此类实验时，建议在电穿孔后1至2天内分析胚胎，以获得最佳的表达水平。

祝您的实验顺利，感谢观看。