Name: 创建定义的气体环境研究缺氧对 C。线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习使用连续流动法建立缺氧室，研究低氧环境对秀丽隐杆线虫胚胎发育的影响。该方法操作简便、成本低廉，可精确控制气体浓度，适用于多种生物学实验。

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感谢Miller实验室成员对本文的讨论和审阅。本工作由Nathan Shock衰老基础生物学卓越中心授予DLM的新研究者奖以及美国国立卫生研究院授予DLM的R00 AG030550奖资助。

1. 环境室的构建
<ol>
	<li>根据实验规模选择所需最小合理体积的密闭室。密闭室必须由对气体（O2）不渗透的材料制成。可使用Pyrex结晶皿、Anaeropack培养盒或大型铸塑丙烯酸盒（Ellard Instrumentation）。我们发现，一个100 × 50 mm的Kimex结晶皿中可容纳9个50 mm的培养皿。玻璃板可用作Pyrex结晶皿的盖子。</li>
	<li>在选定的密闭室上钻孔，并安装塑料公鲁尔接头转软管接头（Cole Parmer）。可通过管件接头或环氧树脂固定接头。在容器的另一侧安装类似的接头，以允许气体流入和流出密闭室。如有可能，将孔位错开以增强气体湍流混合效果。</li>
	<li>准备含有特定O2浓度（以N2平衡）并经O2含量认证的标准压缩气瓶；对于无氧条件，使用高纯N2（&lt;10 ppm O2）。在长期实验中，建议使用自动切换调压阀，以避免干扰密闭室内的氧浓度。</li>
	<li>已有研究表明，生物体对低氧的反应具有温度依赖性15。通过将密闭室置于培养箱中，可维持不同温度条件。由于培养箱内温度可能分布不均，建议使用温度数据记录仪持续监测密闭室内部的温度。</li>
</ol>
2. 将气体连接至环境培养箱
<ol>
	<li>所有连接均使用外径为1/8英寸的管路，并通过快接接头或压紧式接头连接。管路应不透氧且不与O2发生反应，例如氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）或尼龙（Cole Parmer）。有关完整装置的示意图，请参见图1。</li>
	<li>将压缩气体钢瓶连接至流量控制装置，例如质量流量控制器（Sierra Instruments）或转子流量计（Aalborg）。确保钢瓶的上游压力在流量装置和软管接头的承受范围内。通常使用两级减压阀，第二级调节至所需压力[选择合适流速的方法见第三部分]。</li>
	<li>通过带有烧结玻璃砂芯的气体洗涤瓶，使气体鼓泡通过蒸馏水以实现加湿，然后导入环境室的一个接口，另一个接口保持开放以用于排气（见图1）。对于短期实验，气体加湿可防止培养皿干燥，但对于长期实验，可能需要监测湿度。</li>
	<li>可使用道康宁真空润滑脂密封环境室。在室盖上放置重物以确保气密性。为确认密封严密且气流充足，可将少量水置于戴着手套的手掌中，靠近环境室的出气接口，观察是否有气泡产生。</li>
</ol>
3. 选择流速
<ol>
	<li>假设混合完全，每次腔室体积被替换时，气体环境可实现90%的气体交换（菲克定律）。例如，在一个100 cc的腔室中，以100 cc/min的流速通气，1分钟后腔室内的原始室内空气将被90%的目标气体所取代，此后每分钟趋近于完全交换的程度将渐近地提高90%。</li>
	<li>更高的流速和更小的容器能更快达到目标氧浓度。对于100 x 50 Kimex容器（400 cc），以120 cc/min的流速通气，可在10分钟内实现99.9%的气体交换（3次体积替换）。该流速适用于大多数氧气条件。据我们所知，目前尚无系统研究探讨O2浓度变化速率对C. elegans反应的影响。</li>
</ol>
4. 活性检测样品的制备
<ol>
	<li>在低氧条件下，线虫通常会逃离琼脂平板表面。为防止此现象，可在平板边缘周围放置一圈棕榈酸（10 mg/ml 溶于乙醇）。随着乙醇挥发，棕榈酸会析出，在平板表面形成物理屏障。棕榈酸屏障对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的产卵速率、繁殖力或寿命无显著影响16。在低氧条件下，线虫钻入琼脂的行为并不更频繁，因此通常无需额外预防措施。</li>
	<li>
	<ol>
		<li>通过在未接种的线虫生长培养基（NGM）平板上，用碱性次氯酸钠溶液处理处于产卵期的成虫，获得同步化的群体17。与标准的大批量次氯酸盐漂白法不同，将1-100只成虫置于NGM平板表面的一小滴漂白液中，使漂白液被平板吸收17。至少12小时后，将同步化的L1幼虫转移至接种了活OP50细菌的平板上。或者，也可让产卵期成虫在平板上产卵2-3小时，以获得同步发育的线虫群体，或从混合群体中挑选L4期幼虫。</li>
		<li>应避免将经漂白处理的胚胎暴露于低氧环境，因其可能降低胚胎存活率13。为获取早期胚胎（2-4细胞期），可用刀片在少量水中切碎产卵期成虫，随后用口吸管将胚胎转移至平板，再进行低氧处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将平板密封于环境舱内。对照组动物应与处理组线虫在相同温度下置于常氧（室内空气）环境中。置于室内空气中的样品与置于通入室内空气的相同环境舱中的样品之间无明显差异。启动气体流动，并维持所需暴露时间。为确保气体浓度上升过程的一致性，暴露前务必更换气体洗涤瓶中的水。</li>
	<li>为检测胚胎存活率，将线虫在恢复常氧环境后继续培养48小时，此时其应发育至四龄幼虫或成虫第一天。记录存活情况，并对丢失无法追踪的个体进行删失处理。</li>
	<li>为观察经低氧处理的线虫，将线虫转移至22 mm2盖玻片上的一滴M9缓冲液中，然后将盖玻片倒置于含2%琼脂糖的M9缓冲液垫上17。必要时可使用左旋咪唑（25 mM）或叠氮化钠（10 mM）作为麻醉剂。由于叠氮化钠和左旋咪唑可能存在毒性，可能干扰某些观察结果，应谨慎使用18。</li>
</ol>
5. 快速收获暴露于低氧环境的线虫（示例：HIF-1 Western 杂交分析样品制备）
许多由缺氧诱导的效应在恢复常氧环境后会迅速逆转，包括恢复产卵12、胚胎发生过程中有丝分裂表位的磷酸化13以及HIF-1蛋白的降解9,19。为了在这些条件下获得可重复的实验结果，必须快速分离暴露于缺氧环境的动物。使用该装置可在两分钟内完成动物的收集并将其在液氮中速冻。尽管手套式缺氧培养箱可在无氧条件下操作样品，但其成本较高，且在除完全无氧以外的其他条件下的实用性有限。
<ol>
	<li>将 Bristol N2 线虫培养于 4 块 10 cm 高生长（HG）培养皿中，直至大多数线虫发育为产卵成虫17。用 15 mL 圆锥形离心管收集线虫，管中预先加入 1:5 的碱性次氯酸钠溶液，旋转孵育至线虫开始溶解，时间不超过 5 分钟9。用 M9 缓冲液洗涤线虫三次，每次以 1500 × g 离心，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>将漂白后的胚胎接种至 8 块 150 mm NGM 培养皿中，使其发育至 L4 幼虫阶段（Bristol N2 在 22 °C 下约需 48 小时）。将培养皿转移至环境培养箱中，分别暴露于低氧（1,000 ppm、5,000 ppm）和无氧（N2）条件下 4 小时。暴露时间可根据实验设计进行调整。虽然低氧暴露会立即影响产卵速率，但二细胞胚胎在暴露 16–18 小时后会死亡12。在此低氧培养系统中，最低暴露时间受限于达到气体平衡所需的气体交换速率。</li>
	<li>为每个实验样本标记一个 1.5 mL 微量离心管和一个 15 mL 圆锥形离心管。暴露于低氧条件的线虫在收集过程中更容易粘附于管壁。为防止此现象，可在每个 15 mL 圆锥形离心管中加入 100 μL 的 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）。若 SDS 干扰后续实验操作，可使用牛血清白蛋白（BSA）防止粘连。常规使用 SDS 或 BSA 未见明显差异。向 1.5 mL 微量离心管中加入 50 μL 2× 蛋白上样缓冲液（含 4% SDS、10% 2-巯基乙醇、微量溴酚蓝，溶于 30% 甘油（w/v）中）。准备好液氮杜瓦瓶备用。</li>
	<li>从低氧环境中取出线虫后，立即计时并记录操作时间。打开低氧培养箱盖，取出一个样本培养皿后迅速重新密封培养箱。用蒸馏水将线虫冲洗至尼龙滤膜上，再转移至 15 mL 圆锥形离心管中。在台式离心机中以 1500 × g 离心 15–20 秒，启用刹车。</li>
	<li>使用真空泵吸除管中大部分上清液，注意勿扰动管底的线虫沉淀。</li>
	<li>用移液器将线虫沉淀连同约 50 μL 液体转移至 1.5 mL 微量离心管中。密封管盖后立即浸入液氮中。</li>
	<li>重复上述步骤，直至所有样本均完成分离。为保证一致性，需对常氧空气对照样本执行相同操作流程。样本可于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
6. 代表性结果
通过检测生物体在低氧条件下的成年存活率，可观察到低氧对生物体的影响 C. elegans (图2）。由野生型Bristol（N2）和 hif-1(ia04) 所有缺失突变体均能在室内空气中存活2 浓度（210,000 ppm O2）。N2 线虫能够在5,000 ppm O₂环境中适应并存活至成年期2，而 hif-1 胚胎无法存活。这表明HIF-1对于适应环境中氧气水平的变化至关重要。10。无论N2还是 hif-1 动物可耐受1,000 ppm O₂的暴露2.
使用解剖显微镜和透明容器，可直接在低氧条件下观察线虫（图3）。将低氧培养舱直接置于解剖显微镜上，无需将线虫移出低氧环境即可观察其整体反应。显微镜可配备荧光照明装置（如图3所示），从而进一步拓展在低氧条件下可进行的观察类型。
<img alt="带有气流箭头、压力表和样品进样器设置的气相色谱系统示意图。" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 缺氧室示例。 气体流动方向由箭头指示。气体储存在含有特定 O2 浓度的压缩气罐中（1），并连接有两级减压阀（2）。气体从流量管底部进入（3），以正确的流速从顶部流出。随后气体流入鼓泡瓶（4），使气体湿润（通过观察气泡确保鼓泡瓶连接正确）。湿润后的气体经进气阀进入缺氧室（5），使样品暴露于缺氧环境中。最后，气体通过在室壁上钻出的排气孔排入室内。
<img alt="柱状图，氧气对存活率的影响，N2与hif-1在1000 ppm、5000 ppm及常氧条件下的水平。" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 胚胎在1,000 ppm O2、5,000 ppm O2及常氧（~210,000 ppm O2）条件下暴露后的存活率。 胚胎在持续气流式氧气培养室中，分别在各氧气条件下连续暴露24小时。 随后将线虫转移至常氧条件，使其继续发育48小时至成虫期，然后统计其发育至成虫的存活率。n&gt;50，N=5。
<img alt="显微镜装置，解剖显微镜置于实验台，气瓶，科学观测设备。" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 利用显微镜观察缺氧条件下的C. elegans。 蠕虫通过上述方法暴露于缺氧环境中。透明的环境培养室（由派热克斯结晶皿和玻璃板构成）直接放置在解剖显微镜的载物台上。图中展示了两种视角：一种包含完整的气体流路装置，另一种仅显示置于显微镜载物台上的培养室。

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</ol>

无利益冲突声明。

该方法提供了一种构建低氧环境的策略，可在实验室中维持精确控制氧气浓度的环境。这些培养舱为将生物体暴露于特定低浓度氧气条件下提供了一种简便的方法。2 并监测分子和生理层面的输出结果。所述环境舱由实验室自行组装，而非商业购买，因此可根据实验需求进行调整和修改。
该方法的一个显著优势在于其连续流动设计。这消除了通常在维持低浓度O2 在腔室中，当外部 O2 浓度要高得多（210,000 ppm O2 在室温空气条件下）。另一种方法是停流法，即在密闭腔室中维持低氧环境。即使存在微小泄漏（可能难以检测），也会导致无法通过停流法维持低氧条件。连续气流法通过压缩空气罐中设定氧浓度的气体持续置换腔室内的空气，并维持正压状态，从而防止泄漏干扰低氧环境的稳定。
从气体供应商处获取精确的预混氧气浓度可解决缺氧研究中的另一个难题。测量极低浓度的O2非常困难。大多数O2传感器受限于扩散作用，且价格昂贵。由于O2</...

<table><tbody><tr><td>管路（FEP 和 PTFE）</td><td>Cole Parmer Tygon</td><td>YO-95821-00 (1/8&quot; FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8&quot; PTFE)&amp;#8217; R-3603</td><td></td></tr><tr><td>压缩接头</td><td>Seattle Fluid Systems</td><td>06363-58 (M. coupler 1/16&quot;) 06363-62 (F. coupler 1/16&quot;) 06363-60 (M. coupler 1/8&quot;) 06363-61 (F. coupler 1/8&quot;)</td><td></td></tr><tr><td>流量管</td><td>Aalborg</td><td>PMR3-010073 (3 输出) PMR1-013520 (1 输出)</td><td></td></tr><tr><td>质量流量控制器</td><td>Sierra Instruments</td><td>810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)</td><td></td></tr><tr><td>压缩气体钢瓶</td><td>AirGas</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>塑料公鲁尔接头转软管接头</td><td>Cole Parmer</td><td>45505-41 (500 系列 1/16&quot;)</td><td></td></tr><tr><td>铸塑丙烯酸盒</td><td>Ellard Instrumentation</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>管件（黄铜或不锈钢）</td><td>Seattle Fluid Systems</td><td>B-402-1 (1/4&quot; 螺母) B-200-3 (1/8&quot; 三通接头) B-400-set (1/4&quot; 卡套) B-QM2-B1-200 (QM 本体 QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8&quot; 公接头)</td><td></td></tr><tr><td>道康宁真空润滑脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>厌氧袋盒（AnaeroPack box）</td><td>Misubishi Gas Chemical Company</td><td>R684004 (0.4 升) R685025 (2.5 升) R685070 (7.0 升)</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 气体洗涤瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL)</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶</td><td>Southern Biotechnology Associates</td><td>1032-05</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>Pierce Chemical</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>100 x 50 玻璃结晶皿</td><td>Kimax Kimble</td><td>23000</td><td></td></tr></tbody></table>

创建特定的气体环境以研究低氧对 c. elegans 的影响

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

氧气对所有后生动物的生存至关重要，已知仅有一种例外情况1. 氧气减少2 缺氧状态可能在疾病、正常发育或环境条件变化过程中出现2-5理解细胞在缺氧反应中所涉及的信号通路，可为从中风到癌症等多种人类疾病的治疗策略提供新的见解。这一目标在一定程度上受到技术难题的阻碍，这些难题与在遗传操作便利的模式生物中实现可控缺氧暴露相关。
线虫 秀丽隐杆线虫 非常适合作为研究缺氧反应的模式生物，因其易于培养且可进行遗传操作。此外，还可用于研究细胞对特定缺氧氧浓度的响应2 浓度不会产生混杂效应，因为 秀丽隐杆线虫 获得 O2 （及其他气体）通过扩散作用进行交换，而非通过协助性呼吸系统6已知参与缺氧反应的因子在进化上是保守的 秀丽隐杆线虫实际的缺氧反应取决于 O₂ 的特定浓度2 可获得的。在 秀丽隐杆线虫，暴露于中等程度缺氧会引发主要由 hif-1，高度保守的缺氧诱导型转录因子6-9. C. elegans 胚胎需要 hif-1 在 5,000–20,000 ppm O₂ 条件下存活27,10缺氧是“低于正常氧气水平”的通用术语2. 常氧（正常 O2）也难以界定。我们通常将含210,000 ppm O₂的室内空气视为标准2 为常氧状态。然而，已有研究表明 秀丽隐杆线虫 对 O 具有行为偏好2 浓度为 5-12%（50,000-120,000 ppm O）2)11在幼虫和成虫中， hif-1 可防止在 5,000 ppm O₂ 条件下由缺氧诱导的滞育212。然而， hif-1 在对较低浓度 O 的反应中不起作用2 （缺氧，操作性定义） &lt;10 ppm O2)13在缺氧条件下， 秀丽隐杆线虫 进入一种可逆的休眠状态，其中所有显微镜下可观测的生命活动均停止10不同条件下会产生不同的生理反应，这一事实凸显了在实验中精确控制氧气低浓度水平的重要性。2.
本文介绍一种用于构建和实施环境舱的方法，该环境舱可产生浓度定义明确、可靠且可重复的低氧条件2持续流动法可确保腔室快速达到平衡，并提高系统的稳定性。此外，腔室的透明性和可及性使得能够直接观察暴露于低氧环境中的动物。我们进一步展示了一种有效的收获方法 秀丽隐杆线虫 缺氧暴露后迅速采集样本，这对于观察缺氧条件下发生的诸多快速可逆性变化至关重要10,14该方法提供了一个基本框架，可根据不同实验室的需求进行简便修改，包括适用于不同的模型系统和多种气体。

本文详细介绍了如何使用连续流式缺氧室来生成具有特定氧气浓度的环境2 以理解生物体对氧气浓度降低的响应2该系统易于安装和维护，且具有足够的灵活性，可适应多种O2 浓度与模型系统

创建特定的气体环境以研究低氧对 C. elegans 的影响

氧气对所有后生动物的生存至关重要，仅有一种已知例外1。在疾病状态下，氧气供应减少（低氧）可能会发生，……

以下实验的目的是采用连续气流法建立并维持一个低氧环境培养箱。首先需要获取并制备实验所需的管路、烧瓶和培养室。第二步，连接氧气罐并调节流速，以达到所需的低氧水平。通过将气体通入装有去离子水的鼓泡瓶中，使气体水合。将水合后的气体连接至缺氧室，并将测试样品放入缺氧室中以暴露于缺氧条件下。通过观察个体能否存活至成年阶段，获得结果显示在缺氧条件下存在Hi F1依赖性的胚胎致死现象。与现有的方法（如手套箱）相比，该技术的主要优势在于其在实验室中易于构建且成本低廉，同时可为环境培养室提供精确且可重复的气体浓度。尽管该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的缺氧应答，但也可适用于其他系统，包括更大的模式生物和细胞培养。此外，该方法还可用于研究其他气体，如二氧化碳和硫化氢。本方案演示了如何构建一个缺氧培养箱。气体储存在含有特定氧浓度的压缩气罐中，并连接两级减压阀。气体从流量管底部进入，从顶部以正确的流速流出。随后气体流入起泡瓶以润湿气体。湿润后的气体经进气阀进入缺氧室，使样品暴露于缺氧环境中。最后，气体通过在室壁上钻出的排气孔排入室内。可以使用派热克斯（Pyrex）结晶皿或箭头包装盒作为环境培养室的主体。容器的体积应尽可能小，且材料必须对气体不渗透。使用碳或金刚石钻头在容器的一侧钻孔，并安装塑料软管接头。在将环氧树脂涂敷到盒体和配件之前，先将其混合均匀。然后在容器的另一侧重复相同的步骤，第二个孔的位置应与第一个孔错开。为增强湍流混合效果，使用外径为 1/8 英寸的 FEP 或尼龙管将压缩气体钢瓶连接至流量控制装置，例如质量流量控制器或转子流量计。气体钢瓶中的氧气浓度应使用氮气进行平衡，且氧气含量需符合已认证的标准，或达到无氧条件。使用纯氮气时，应采用两级减压阀，并将第二级调节至所需压力。有关选择合适流速的说明，请参见书面实验方案中的指导。然后将双级减压阀的管路连接至控制进入腔室气体流速的流量管。流量管的出口端连接一个内装蒸馏水并带有烧结玻璃筒的气体洗涤瓶。再将洗涤瓶另一侧的管路连接至环境腔体上的一个接头。这将使进入环境室的气体保持湿润。使用真空脂密封环境室，然后在环境室盖子上放置重物，以确保密封严密不漏气。通过在戴手套的手掌中取少量水，接触培养室的气体排出口接头，观察是否有气泡产生，以检测密封性。首先，制备同步化的海蜗牛种群。在未接种的线虫生长培养基平板表面，将1至100只GR成虫置于一滴碱性次氯酸钠溶液中。在孵育至少八小时后，使漂白液充分吸收至平板中。将同步化的L1幼虫转移至接种了活体OP50细菌的平板上。或者，让GRA成虫在平板上产卵两到三小时，以获得一组同步发育的线虫，或从混合群体中挑选L4幼虫以收集年轻的胚胎。在二至四细胞阶段，用刀片在少量水中切碎GR成虫，然后用口吸管将胚胎转移，再将线虫转移到培养皿中以暴露于低氧条件。在培养皿边缘周围放置一圈浓度为10毫克/毫升的棕榈酸乙醇溶液，以防止线虫逃离琼脂培养基表面。棕榈酸将从溶液中析出。随着乙醇蒸发形成物理屏障以确保均匀性，在将样品放入环境舱之前，务必更换气体洗涤瓶中的水。将线虫转移至培养板后，将培养板密封于环境舱中，启动气体流，持续暴露至所需时间以进行检测。为评估胚胎发育至成虫的存活率，将线虫在恢复常氧环境后继续培养48小时，此时线虫应发育至四龄幼虫或一龄成虫阶段，记录其发育至成虫的存活率。为观察线虫在低氧暴露后的表型，将线虫转移至含有M9缓冲液的液滴中，置于22毫米方形盖玻片上，如有需要，将其倒置在含有2%琼脂糖的M9缓冲液垫上。可使用25毫摩尔的amol或10毫摩尔的叠氮化钠作为麻醉剂。或者，在暴露于低氧环境后，可将透明环境室直接放置在解剖显微镜的载物台上。图中显示了两个视角，其一包含完整的气体流动装置。另一个仅将小室置于显微镜载物台上。在四个直径为10厘米的高型培养板上培养Bristol N2线虫，直至大部分线虫发育至GR成虫阶段。用1:5的碱性次氯酸钠溶液将线虫冲洗至15毫升圆锥形离心管中，并在旋转孵育器中孵育，直至线虫开始溶解。不超过五分钟。用M9溶液清洗线虫三次，每次以1,500 × g离心，两次清洗之间无需使用破碎板。将漂白后的胚胎转移至8个150毫米的NGM平板上，让胚胎发育约48小时至L4幼虫阶段。在22摄氏度条件下，将培养皿放入环境舱中，并置于低氧和无氧环境中处理四小时，或根据实验设计规定的时长进行处理。为快速收获样品，需打开低氧舱的盖子。取出一个样品培养皿后，立即重新密封舱体，并记录操作步骤和时间。将线虫从缺氧环境中取出后，整个操作过程应少于两分钟。用去离子水将线虫冲洗至尼龙滤膜上，然后倒入已标记的15毫升锥形管中，管内含有100微升1% SDS溶液，随后在台式离心机中以1,500 × g离心15至20秒。暂停时，使用真空装置从管中移除大部分上清液，保留虫体沉淀不受扰动。用移液器将虫体沉淀连同预定体积的液体转移至已标记的1.5 mL离心管中。若样品将用于SDS-PAGE，则可在该管中加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液，密封管子后浸入液氮中。重复上述步骤，直至所有样品均被分离。为保持一致性，室内空气对照样品也需按照相同流程处理，并可于-20摄氏度保存。该图显示了暴露于1000 ppm氧气、5000 ppm氧气以及常氧环境（约210,000 ppm氧气）下胚胎的存活率。将胚胎置于持续流动的氧气培养室中，每种条件下暴露24小时。随后将线虫转移至常氧条件下培养48小时，使其发育至成年，记录成年存活率。完成此步骤后，可收集样品用于后续分析，如蛋白质印迹、定量PCR或寿命、子代数量等生理学检测。观看本视频后，您应该能够清楚地了解如何在自己的实验室中搭建连续流式缺氧培养箱。

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生物学

创建定义的气体环境研究缺氧对<em&gt; C。线虫</em

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