Name: Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a crear ambientes de hipoxia controlados mediante flujo continuo para estudiar efectos del oxígeno bajo en C. elegans. Este método permite investigar letalidad embrionaria dependiente de HIF-1 y viabilidad.

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Damos las gracias a los miembros del laboratorio de Miller para la discusión y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio nuevo investigador del Centro de Choque Nathan de Excelencia en la biología básica de vejez para DLM y los Institutos Nacionales de Salud de adjudicación del R00 AG030550 de DLM.

1. Construcción de cámaras de medio ambiente <ol><li> Seleccione el tamaño de volumen razonable de la cámara necesarios para el alcance de su proyecto. Cámara debe estar hecha de gas (O 2) material impermeable. Platos Pyrex cristalización, cajas Anaeropack o grandes acrílico fundido cajas (Ellard Instrumentación), se pueden utilizar. Hemos encontrado que 9 mm placas 50 puede encajar en un 100 x 50 placa de cristalización Kimex. Las placas de vidrio se puede utilizar como tapas para platos de cristalización Pyrex. </li><li> Haga un agujero en la cámara seleccionada y se ajustan con un macho de plástico Luer de conexión de la manguera púa (Cole Parmer). Accesorios, puede obtenerse mediante instalación de tuberías o con epoxi. Instalar un accesorio similar en el lado opuesto del recipiente para permitir que el gas fluya dentro y fuera de la cámara. Si es posible, compensar los agujeros para incrementar la mezcla turbulenta. </li><li> Obtener los tanques de gas comprimido, con definidas concentraciones de O2 (en equilibrio con N 2) que están certificados estándar de O 2 COntent o, en condiciones de anoxia, puro N 2 (&lt;10 ppm de O 2). Utilice conmutación automática reguladores de estudios a largo plazo para evitar la interrupción de los niveles de oxígeno en las cámaras. </li><li> Organismos respuesta a la hipoxia se ha demostrado que es dependiente de la temperatura 15. Al colocar la cámara en una incubadora, diferentes temperaturas puede ser mantenida. Las temperaturas dentro de una incubadora puede ser desigual y, como tal, es prudente hacer uso de un registrador de datos de temperatura para medir continuamente la temperatura dentro de la cámara. </li></ol> 2. Conexión del gas a la Cámara del Medio Ambiente <ol><li> Para todas las conexiones, utilice un octavo de pulgada de diámetro exterior de un tubo conectado a través de conectores rápidos, ya sea o accesorios de compresión. Tubería debe ser impermeable y no reactivo con O 2, tales como etileno propileno fluorado (FEP) o nylon (Cole Parmer). Para una vista esquemática de la instalación completa, véase la Figura 1. </li><li> Conecte el comprensadas tanques de gas a un dispositivo de control de flujo, tales como un controlador de flujo másico (Sierra Instruments) o rotámetro (Aalborg). Asegurarse de que la presión aguas arriba del tanque está dentro del alcance del dispositivo de flujo y los accesorios de la manguera lengüeta. Dos etapas reguladores se utilizan generalmente, con la segunda etapa establece en la presión deseada [Véase la sección tres para seleccionar la velocidad de flujo apropiado] </li><li> Hidrato del gas por burbujeo a través del agua destilada utilizando una botella de lavado de gas con el cilindro poroso, a continuación, directamente en uno de los accesorios en la cámara ambiental, dejando el accesorio segunda abierto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudios a corto plazo, la hidratación de gas protege contra la desecación plato, pero el monitoreo de humedad puede ser necesario para estudios a largo plazo. </li><li> Dow Corning grasa de vacío se puede utilizar para sellar la cámara. Coloque pesos en la tapa de la cámara para asegurar un sello hermético. Para confirmar un cierre hermético y un flujo adecuado, mantener una pequeña piscina de agua en la palma de la mano de ynuestra mano enguantada a la conexión a cabo en la cámara y compruebe si hay burbujas. </li></ol> 3. Selección de velocidad de flujo <ol><li> Suponiendo una mezcla perfecta, existe un 90% el intercambio de gases de la atmósfera gaseosa cada vez que se sustituye el volumen de la cámara (Ley de Fick). Por ejemplo, en una cámara de 100 cc con un caudal de 100 cc / min, la casa original de aire en la cámara será reemplazado con un 90% de su gas deseado después de 1 minuto, y se aproximará asintóticamente intercambio completo en un 90% cada minuto posteriormente. </li><li> Las mayores tasas de flujo y pequeños contenedores llegarán a su concentración deseada de oxígeno con mayor rapidez. Para 100 x 50 Kimex contenedores (400 cc), un caudal de 120 cc / min llegará a 99,9% de cambio en 10 minutos (3 intercambios). Este caudal es adecuado para la mayoría de condiciones de oxígeno. Para nuestro conocimiento no ha habido una investigación sistemática de cómo la tasa de cambio de concentración de O 2 influye en la respuesta en C. elegans. </li></ol><ol><li> Los gusanos expuestos a condiciones hipóxicas comúnmente escapar de la superficie de placas de agar. Para evitar esto, colocar un anillo de ácido palmítico (10 mg / ml en etanol) alrededor del borde de las placas. El ácido palmítico se salgan de la solución como se evapora el etanol, formando una barrera física. Las barreras de ácido palmítico no afectar la tasa de puesta de huevos, la fecundidad o la esperanza de vida en C. elegans 16,17. Madriguera no se produce con más frecuencia en condiciones de hipoxia, las medidas preventivas adicionales que no lo son por lo general requiere. </li><li><ol><li> Generar las poblaciones sincronizadas por el blanqueo adultas grávidas en una pequeña gota de solución de lejía alcalina de cabezas de serie de nematodos de crecimiento de los medios (NGM) placas 18. En contraste con los protocolos estándar de hipoclorito de gran lote de blanqueo, recoger 1-100 animales en una gota de solución de cloro en la superficie de una placa de NGM, a continuación, permitir que la solución de cloro para absorber en la placa <sup&gt; 18. Después de al menos 12 horas, trasladar las larvas L1 sincronizada a las placas sembradas con vivos OP50 bacterias. Alternativamente, se puede permitir que los adultos grávidas que ponen huevos en el plato durante 2-3 horas para generar un grupo de gusanos que se desarrollará de forma sincrónica o recoger larvas L4 de una población mixta. </li><li> Evite la exposición de embriones blanqueados a la hipoxia, ya que esto puede reducir la viabilidad 13. Para recoger los embriones jóvenes (2-4 células), los adultos grávidas puede ser cortada en un pequeño volumen de agua con una hoja de afeitar y los embriones se trasladó a las placas por pipeta boca para la posterior exposición a la hipoxia. </li></ol></li><li> Sellar las placas en la cámara ambiental. Los animales de control deben mantenerse en normoxia (casa aire) a la misma temperatura que los gusanos tratados. No hay diferencia observable entre las muestras que quedan en casa aire y los mantienen en una cámara idéntica a casa aire que fluye sobre ellos. Iniciar el flujo de gas y mantener la exposición durante el tiempo deseado. Para garantizar la uniformidad en la rampa, asegúrese dereemplazar el agua de la botella de lavado de gas antes de la exposición. </li><li> Para la supervivencia de embriones ensayo, permita que los gusanos a desarrollar durante 48 h después de la vuelta al aire ambiente, momento en el que debe ser la cuarta etapa larvas / día uno adultos. Goles para la supervivencia, la censura de los gusanos que no pueden tenerse en cuenta. </li><li> Para visualizar los animales expuestos a la hipoxia, mover los gusanos a una gota de M9 en un 22 mm 2 cubreobjetos, y se invierte en una almohadilla de agarosa al 2% en M9 18. Si el levamisol es necesario, (25 mM) o azida de sodio (10 mM) se puede utilizar como anestésico. La azida de sodio y levamisol podría confundir a algunas observaciones debido a la toxicidad y debe ser utilizada con prudencia 19. </li></ol> 5. Cosecha rápida de hipoxia expuestos gusanos (por ejemplo: preparación de muestras para HIF-1 Análisis de Western) Muchos la hipoxia inducida por los efectos se revirtieron rápidamente a su regreso al aire de la habitación, incluida la reanudación de la producción de huevos 12, la fosforilación de epítopos mitóticasen la embriogénesis 13 y la degradación de la proteína HIF-1 9,20. Aislamiento rápido de los animales expuestos a la hipoxia se requiere para obtener los efectos reproducibles en estas condiciones. Con esta configuración, los animales pueden ser cosechadas y se congelaron en nitrógeno líquido en menos de dos minutos. Mientras que las cámaras de hipoxia caja de guantes permiten la manipulación de las muestras en condiciones de anoxia, su costo y la practicidad para fines distintos a la anoxia limitar su utilidad. <ol><li> Crecer Bristol gusanos N2 en 4 de 10 cm de alto crecimiento (HG) las placas hasta que la mayoría de los gusanos son adultas grávidas de 18 años. Lavar gusanos a un tubo cónico de 15 ml que contiene una solución 01:05 lejía alcalina y se incuba con la rotación hasta que los gusanos empiezan a disolverse, no más de 5 minutos 9. Lave los gusanos tres veces con M9, desacelerándose a 1500 xg entre cada lavado sin frenos. </li><li> Placa blanqueados embriones sobre 8 150 mm y placas de NGM permitan desarrollar larvas L4 (aproximadamente 48 horas de Bristol N2 a 22 ° C).Mueva placas de cámaras ambientales y exponer a hipóxica (1.000 ppm, 5.000 ppm) y anóxicas (N2) condiciones durante 4 horas. Los tiempos de exposición variará dependiendo del diseño experimental. Mientras que la exposición a la hipoxia tiene un efecto inmediato sobre la tasa de puesta de huevos, embriones de dos células mueren después de 16-18 horas de la exposición 12. Con esta configuración cámara hipoxia, el límite inferior de la exposición se ve limitada por el tipo de cambio atmósfera necesaria para alcanzar el equilibrio. </li><li> Etiqueta de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un tubo de 15 ml cónico para cada muestra experimental. Los gusanos expuestos a la hipoxia son más propensas a pegarse a las paredes del tubo durante la cosecha. Para evitar esto, el lugar 100 l de sulfato de sodio al 1% de dodecil (SDS) en cada tubo cónico de 15 ml. Si SDS inhibe aplicaciones posteriores, albúmina de suero bovino (BSA) se puede utilizar para evitar que se pegue. El uso rutinario de la SDS o BSA no parecen tener una diferencia evidente. Añadir 50 l de 2x proteína carga colorante (4% de SDS, 10% de 2-mercaptoetanol y unrastrear de azul de bromofenol en 30% de glicerol (w / v)) para el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tener un Dewar de nitrógeno líquido listo. </li><li> El tiempo de los pasos después de la eliminación de los gusanos de la hipoxia y el registro. Retire la tapa de la cámara de hipoxia, tomar un plato de muestras, y cerrar la cámara. Use agua destilada para lavar los gusanos a un filtro de nylon y luego verter en el tubo cónico de 15 ml. Haga girar los gusanos en una centrífuga de sobremesa a 1500 xg durante 15-20 segundos con freno. </li><li> Utilizar un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el gusano de pellets. </li><li> Con una pipeta, mover el gusano de pellet en 50 l del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cierre el tubo y se sumergen en nitrógeno líquido. </li><li> Repita hasta que todas las muestras han sido aislados. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire de la casa de la coherencia. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C. </li></ol> 6. Los resultados representativos Organismal efectos de la hipoxia puede versemediante el examen de la viabilidad a la edad adulta de C. elegans (Figura 2). Los embriones puestos por tipo salvaje Bristol (N2) y HIF-1 (ia04) mutantes de deleción son todos sobreviven en la casa de aire concentraciones de O2 (210.000 ppm de O 2). N 2 los gusanos son capaces de adaptarse y sobrevivir a la edad adulta en ppm S 5000 2, mientras que HIF-1 embriones no son viables. Esto demuestra que HIF-1 es esencial para la adaptación a los niveles cambiantes de oxígeno disponible en el entorno 10. Ni N2, ni animales de HIF-1 puede sobrevivir a la exposición a 1.000 ppm de O 2. Visualización de gusano directamente en la hipoxia es factible con el uso de un microscopio de disección y recipiente transparente (Figura 3). Al colocar directamente la cámara de hipoxia en el microscopio de disección, no hay necesidad de eliminar los gusanos de la hipoxia para observar las reacciones de organismos. El ámbito puede estar equipado con illumation fluorescencia (como en la Figura 3 </strong&gt;), ampliando aún más los tipos de observaciones en la hipoxia que son posibles. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figura 1. Ejemplo de hipoxia cámara. La dirección del flujo de gas se indica por las flechas. El gas se almacena en los tanques de gas comprimido con definidos O 2 concentraciones (1) y un regulador de dos etapas se adjunta (2). El gas entra la parte inferior del tubo de flujo (3), que sale de la parte superior a la tasa de flujo correcto. El gas fluye en el matraz de burbuja (4), la hidratación del gas (asegurar la correcta conexión de burbuja matraz mediante la observación de burbujas). Gas hidratado luego pasa a la cámara de hipoxia en la válvula de entrada (5), exponiendo las muestras a la hipoxia. El gas, finalmente, los respiraderos en la habitación a través de un orificio de escape perforado en la cámara. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figura 2. La viabilidad de los embriones expuestos a 1000 ppm de O 2, 5000 ppm de O <sub&gt; 2 y normoxia (~ 210.000 ppm de O 2). Los embriones fueron expuestos a las condiciones de cada uno de oxígeno como embriones de 24 horas continuas en cámaras de flujo de oxígeno. Los gusanos fueron trasladados a normoxic condiciones, permitieron el desarrollo hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego anotó para la viabilidad a la edad adulta. n&gt; 50, N = 5. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización de C. elegans en la hipoxia con el microscopio. Los gusanos están expuestos a la hipoxia utilizando los métodos descritos. La cámara transparente ambiental (construido con una placa de cristalización Pyrex y la placa de vidrio) se coloca directamente en la etapa de un microscopio de disección. Dos puntos de vista se muestran, uno que incluye el flujo de gas de todo el conjunto, los otros sólo con la cámara sobre la platina del microscopio.

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No hay conflictos de interés declarado.

Este método presenta una estrategia para construir un entorno hipóxico que permite ambientes con concentraciones exactas de oxígeno para ser mantenidas en el laboratorio. Estas cámaras proporcionan un método sencillo para exponer a los organismos específicos bajas concentraciones de O 2 y el seguimiento de las salidas moleculares y fisiológicas. La cámara ambiental descrito es montado por el laboratorio en lugar de comercialmente adquirida y por lo tanto puede ser modificado para adaptarse a las necesidades d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubería (FEP y PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Accesorios de compresión </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06.363-58 (M. acoplador de 1/16 &quot;) 06363-62 (F. acoplador de 1/16 &quot;) 06363-60 (M. acoplador 1/8 &quot;) 06363-61 (F. acoplador 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Flujo de tubo </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 de salida) PMR1-013520 (1 salida) </td></tr><tr><td> Misa controlador de flujo </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Misa Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Tanque de gas comprimido </td><td> Airgas </td><td> Hecho por encargo &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Luer macho de plástico a los accesorios para manguera </td><td> Cole Parmer </td><td> 45.505-41 (serie 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Reparto de cajas de acrílico </td><td> Ellard Instrumentación </td><td> Hecho por encargo </td></tr><tr><td> Accesorios de tubería (de latón o acero inoxidable) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;tuerca) B-200-3 (1/8 &quot;camiseta de la Unión) B-400-conjunto (1/4 &quot;casquillos) B-QM2-B1-200 (control de calidad QM Cuerpo) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;macho conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning grasa de vacío </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack cuadro </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 litros) R685025 (2,5 litros) R685070 (7,0 litros) </td></tr><tr><td> Pyrex de gas botella de lavado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> El ácido palmítico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> De cabra anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano </td><td> Southern Biotechnology Asociados </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemiluminsecent sustrato </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 platos de cristal de la cristalización </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creación de ambientes definidos de gases para el estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; c. elegans</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

El oxígeno es esencial para todos los metazoos para sobrevivir, con una sola excepción conocida 1. Disminución de la disponibilidad de O 2 (hipoxia) pueden surgir durante los estados de la enfermedad, el desarrollo normal o cambios en las condiciones ambientales 2-5. La comprensión de las vías de señalización celular que están implicadas en la respuesta a la hipoxia podría proporcionar una nueva visión de las estrategias de tratamiento para diversas patologías humanas, los accidentes cerebrovasculares hasta el cáncer. Este objetivo se ha visto obstaculizada, al menos en parte, por las dificultades técnicas asociadas a la exposición controlada de hipoxia en los organismos genéticamente susceptibles modelo. Los nematodo Caenorhabditis elegans es ideal como un organismo modelo para el estudio de respuesta hipóxica, ya que es fácil de manipular genéticamente y la cultura. Además, es posible estudiar la respuesta celular a hipoxia específicas de O 2 concentraciones sin efectos de confusión desde C. elegans obtención de O 2 (y otros gases) por difusión, en oposición a un sistema respiratorio facilitado 6. Factores que se sabe están implicados en la respuesta a la hipoxia se conservan en C. elegans. La respuesta real a la hipoxia depende de la concentración específica de O 2 que está disponible. En C. elegans, la exposición a la hipoxia moderada provoca una respuesta transcripcional mediada en gran parte por HIF-1, los altamente conservadas por la hipoxia-inducible factor de transcripción 6-9. C. elegans embriones requieren HIF-1 para sobrevivir en 5,000-20,000 ppm de O 2 7,10 . La hipoxia es un término general para &quot;menos de lo normal de O 2&quot;. Normoxia (normal O 2) también puede ser difícil de definir. En general, consideramos aire de la habitación, que es 210.000 ppm de O 2 para ser normoxia. Sin embargo, se ha demostrado que C. elegans tiene una preferencia conductual para el O 2 concentraciones de 5.12% (50.000-120.000 ppm O 2) 11. En larvae y adultos, HIF-1 actúa para prevenir la hipoxia inducida por la diapausa en 5000 ppm de O 2 12. Sin embargo, HIF-1 no juega un papel en la respuesta a bajas concentraciones de O 2 (anoxia, la definición operativa &lt;10 ppm de O 2) 13. En la anoxia, C. elegans entra en un estado de animación suspendida reversible en el que toda la actividad observable al microscopio deja 10. El hecho de que diferentes respuestas fisiológicas se producen en diferentes condiciones destaca la importancia de tener control experimental sobre la concentración de O 2 hipóxico. A continuación, presentamos un método para la construcción e implementación de cámaras ambientales que producen condiciones de hipoxia confiables y reproducibles, con concentraciones definidas de O 2. El método de flujo continuo asegura un rápido equilibrio de la cámara y aumenta la estabilidad del sistema. Además, la transparencia yaccesibilidad de las cámaras permiten la visualización directa de los animales estén expuestos a la hipoxia. Además, demuestran un método eficaz de recolección C. elegans muestras rápidamente después de la exposición a la hipoxia, que es necesario observar muchos de los cambios rápidamente-invertidos que se producen en la hipoxia 10,14. Este método proporciona un fundamento básico que puede ser fácilmente modificado para las necesidades de cada laboratorio, incluidos los sistemas de modelos diferentes y una variedad de gases.

Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O<sub&gt; 2</sub&gt; Entender las respuestas biológicas a la disminución de O<sub&gt; 2</sub&gt;. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O<sub&gt; 2</sub&gt; Concentraciones y sistemas modelo

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; C. elegans</em

El oxígeno es esencial para la supervivencia de todos los metazoos, con una excepción conocida1. La disminución de la disponibilidad de O2 (hipoxia) puede producirse durante estados patológicos, ...

El objetivo del siguiente experimento es configurar y mantener una cámara de hipoxia utilizando un método de flujo continuo. Esto se logra obteniendo y fabricando los tubos, matraces y cámaras necesarios para el procedimiento. Como segundo paso, conecte el tanque de oxígeno y seleccione el caudal para crear el nivel deseado de hipoxia.Hidrate el gas haciendo pasar el flujo a través de un frasco de burbujas lleno con agua desionizada. Conecte el gas hidratado a la cámara de hipoxia y coloque las muestras de prueba dentro de la cámara para exponerlas a condiciones hipóxicas. Se obtienen resultados que muestran letalidad embrionaria dependiente de Hi F1 en hipoxia, basados en la observación de la viabilidad hasta la edad adulta.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las cajas de guantes, es que es fácil y económica de fabricar en el laboratorio y proporciona una concentración precisa y reproducible de gases en la cámara ambiental. Aunque este método ofrece información sobre la respuesta hipóxica en el nematodo C. elegans, también puede adaptarse a otros sistemas, incluyendo organismos modelo más grandes y cultivos celulares. Además, puede utilizarse para estudiar otros gases, como el dióxido de carbono y el sulfuro de hidrógeno.Este protocolo demuestra cómo construir una cámara de hipoxia. El gas se almacena en tanques de gas comprimido con concentraciones de oxígeno definidas, y se conecta un regulador de dos etapas. El gas entra por la parte inferior del tubo de flujo y sale por la parte superior a la velocidad de flujo correcta.Luego, el gas fluye hacia el frasco de burbujas, humedeciéndose. El gas hidratado pasa entonces a la cámara de hipoxia a través de la válvula de entrada, exponiendo las muestras a condiciones de hipoxia. Finalmente, el gas se libera al ambiente a través de un orificio de escape perforado en la cámara.Puede utilizarse un recipiente de cristalización de Pyrex o una caja de flechas como cuerpo de la cámara ambiental. El volumen del recipiente debe mantenerse al mínimo y el material debe ser impermeable al gas. Taladre un orificio en un lado del recipiente con una broca de punta de carbono o diamante y coloque una conexión de barba de plástico.Mezcle el epoxi antes de aplicarlo a la caja y al accesorio. Luego repita el mismo procedimiento en el lado opuesto del recipiente con el segundo orificio desplazado respecto al primero. Para aumentar la mezcla turbulenta, utilice un tubo de un octavo de pulgada de diámetro exterior, de FEP o nylon, para conectar los tanques de gas comprimido a un dispositivo de control de flujo, como un controlador de flujo másico o un medidor de rotor.Los tanques de gas deben tener concentraciones de oxígeno definidas, equilibradas con nitrógeno, que cumplan con un estándar certificado para el contenido de oxígeno o para condiciones anóxicas. Para el uso de nitrógeno puro, emplee un regulador de dos etapas con la segunda etapa ajustada a la presión deseada. Consulte las instrucciones en el protocolo escrito para seleccionar un caudal adecuado.Luego conecte el tubo desde el regulador de dos etapas al tubo de flujo que controla la velocidad de flujo del gas que entra en la cámara. Las salidas del tubo de flujo están conectadas a una botella de lavado de gases con cilindro fritado que contiene agua destilada. Luego conecte el tubo en el otro lado de la botella de lavado a uno de los accesorios de la cámara ambiental.Esto hidratará el gas que entra en la cámara ambiental. Utilice grasa al vacío para sellar la cámara. Luego, coloque pesos sobre la tapa de la cámara para garantizar un sello hermético al aire.Compruebe el sellado sosteniendo una pequeña cantidad de agua en la palma de una mano con guante frente al accesorio de escape de gas en la cámara y verifique la presencia de burbujas. Primero, genere poblaciones sincronizadas de Elgan marino. Coloque de uno a cien adultos GR en una gota de solución de lejía alcalina sobre la superficie de una placa de medio de crecimiento para nematodos sin siembra.Deje que la solución de lejía se absorba en la placa tras un período de incubación de al menos ocho horas. Transfiera las larvas L1 sincronizadas a una placa sembrada con bacterias OP50 vivas. Alternativamente, permita que los adultos GRA depositen huevos en la placa durante dos o tres horas para generar un grupo de gusanos que se desarrollarán de forma sincrónica, o seleccione larvas L4 de una población mixta para recoger embriones jóvenes.En el estadio de dos a cuatro células, utilice una cuchilla de afeitar para cortar los adultos de GR en un pequeño volumen de agua y luego transfiera los embriones mediante pipeta de boca antes de trasladar los gusanos a la placa para su exposición a condiciones hipóxicas. Coloque un anillo de ácido palmítico al 10 miligramos por mililitro en etanol alrededor del borde de las placas. Para evitar que los gusanos escapen de la superficie del medio de agar.El ácido palmítico saldrá de la solución. A medida que el etanol se evapora, formando una barrera física para asegurar la uniformidad, asegúrese de reemplazar el agua en el frasco lavador de gases antes de la exposición en la cámara ambiental. Después de transferir los gusanos a las placas, selle las placas en la cámara ambiental, inicie el flujo de gas y mantenga la exposición durante el tiempo deseado para el ensayo.Para evaluar la viabilidad de los embriones hasta la edad adulta, permita que los gusanos se desarrollen durante 48 horas después del regreso al aire ambiente, momento en el cual deberían encontrarse en estadio larval cuarto o como adultos de un día. Registre la viabilidad hasta la edad adulta en estos estadios. Para visualizar los gusanos tras la exposición hipóxica, transfiera los gusanos a una gota de medio M nueve sobre un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros e inviértalo sobre una almohadilla de agar al 2 % en medio M nueve, si es necesario.Se pueden utilizar 25 milimolar de amol o 10 milimolar de azida de sodio como anestésico. Alternativamente, tras la exposición a hipoxia, la cámara ambiental transparente puede colocarse directamente sobre la platina de un microscopio estereoscópico. Se muestran dos vistas, una de ellas incluyendo todo el sistema de flujo de gas.Otro con solo la cámara sobre la platina del microscopio. Cultive gusanos Bristol N2 en cuatro placas de crecimiento de 10 centímetros de diámetro hasta que la mayoría de los gusanos sean adultos GR. Lave los gusanos hacia un tubo cónico de 15 mililitros con una solución de hipoclorito alcalino en una proporción de 1 a 5 e incube con rotación hasta que los gusanos comiencen a disolverse.No más de cinco minutos. Lave los gusanos tres veces con M nueve, centrifugando a 1.500 ×g entre cada lavado, sin romper la placa. Coloque los embriones blanqueados en 8 placas NGM de 150 milímetros y permita que los embriones se desarrollen hasta larvas L4 durante aproximadamente 48 horas.A 22 grados Celsius, traslade las placas a la cámara ambiental y expóngalas a condiciones hipóxicas y anóxicas durante cuatro horas o durante el tiempo especificado por el diseño experimental. Para recolectar las muestras, retire rápidamente la tapa de la cámara hipóxica. Tome una placa de muestra, vuelva a sellar la cámara, anote el tiempo y registre los pasos.Después de retirar los gusanos de la hipoxia, todo este proceso debe tardar menos de dos minutos. Utilice agua destilada para lavar los gusanos hacia un filtro de nailon y luego viértalos en un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado que contenga 100 microlitros de SDS al 1 % y centrifugue. Los gusanos en SDS se centrifugan en una centrífuga de escritorio a 1 500 veces G durante 15 a 20 segundos.Con una pausa, utilice un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el botón de gusanos. Mediante una pipeta, transfiera el botón de gusanos con un volumen predeterminado de líquido a un tubo microfuga de 1,5 mL etiquetado. Si la muestra va a utilizarse para electroforesis SDS-PAGE, este tubo puede contener un volumen igual de tampón de carga proteica al doble de concentración; cierre el tubo y sumérjalo en nitrógeno líquido.Repita hasta que todas las muestras hayan sido aisladas. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire ambiente; para mantener la consistencia, las muestras pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius. Esta figura muestra la viabilidad de embriones expuestos a 1000 partes por millón de oxígeno, 5.000 partes por millón de oxígeno y normoxia, alrededor de 210.000 partes por millón de oxígeno.Los embriones se exponen a cada condición durante 24 horas en cámaras de flujo continuo con oxígeno. Los gusanos se trasladaron a condiciones normóxicas y se dejaron desarrollar hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego se evaluó su viabilidad hasta la edad adulta. Tras seguir este procedimiento, se pueden recolectar muestras para su análisis posterior mediante inmunotransferencia, QPCR o ensayos fisiológicos como la duración de la vida o la producción de descendencia.Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar una cámara de hipoxia de flujo continuo en su propio laboratorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Este video muestra un método para probar la hipoxia en larvas de Drosophila evaluando sus habilidades de excavación y tunelización. Con esta técnica, los investigadores pueden distinguir las larvas que experimentan privación de oxígeno de las que tienen déficits de desarrollo. El protocolo de ejemplo muestra la configuración de este ensayo.

Drosophila Ensayo de excavación y tunelización: un método para evaluar la hipoxia tisular en larvas de mosca

Un protocolo se describe que utiliza la anoxia / inanición en C. elegans para modelar la isquemia / reperfusión. Los resultados funcionales incluyen aumento de la mortalidad, anormalidades visibles en los procesos neuronales GFP-etiquetados, y las respuestas conductuales alterados que requieren la función neuronal.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

El cultivo Caenorhabditis elegans En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

El protocolo describe un análisis simple para identificar larvas de Drosophila melanogaster que experimentan hipoxia bajo niveles normales de oxígeno atmosférico. Este protocolo permite larvas hipóxicas debe distinguirse de otros mutantes que muestran fenotipos superpuestos como lentitud o crecimiento lento.

Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Los efectos trans y multigeneracionales de los productos químicos persistentes son esenciales para juzgar sus consecuencias a largo plazo en el medio ambiente y en la salud humana. Proporcionamos métodos detallados novedosos para estudiar los efectos trans y multigeneracionales utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans.

Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Aprende a crear ambientes de hipoxia controlados mediante flujo continuo para estudiar efectos del oxígeno bajo en C. elegans. Este método permite investigar letalidad embrionaria dependiente de HIF-1 y viabilidad.

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el

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