体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

本实验的总体目标是体外组装一个由PDZ结构域依赖的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）大分子信号复合物。为实现这一目标，首先在细菌中表达带有标签的重组融合蛋白并进行纯化。随后，从表达CFTR或CFTR结合蛋白的细胞培养物中获取细胞裂解液。

然后在体外将CFTR及其结合蛋白混合，以组装包含CFTR的大型信号复合物。随后进行蛋白质印迹分析，以证实CFTR大分子复合物的形成，并通过蛋白质印迹进一步评估。该技术相较于现有方法的主要优势在于，我们能够直接检测并观察含有CFTR的高蛋白大分子复合物个体的形成。

因此，该方法可为含CT R的大型分子复合物的形成提供深入见解。它还可应用于组装不涉及CFTR的非蛋白质复合物，例如性腺C2大型分子信号复合物。最近，利用这一相同方法，我们已证明趋化因子受体CXCR2与下游效应蛋白在物理上形成了蛋白质复合物。

PRC β3 在中性粒细胞中介导野生型神经元1。使用PCR扩增编码C末端最后50至100个氨基酸的DNA片段，该片段包含PDZ模体。针对环磷酸腺苷（CAMP）转运蛋白MRP4以及钠氢交换调节因子（N-H-E-R-F）的PDZ1结构域。

接下来，将RP四对PCR扩增产物克隆至PGE X四T一载体中以表达GST融合蛋白，并将N-H-E-R-F的PDZ一结构域克隆至PET 30载体中以表达Hiss融合蛋白。通过热激法转化细菌，在含有适当抗生素的50毫升LB培养基中，于37摄氏度摇床培养箱中过夜培养，所用菌株为蛋白酶缺陷型大肠杆菌（E. coli），并在SOC培养基中进行复苏。

次日将培养物按1:10稀释至500毫升LB（Luria-Bertani）培养基中，然后在37摄氏度下振荡培养2小时。随后在30摄氏度下加入0.5至1毫摩尔IPTG诱导重组蛋白转录4小时。

孵育结束后，将培养物转移至250毫升离心管中，在4°C条件下以8,000 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。离心后弃去上清液，加入含有溶菌酶的蔗糖缓冲液20毫升，其中包含终浓度为1毫克/毫升的溶菌酶、0.2% Triton X-100以及蛋白酶抑制剂，以裂解细胞。随后将细菌悬液转移至一支洁净的50毫升离心管中。

在4°C条件下，于旋转摇床上混合30分钟。然后在4°C条件下，以20,000 ×g离心30分钟。离心后，上清液将变得澄清，管底会出现不溶性app沉淀。

将澄清的上清液收集到一个新的50毫升锥形管中。然后向上清液中加入1毫升适当的树脂。该树脂为悬浮于蔗糖缓冲液-谷胱甘肽中的50%悬液微珠。

对于GST融合蛋白应使用Aero beads，对于hiss S融合蛋白应使用Talon beads。在4°C下于旋转摇床上混合4小时。然后在800 × g下离心 beads 2分钟。

然后通过重悬进行洗涤，将它们悬浮于15毫升PBS中，并在旋转仪上混合2分钟。最后弃去上清液。第六次洗涤后重复此步骤六次。

为将蛋白质从珠粒中洗脱，每1毫升珠粒加入2毫升相应的洗脱缓冲液，室温下混匀10分钟。将含有珠粒的全部洗脱蛋白溶液倒入层析柱中，收集流出液作为洗脱的蛋白质。随后，将洗脱的蛋白质转移至透析袋中。

将洗脱的蛋白质在4°C下搅拌，对两升磷酸盐缓冲液（PBS）进行透析。透析后每4小时更换一次PBS，共更换四次。将蛋白质浓缩至0.5到1毫升。

使用10,000兆瓦截留分子量的超滤离心管。将样品分装，每份200微升。留一份用于分析，其余置于-80摄氏度保存。

采用 Bradford 法测定蛋白质浓度。使用 BSA 标准品通过 SDS-PAGE 评估蛋白质质量。如果蛋白质的完整性不理想，可采用凝胶过滤或离子交换等二次纯化步骤。

应按照随附文件所述培养表达野生型 Flag-CFTR 的 HEK 293 细胞。移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤。随后，为裂解细胞，每 60 毫米培养皿加入 500 微升裂解缓冲液，在 4 摄氏度下轻轻摇动细胞裂解物 20 分钟。

将裂解液转移至新的微量离心管中，随后在4摄氏度下以16,000 × g离心15分钟以去除不溶性蛋白，收集上清液。通过Bradford法测定蛋白浓度，用于体外组装含CFTR的大型复合物。

首先，在1.5毫升微量离心管中，将20微克纯化的GST-MRP4 C端50个氨基酸融合蛋白与0至40微克不同量的纯化His-SpdZK1融合蛋白加入200微升裂解缓冲液中混合。在22摄氏度下，于旋转混合仪上孵育1至2小时，使两种蛋白充分混合。随后，向蛋白混合物中加入20微升50%的谷胱甘肽琼脂糖珠悬液，继续混合孵育1小时。

此步骤也称为成对结合，即 G-S-T-M-R-P 四种 CT 50 与 SPD zk1 结合。在此期间，按照视频前一节所述方法，制备过表达野生型 Flag 标记 CFTR 的 HEK 293 细胞裂解液，用于后续成对结合步骤。用裂解缓冲液洗涤复合物两次，每次以 800 × g 离心一分钟，每次洗涤后小心吸除上清液。

注意不要从底部吸出珠子。将HT K 2 93细胞裂解液加入珠子中，4°C下在旋转混合仪上轻轻混匀，孵育3小时或过夜。孵育结束后，用裂解缓冲液洗涤珠子3次，每次洗涤后均同前进行离心，最后一次洗涤后也需离心。

为洗脱蛋白质，加入30微升5×上样缓冲液，在37摄氏度水浴中孵育10至15分钟。然后以5,000 × g离心1分钟以沉淀磁珠。接下来，将全部洗脱液上样至4–15% SDS-PAGE凝胶，在200伏电压下电泳至凝胶底部。电泳结束后，使用BioRad转膜装置在60伏电压下将蛋白质条带转至PVDF膜上，转膜时间为1.5小时。

转移完成后，在含5%脱脂牛奶的TBS Tween中封闭膜1小时。按照随附文件中所述方法进行Western印迹，以检测CFTR相互作用蛋白。如本图示所示，含A-C-F-T-R的巨分子信号复合物按照本视频所述方法在体外组装。

通过Mr.RRP四的C端50个氨基酸与全长CFTR形成的复合物，以确定该大分子复合物形成的剂量依赖性。如图所示，加入不同递增量的中介蛋白PDZK1。复合物的形成呈剂量依赖性增加，表明中介蛋白PDZK1介导了CFTR与Mr.Rrp四之间的相互作用。

在进行该实验操作时，需要注意切勿将为蛋白质印迹分析所制备的CFTR-微分子复合物样本煮沸，因为CFTR发生聚集是一个常见问题。相反，应将样本在37°C下加热10至15分钟，然后上样至凝胶中。此外，也可采用其他方法如免疫共沉淀，用于检测细胞内源性CFTR复合物，例如气道上皮细胞和肠道上皮细胞中的CFTR复合物。

观看本视频后，您应能充分理解如何在体外组装依赖 PTC 的 CFDR 大分子信号复合物。