Name: 依赖的PDZ-CFTR的大分子信号复合物的体外分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习在体外组装PDZ依赖的CFTR大分子信号复合物的方法。该技术通过表达纯化重组标签融合蛋白，结合细胞裂解液与Western印迹分析，实现CFTR蛋白复合物的直接检测与可视化，为研究囊性纤维化跨膜传导调节因子相关细胞信号提供可靠手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作得到了美国心脏协会（大东南分会）初期研究资助0765185B、Elsa U. Pardee基金会研究资助以及韦恩州立大学校内启动基金和心血管研究所Isis计划奖项的支持。体外 CFTR大分子复合物组装方法最初由A.P. Naren博士（田纳西大学健康科学中心）首创。

1. 在细菌中表达和纯化重组标签融合蛋白
<ol>
	<li>通过PCR方法扩增CFTR、LPA2、MRP2、MRP4、β2AR和NHERFs（全长或PDZ1或PDZ2结构域）C端尾部（C末端含有PDZ基序的最后50-100个氨基酸）的特定区域。</li>
	<li>将PCR产物克隆至pGEX4T-1载体以表达GST融合蛋白（如GST-NHERFs、GST-MRP4 CT），克隆至pMAL-C2载体以表达MBP融合蛋白（如MBP-β2AR CT、MBP-CFTR CT），以及克隆至pET30载体以表达His-S融合蛋白（如His-S-CFTR CT、His-S-PDZK1）。</li>
	<li>将重组质粒转化至蛋白酶缺陷型E. coli菌株（BL21-DE3）中，以最大程度减少重组蛋白的降解。</li>
	<li>在含有适当抗生素（如氨苄青霉素或卡那霉素）的LB培养基（pH 7.0）中，于37 °C过夜培养。将过夜培养物按1:10稀释后，继续在37 °C培养2小时，随后加入0.5–1 mM IPTG，在30 °C诱导表达4小时。于4 °C下以8,000 × g离心10分钟收集菌体。</li>
	<li>使用含溶菌酶（1 mg/ml）、0.2% Triton X-100及蛋白酶抑制剂的蔗糖缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，1 mM PMSF，10%蔗糖）裂解细胞。每升培养物所得菌体使用20 ml裂解缓冲液。</li>
	<li>在4 °C下于旋转摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，收集澄清的上清液。</li>
	<li>向澄清上清液中加入1 ml以下树脂/琼脂糖珠（50%悬浮液，以蔗糖缓冲液配制）：
	<ul>
		<li>用于GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠。</li>
		<li>用于His-S融合蛋白的Talon珠。</li>
		<li>用于MBP融合蛋白的直链淀粉树脂。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>在4 °C下于旋转摇床上孵育4小时。</li>
	<li>用1× PBS（15 ml）重悬珠子，混匀2分钟，以800 × g离心2分钟，弃去上清液。重复此洗涤步骤共6次。</li>
	<li>使用相应的洗脱缓冲液（每1 ml珠子使用2 ml洗脱缓冲液）从珠子上洗脱蛋白：
	<ul>
		<li>GST融合蛋白洗脱缓冲液：25 mM Tris-HCl（pH 8.0），140 mM NaCl，20 mM还原型谷胱甘肽。</li>
		<li>His融合蛋白洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），500 mM NaCl，200 mM咪唑。</li>
		<li>MBP融合蛋白洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），200 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将洗脱后的蛋白在4 °C下对2 L的1× PBS进行透析（以避免蛋白降解），每4小时更换一次PBS，共更换4次。使用Centricon滤膜（分子量截留值10,000，Millipore）浓缩蛋白，并分装后于-80 °C保存。</li>
	<li>采用Bradford法测定蛋白浓度，以BSA为标准品通过SDS-PAGE评估蛋白质量。若蛋白完整性不理想，可采用凝胶过滤或离子交换等二次纯化步骤（e.g.，我们曾使用G-75 Sepharose柱进一步纯化GST融合蛋白）。</li>
</ol>
2. 细胞培养与细胞裂解液制备
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Eagle最小必需培养基（MEM）中，于37 °C、5% CO2条件下，在聚苯乙烯培养瓶中培养稳定过表达CFTR-wt和CFTR-his10的幼年仓鼠肾（BHK）细胞，或瞬时过表达Flag-LPA2-wt或Flag-LPA2-ΔSTL的BHK细胞，以及稳定过表达MRP2的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。</li>
	<li>在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下，在聚苯乙烯培养瓶中培养稳定过表达CFTR-wt和CFTR-his10的人胚胎肾293（HEK293）细胞。</li>
	<li>用裂解缓冲液（PBS - 0.2% Triton-X-100，加入蛋白酶抑制剂混合物，含1 mM苯甲基磺酰氟、1 μg/ml抑肽酶、1 μg/ml亮抑蛋白酶肽、1 μg/ml胃蛋白酶抑制剂）裂解细胞；每60 mm培养皿使用500 μl裂解缓冲液，每100 mm培养皿使用1000 μl裂解缓冲液。</li>
	<li>在4 °C下振荡裂解液20分钟，然后在4 °C下以16,000 × g离心15分钟去除不溶性物质。采用Bradford法测定蛋白浓度。</li>
</ol>
3. 体外 CFTR复合物（CFTR-PDZK1-MRP4）的组装
<ol>
	<li>到……中 200 μl 裂解缓冲液（PBS - 0.2% Triton-X 100 + 蛋白酶抑制剂），加入 20 μg 纯化的GST-MRP4-C端50个氨基酸（CT50）融合蛋白。</li>
	<li>添加不同量（0-40 μg纯化后的His-S-PDZK1融合蛋白的量。</li>
	<li>将两种蛋白质在旋转混匀仪上混合 22 °C 1-2 小时。</li>
	<li>添加 20 μl 将谷胱甘肽琼脂糖珠（50% 悬液）加入蛋白质混合物中，继续孵育1小时。此步骤也称为成对结合。</li>
	<li>在此期间，按照上述第2步所述方法制备过表达Flag-CFTR（wt）的HEK293细胞裂解液。</li>
	<li>用裂解缓冲液将复合物洗涤两次，800 × g 每次洗涤1分钟，每次洗涤后小心吸除上清液。注意不要吸走底部的珠子。</li>
	<li>将上述制备的 HEK293 细胞裂解液加入珠子中，轻轻混匀于 4 °C 3 小时（或过夜）。</li>
	<li>按照步骤3.6所述，用裂解缓冲液将珠子充分洗涤3次。</li>
	<li>使用洗脱液洗脱蛋白质 30 μl 上样缓冲液（5×）：0.6 M Tris-HCl（pH 6.8）、50% 甘油、2% SDS 和 0.1% 溴酚蓝；含 5% β-巯基乙醇。</li>
	<li>孵育于 37 °C 水浴 10-15 分钟，然后在 5,000 × g 30 秒以沉淀珠子。</li>
	<li>将所有洗脱液上样至4-15%凝胶。</li>
	<li>运行 SDS-PAGE 约 30–40 分钟。</li>
	<li>将蛋白质条带转移至PVDF膜上，持续1.5小时。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的TBS-Tween缓冲液封闭膜。</li>
	<li>将膜与一抗（如抗CFTR IgG，R1104）孵育 4 °C，过夜。</li>
	<li>用 TBS-Tween 洗涤膜，每次 5 分钟，共洗 6 次。</li>
	<li>用二抗（如辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体）孵育膜nd 抗体）孵育 45 分钟 22 °C.</li>
	<li>用 TBS-Tween 洗涤膜，每次 5 分钟，共洗 6 次。</li>
	<li>通过ECL显色法观察蛋白条带。</li>
	<li>代表性数据如图所示 图1.</li>
</ol>
4. 代表性结果
一个由CFTR组成的大型信号复合物的组装实例 体外 如图所示 图1MRP4 C端50个氨基酸（MRP4-CT50）、PDZK1和全长CFTR之间形成了一个大分子复合物图1, 底部）。复合物的形成随着中介蛋白PDZK1量的增加而呈剂量依赖性增强图1, 底部)18.
<img alt="Flag-CFTR interaction; diagram and blot analysis; macromolecular complex; His-PDZK1 gradient." src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 大分子复合物检测实验的图示说明（顶部检测到一种大分子复合物 体外 与三种蛋白质（GST-MRP4-CT50、His-S-PDZK1 和 Flag-CFTRwt）以剂量依赖的方式结合（底部)18.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>CFTR-NHERF1-β2AR（参考文献14）</td>
			<td>CFTR-NHERF2-LPA2（参考文献15）</td>
			<td>CFTR-PDZ蛋白-MRP2（参考文献17）</td>
			<td>CFTR-PDZK1-MRP4（参考文献16）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亲和 beads</td>
			<td>淀粉树脂</td>
			<td>S-蛋白琼脂糖</td>
			<td>淀粉树脂</td>
			<td>谷胱甘肽琼脂糖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化蛋白-1</td>
			<td>MBP-β2AR CT</td>
			<td>His-S-CFTR CT</td>
			<td>MBP-CFTR CT</td>
			<td>GST-MRP4 CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化蛋白-2</td>
			<td>GST-NHERF1</td>
			<td>GST-NHERF2</td>
			<td>GST-PDZ蛋白</td>
			<td>His-S-PDZK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化蛋白-3（或细胞裂解液）</td>
			<td>CFTR-wt 或 CFTR-his10（BHK 或 HEK 细胞裂解液）</td>
			<td>Flag-LPA2-wt 或 Flag-LPA2-ΔSTL（BHK 细胞裂解液）</td>
			<td>MRP2（MDCK 细胞裂解液）</td>
			<td>纯化的 Flag-CFTR-wt 或 CFTR-his10（或细胞裂解液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>抗CFTR IgG</td>
			<td>抗Flag HRP</td>
			<td>抗MRP2 IgG</td>
			<td>抗Flag HRP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 含CFTR的各种大分子复合物组装概述 体外.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li>
<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
<li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments%3A+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li>
<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
<li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+a+renal+K%2B+channel+%28ROMK2%29+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li>
<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
<li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li>
<li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction%2C+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
<li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C%2C+the+heat-stable+enterotoxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li>
<li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本方案中，我们展示了一种方法 体外 使用纯化的蛋白质（或蛋白质片段）和/或细胞裂解液组装并检测含有CFTR的大型信号复合物，方法如先前报道所述16-19,29,30为获得最佳结果，在制备过程中需特别关注以下关键环节：
<ul>
	<li>在按照步骤1)纯化GST融合蛋白时，加入还原型谷胱甘肽后，必须将洗脱缓冲液的pH值调节至8.0。加入还原型谷胱甘肽后，pH值可能低至3.0。如果在洗脱前未调节pH值，洗脱效率将显著降低。</li>
	<li>当蛋白质从珠粒中洗脱后，应立即进行透析；否则，纯化的蛋白质可能从溶液中析出。如果无法在洗脱后立即进行蛋白质透析，则不应进行洗脱，而应将蛋白质保留在琼脂糖/珠粒上。</li>
	<li>强烈建议不要将用于Western blotting的含CFTR的大分子复合物样品煮沸，因为CFTR聚集是一个常见问题。相反，样品应在上样前于37 °C加热10–15分钟。</li>
	<li>对于具有低亲和力相互作用的蛋白质复合物，可使用SuperSignal West Femto（或Pico）Maximum Sensitivity Substrate（Pierce）进...

<table><tbody><tr><td>pGEX4T-1 载体</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9545-49</td><td>曾用名 Amersham Biosciences</td></tr><tr><td>pMAL-C2 载体</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET30 载体</td><td>EMD Chemicals</td><td>69077-3</td><td>曾用名 Novagen</td></tr><tr><td>谷胱甘肽琼脂糖珠</td><td>BD 生物科学</td><td>554780</td><td></td></tr><tr><td>直链淀粉树脂</td><td>New England BioLabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Talon 珠</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>还原型谷胱甘肽</td><td>BD 生物科学</td><td>554782</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Fisher</td><td>BP305-50</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Fisher</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>S蛋白琼脂糖</td><td>EMD Chemicals</td><td>69704-3</td><td>曾用名 Novagen</td></tr><tr><td>抗Flag HRP</td><td>Sigma</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>抗CFTR IgG</td><td>定制</td><td>R1104</td><td>识别CFTR第722-734位氨基酸表位的单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗MRP2 IgG</td><td>Chemicon International</td><td>MAB4148</td><td>现为默克旗下 Millipore 的一部分</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表2. &lt;/strong&gt; 特定试剂与设备&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

体外 pdz依赖性cftr大分子信号复合物的分析

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种主要位于上皮细胞顶膜的氯离子通道，在跨上皮液体稳态中发挥关键作用1-3CFTR 与两种主要疾病相关：囊性纤维化（CF）4 分泌性腹泻5在囊性纤维化（CF）中，CFTR Cl- 通道的合成或功能活性降低。该疾病在美国约每2,500名高加索人中影响1人。6CFTR 活性过高也与毒素诱导的分泌性腹泻病例相关。例如，由霍乱毒素和耐热肠毒素 E. coli 肠毒素，可刺激肠道内cAMP或cGMP的产生7.
越来越多的证据表明，囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）与多种其他蛋白质之间存在物理和功能上的相互作用，这些蛋白质包括转运蛋白、离子通道、受体、激酶、磷酸酶、信号分子以及细胞骨架成分。CFTR与其结合蛋白之间的这些相互作用已被证明在体外和体内均对CFTR介导的跨上皮离子转运起关键调控作用in vitro和in vivo8-19。本实验方案仅聚焦于研究CFTR羧基末端尾部（含有一个蛋白质结合基序，即PSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）基序）与一组含有特定结合模块（称为PDZ结构域）的支架蛋白之间相互作用的方法。迄今为止，已有多种不同的PDZ支架蛋白被报道可与CFTR的羧基末端尾部以不同亲和力结合，例如NHERF1、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR相关配体）、Shank2和GRASP20-27。CFTR中被PDZ支架蛋白识别的PDZ基序位于其C末端最后四个氨基酸（即，人CFTR中的1477-DTRL-1480）20。有趣的是，CFTR能够以不同的亲和力同时结合NHERF和PDZK1的多个PDZ结构域22。这种CFTR结合的多价性已被证明具有重要的功能意义，提示PDZ支架蛋白可能有助于在细胞内形成CFTR大分子信号复合物，从而实现特异性/选择性且高效的信号传导16-18。
已开发多种生物化学检测方法用于研究与CFTR相关的蛋白质相互作用，例如免疫共沉淀、拉下实验、成对结合实验、比色成对结合实验以及大分子复合物组装实验16-19,28,29本文重点介绍组装依赖于PDZ基序的包含CFTR的大型分子复合物的详细步骤 体外，该方法被我们实验室广泛用于研究涉及CFTR的蛋白质-蛋白质或结构域-结构域相互作用16-19,28,29.

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种上皮氯离子通道，已被报道可与多种蛋白质相互作用并调控重要的细胞过程；其中，CFTR通过其PDZ基序介导的相互作用已有充分研究。本实验方案描述了我们建立的用于组装PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的方法 体外.

体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种主要位于上皮细胞顶膜的氯离子通道，发挥着……

本实验的总体目标是体外组装一个由PDZ结构域依赖的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）大分子信号复合物。为实现这一目标，首先在细菌中表达带有标签的重组融合蛋白并进行纯化。随后，从表达CFTR或CFTR结合蛋白的细胞培养物中获取细胞裂解液。然后在体外将CFTR及其结合蛋白混合，以组装包含CFTR的大型信号复合物。随后进行蛋白质印迹分析，以证实CFTR大分子复合物的形成，并通过蛋白质印迹进一步评估。该技术相较于现有方法的主要优势在于，我们能够直接检测并观察含有CFTR的高蛋白大分子复合物个体的形成。因此，该方法可为含CT R的大型分子复合物的形成提供深入见解。它还可应用于组装不涉及CFTR的非蛋白质复合物，例如性腺C2大型分子信号复合物。最近，利用这一相同方法，我们已证明趋化因子受体CXCR2与下游效应蛋白在物理上形成了蛋白质复合物。PRC β3 在中性粒细胞中介导野生型神经元1。使用PCR扩增编码C末端最后50至100个氨基酸的DNA片段，该片段包含PDZ模体。针对环磷酸腺苷（CAMP）转运蛋白MRP4以及钠氢交换调节因子（N-H-E-R-F）的PDZ1结构域。接下来，将RP四对PCR扩增产物克隆至PGE X四T一载体中以表达GST融合蛋白，并将N-H-E-R-F的PDZ一结构域克隆至PET 30载体中以表达Hiss融合蛋白。通过热激法转化细菌，在含有适当抗生素的50毫升LB培养基中，于37摄氏度摇床培养箱中过夜培养，所用菌株为蛋白酶缺陷型大肠杆菌（E. coli），并在SOC培养基中进行复苏。次日将培养物按1:10稀释至500毫升LB（Luria-Bertani）培养基中，然后在37摄氏度下振荡培养2小时。随后在30摄氏度下加入0.5至1毫摩尔IPTG诱导重组蛋白转录4小时。孵育结束后，将培养物转移至250毫升离心管中，在4°C条件下以8,000 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。离心后弃去上清液，加入含有溶菌酶的蔗糖缓冲液20毫升，其中包含终浓度为1毫克/毫升的溶菌酶、0.2% Triton X-100以及蛋白酶抑制剂，以裂解细胞。随后将细菌悬液转移至一支洁净的50毫升离心管中。在4°C条件下，于旋转摇床上混合30分钟。然后在4°C条件下，以20,000 ×g离心30分钟。离心后，上清液将变得澄清，管底会出现不溶性app沉淀。将澄清的上清液收集到一个新的50毫升锥形管中。然后向上清液中加入1毫升适当的树脂。该树脂为悬浮于蔗糖缓冲液-谷胱甘肽中的50%悬液微珠。对于GST融合蛋白应使用Aero beads，对于hiss S融合蛋白应使用Talon beads。在4°C下于旋转摇床上混合4小时。然后在800 × g下离心 beads 2分钟。然后通过重悬进行洗涤，将它们悬浮于15毫升PBS中，并在旋转仪上混合2分钟。最后弃去上清液。第六次洗涤后重复此步骤六次。为将蛋白质从珠粒中洗脱，每1毫升珠粒加入2毫升相应的洗脱缓冲液，室温下混匀10分钟。将含有珠粒的全部洗脱蛋白溶液倒入层析柱中，收集流出液作为洗脱的蛋白质。随后，将洗脱的蛋白质转移至透析袋中。将洗脱的蛋白质在4°C下搅拌，对两升磷酸盐缓冲液（PBS）进行透析。透析后每4小时更换一次PBS，共更换四次。将蛋白质浓缩至0.5到1毫升。使用10,000兆瓦截留分子量的超滤离心管。将样品分装，每份200微升。留一份用于分析，其余置于-80摄氏度保存。采用 Bradford 法测定蛋白质浓度。使用 BSA 标准品通过 SDS-PAGE 评估蛋白质质量。如果蛋白质的完整性不理想，可采用凝胶过滤或离子交换等二次纯化步骤。应按照随附文件所述培养表达野生型 Flag-CFTR 的 HEK 293 细胞。移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤。随后，为裂解细胞，每 60 毫米培养皿加入 500 微升裂解缓冲液，在 4 摄氏度下轻轻摇动细胞裂解物 20 分钟。将裂解液转移至新的微量离心管中，随后在4摄氏度下以16,000 × g离心15分钟以去除不溶性蛋白，收集上清液。通过Bradford法测定蛋白浓度，用于体外组装含CFTR的大型复合物。首先，在1.5毫升微量离心管中，将20微克纯化的GST-MRP4 C端50个氨基酸融合蛋白与0至40微克不同量的纯化His-SpdZK1融合蛋白加入200微升裂解缓冲液中混合。在22摄氏度下，于旋转混合仪上孵育1至2小时，使两种蛋白充分混合。随后，向蛋白混合物中加入20微升50%的谷胱甘肽琼脂糖珠悬液，继续混合孵育1小时。此步骤也称为成对结合，即 G-S-T-M-R-P 四种 CT 50 与 SPD zk1 结合。在此期间，按照视频前一节所述方法，制备过表达野生型 Flag 标记 CFTR 的 HEK 293 细胞裂解液，用于后续成对结合步骤。用裂解缓冲液洗涤复合物两次，每次以 800 × g 离心一分钟，每次洗涤后小心吸除上清液。注意不要从底部吸出珠子。将HT K 2 93细胞裂解液加入珠子中，4°C下在旋转混合仪上轻轻混匀，孵育3小时或过夜。孵育结束后，用裂解缓冲液洗涤珠子3次，每次洗涤后均同前进行离心，最后一次洗涤后也需离心。为洗脱蛋白质，加入30微升5×上样缓冲液，在37摄氏度水浴中孵育10至15分钟。然后以5,000 × g离心1分钟以沉淀磁珠。接下来，将全部洗脱液上样至4–15% SDS-PAGE凝胶，在200伏电压下电泳至凝胶底部。电泳结束后，使用BioRad转膜装置在60伏电压下将蛋白质条带转至PVDF膜上，转膜时间为1.5小时。转移完成后，在含5%脱脂牛奶的TBS Tween中封闭膜1小时。按照随附文件中所述方法进行Western印迹，以检测CFTR相互作用蛋白。如本图示所示，含A-C-F-T-R的巨分子信号复合物按照本视频所述方法在体外组装。通过Mr.RRP四的C端50个氨基酸与全长CFTR形成的复合物，以确定该大分子复合物形成的剂量依赖性。如图所示，加入不同递增量的中介蛋白PDZK1。复合物的形成呈剂量依赖性增加，表明中介蛋白PDZK1介导了CFTR与Mr.Rrp四之间的相互作用。在进行该实验操作时，需要注意切勿将为蛋白质印迹分析所制备的CFTR-微分子复合物样本煮沸，因为CFTR发生聚集是一个常见问题。相反，应将样本在37°C下加热10至15分钟，然后上样至凝胶中。此外，也可采用其他方法如免疫共沉淀，用于检测细胞内源性CFTR复合物，例如气道上皮细胞和肠道上皮细胞中的CFTR复合物。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外组装依赖 PTC 的 CFDR 大分子信号复合物。

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

依赖的PDZ-CFTR的大分子信号复合物的体外分析

为了检测蛋白质与其靶向脂质的相互作用，我们使用了MACS技术以及与磁珠偶联的Annexin V，并采用靶向脂质和Annexin...

磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

本文描述了一种评估单次跨膜结构域（TMD）寡聚化倾向的高效方法。将TMD与ToxR融合形成的嵌合蛋白在大肠杆菌报告菌株中表达。TMD诱导的寡聚化可导致ToxR二聚化，从而激活转录并产生报告蛋白β-半乳糖苷酶。...

跨膜结构域寡聚化倾向由ToxR检测法确定

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。...

双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的异源表达与纯化是囊性纤维化药物研发中的重大挑战和限制因素。本方案描述了两种可用于功能与结构研究的、适用于毫克级产量的CFTR分离方法。...

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。...

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

我们提供一种实验方案 体外 在开放腔室中进行支撑脂双层上 MinD 和 MinE 的自组织实验。此外，我们还描述了如何将实验体系封闭于脂质包被的 PDMS 微区室中以模拟 体内...

体外 支持性脂双层上自组织蛋白模式的重建

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本文介绍了一种通用的脉冲-追踪方法的实验方案，可用于在活细胞中动态分析蛋白质的折叠、转运和降解过程。...

活细胞中蛋白质折叠、转运与降解的放射性脉冲追踪分析

本方案介绍了一种在细胞环境中实时测量腺嘌呤核苷酸与受体结合的方法。该结合过程通过三硝基苯基核苷酸衍生物与标记了非天然荧光氨基酸的蛋白质之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。...

实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

学习在体外组装PDZ依赖的CFTR大分子信号复合物的方法。该技术通过表达纯化重组标签融合蛋白，结合细胞裂解液与Western印迹分析，实现CFTR蛋白复合物的直接检测与可视化，为研究囊性纤维化跨膜传导调节因子相关细胞信号提供可靠手段。

体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

探索更多视频