创建定义的气体环境研究缺氧对 C。线虫

以下实验的目的是采用连续气流法建立并维持一个缺氧培养箱。首先需要获取并制备实验所需的管路、烧瓶和培养室。第二步，连接氧气罐并调节流速，以达到所需的缺氧水平。

通过将气体通入装有去离子水的鼓泡瓶中使其水合。将水合后的气体连接至低氧培养箱，并将待测样品放入箱内以暴露于低氧环境中。实验结果表明，在低氧条件下，Hi F1 依赖性胚胎致死率可通过观察个体能否存活至成年而得以确定。

与现有的手套箱等方法相比，该技术的主要优势在于其在实验室中易于构建且成本低廉，同时可为环境培养室提供精确且可重复的气体浓度。虽然该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的缺氧反应，但也可适用于其他系统，包括更大的模式生物和细胞培养。此外，该方法还可用于研究其他气体，如二氧化碳和硫化氢。

本方案演示了如何构建一个缺氧室。气体储存在含有特定氧气浓度的压缩气罐中，并连接一个两级调节器。气体从流量管底部进入，从顶部以正确的流速流出。

随后气体流入起泡瓶，使气体被水合。水合后的气体经进气阀进入缺氧室，使样本暴露于缺氧环境。最后，气体通过在室壁上钻出的排气孔排入室内。

可使用Pyrex结晶皿或箭形包装盒作为环境室的主体。容器的体积应尽可能小，且材料必须对气体不渗透。使用碳或金刚石尖头钻头在容器一侧钻孔，并安装塑料软管接头。

在将环氧树脂涂抹到盒体和配件之前先将其混合均匀。然后在容器的另一侧重复相同的步骤，第二个孔的位置应与第一个孔错开。为了增强湍流混合效果，使用外径为1/8英寸的FEP或尼龙管将压缩气体钢瓶连接至流量控制装置，例如质量流量控制器或转子流量计。

气体钢瓶中的氧气浓度应有明确定义，并以氮气平衡，符合氧气含量的标准或无氧条件的要求。使用纯氮气时，应配备两级减压阀，并将第二级调节至所需压力。有关选择合适流速的说明，请参见书面实验方案中的操作指南。

然后将双级减压阀的管路连接到流量管上，以控制进入环境室的气体流速。流量管的出口端连接一个装有蒸馏水的鼓泡瓶，该鼓泡瓶内含烧结玻璃筒。再将洗气瓶另一侧的管路连接至环境室的一个接口上。

这将使进入环境室的气体保持湿润。使用真空润滑脂密封环境室，然后在室盖上放置重物，以确保密封严密不漏气。

通过将少量水置于戴手套的手掌中，并将其接触腔室的气体排放接头，观察是否有气泡产生，以测试密封性。首先，制备同步化的海藻螺群体。在未接种的线虫生长培养基平板表面，将1至100条GR成虫置于一滴碱性次氯酸钠溶液中。

在孵育至少八小时后，使漂白液充分渗入培养板。将同步化的L1幼虫转移至接种有活体OP50细菌的培养板。或者，让GRA成虫在培养板上产卵两到三小时，以获得同步发育的线虫群体；也可从混合种群中挑选L4幼虫，以收集年轻的胚胎。

在二至四细胞阶段，用刀片将秀丽隐杆线虫成虫在少量水中切碎，然后用口吸管将胚胎转移，再将线虫转移至培养皿中以暴露于低氧条件下。在培养皿边缘周围放置一圈浓度为10毫克/毫升的棕榈酸乙醇溶液，以防止线虫逃离琼脂培养基表面。

棕榈酸将从溶液中析出。随着乙醇蒸发形成物理屏障以确保均匀性，在将样品放入环境舱暴露前，务必更换气体洗涤瓶中的水。将线虫转移至培养板后，将培养板密封于环境舱中，启动气体流动，并维持所需暴露时间以进行检测。

为评估胚胎发育至成虫的存活率，将线虫在恢复常氧环境后继续培养48小时，此时线虫应发育至四龄幼虫或一龄成虫阶段，记录其发育至成虫的存活率。为观察线虫在低氧暴露后的表型，将线虫转移至含有M9缓冲液的液滴中，置于22毫米方形盖玻片上，如有需要，将其倒置在含有2%琼脂糖M9垫片上。

可使用25毫摩尔的amol或10毫摩尔的叠氮化钠作为麻醉剂。或者，在暴露于低氧环境后，可将透明环境室直接放置在解剖显微镜的载物台上。图中显示了两个视角，其一包含整个气体流动装置。

另一个仅将培养室置于显微镜载物台上。在四个直径10厘米的高型培养板上培养Bristol N2线虫，直至大部分线虫发育为生殖成熟成虫。用1:5的碱性次氯酸钠溶液将线虫冲洗至15毫升锥形管中，并在旋转条件下孵育，直至线虫开始溶解。

不超过五分钟。用M9缓冲液洗涤线虫三次，每次洗涤之间以1,500 × g离心，无需使用破碎板。将漂白后的胚胎转移至8个150毫米的NGM平板上，让胚胎发育约48小时至L4幼虫阶段。

在22摄氏度条件下，将培养皿移入环境控制舱内，并置于低氧和无氧环境中处理4小时，或根据实验设计规定的时长进行处理。为快速收获样品，需打开低氧舱的盖子。取出一个样品培养皿后，立即重新密封舱体，并记录操作步骤和时间。

将线虫从缺氧环境中取出后，整个操作过程应少于两分钟。用去离子水将线虫冲洗至尼龙滤膜上，然后倒入已标记的15毫升锥形管中，管内含有100微升1% SDS溶液，随后在台式离心机中以1,500 × g离心15至20秒。

暂停后，使用真空装置从管中移除大部分上清液，保留虫体沉淀不受扰动。用移液器将虫体沉淀与预定体积的液体转移至已标记的1.5 mL离心管中。如果样品将用于SDS-PAGE，则可在该管中加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液，密封管子后浸入液氮中。

重复上述步骤，直至所有样品均被分离。为保持一致性，室内空气对照样品也需按照相同流程处理，且样品可保存在零下20摄氏度。该图显示了暴露于1000 ppm氧气、5000 ppm氧气以及常氧环境（约210000 ppm氧气）下胚胎的存活率。

将胚胎置于持续通氧的培养 chamber 中，每种条件下暴露24小时。随后将线虫转移至常氧条件下，使其继续发育48小时至成虫期，然后记录其发育至成虫的存活率。完成该步骤后，可收集样品用于后续分析，如 Western blot、QPCR 或寿命、子代数量等生理学检测。

观看本视频后，您应该能够清楚地了解如何在自己的实验室中搭建连续流式低氧培养箱。