Name: 线虫跟踪和行为测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解如何使用视频速率追踪显微镜系统对秀丽隐杆线虫进行高分辨率行为追踪。本研究开发了LabVIEW和MATLAB软件，通过降维技术将复杂的图像数据简化为基本形状测量，从而定量分析其运动模式并重建行为。

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1. 跟踪显微镜的描述
<ol>
 <li>使用光纤光源照射琼脂平板，并用相机进行成像。该系统安装在X,Y平移台上。</li>
 <li>平移台由标准的步进电机驱动，步进电机连接至步进电机控制器。</li>
 <li>控制器和相机连接到计算机，并由使用LabVIEW编写的自定义程序进行控制。</li>
 <li>相机对琼脂平板表面进行成像，并识别亮背景上的暗色物体。</li>
 <li>调整图像质量，使计算机程序能够实时量化物体。可调节相机的增益、亮度和快门速度，以在白色背景上获得清晰的暗色物体图像。</li>
 <li>通过使用线虫挑取工具戳刺琼脂表面，制作自动校准过程的校准标记。</li>
 <li>可检查跟踪程序所使用的经过滤波处理的二值图像。</li>
 <li>软件具有自动校准功能，通过移动测试物体一段固定距离来计算校准矩阵。</li>
 <li>校准矩阵将像素距离与步进电机的步数进行对应校准。</li>
 <li>校准完成后，系统即可投入使用，除非放大倍数发生改变或相机位置被重新调整，否则无需重新校准。</li>
</ol>
2. 准备追踪培养皿和用于追踪的 C. elegans
<ol>
 <li>使用铜环围住线虫，防止其迁移到培养皿边缘。铜环提供局部化学屏障，在整个实验期间（&lt;1 小时）不会影响线虫的正常运动。使用前可先将铜环置于加热块或等效设备上加热。</li>
 <li>将铜环放置于新鲜的琼脂平板上（1.7% Bacto 琼脂，0.25% Bacto-蛋白胨，0.3% NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgSO4，25 mM 磷酸钾缓冲液，5 μg/ml 胆固醇），并轻轻按压，使其嵌入琼脂表面。</li>
 <li>挑取 L4 期或年轻成虫期线虫，转移至含有少量 NGM 缓冲液（0.3% NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgSO4，25 mM 磷酸钾缓冲液）的琼脂平板上，以洗去食物残留。让线虫游动数分钟。</li>
 <li>小心地将单个线虫放置于追踪平板中铜环中心附近，然后将平板置于线虫行为追踪仪上。</li>
</ol>
3. 线虫追踪
<ol>
 <li>运行 LabVIEW 程序，并根据需要选择选项（图像存储位置、图像类型、测量参数、相机设置）。</li>
 <li>使用操纵杆移动显微镜，直到在视野（计算机屏幕）中看到线虫的图像。按下“track”以启动追踪程序。</li>
 <li>该计算机程序实际上对经过二值化滤波处理的图像进行运动测量，如图所示，并能对该图像进行实时测量。</li>
 <li>追踪完成后，可根据步进电机的运动重建整体轨迹，同时可详细观察线虫的局部形态变化。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
 <li>运行骨架化脚本（MATLAB）以参数化线虫的形态。（图 2）</li>
 <li>计算骨架化数据的特征模式。（图 3,4）</li>
 <li>显示 图 5。阅读图注或代表性结果。</li>
</ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).</li>
<li>de Bono, M., Maricq, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+substrates+of+complex+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans.</a> Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).</li>
<li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).</li>
<li>Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+machine+vision+to+analyze+and+classify+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes+quantitatively%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively.</a> J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensionality+and+Dynamics+in+the+Behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans.</a> PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+modes+to+movement+in+the+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">From modes to movement in the behavior of C. elegans.</a> PLoS One. 5 (11), e13914(2010).</li>
<li>Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+standardized+quantitative+analysis+of+C.+elegans+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior.</a> BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parallel+Worm+Tracker%3A+A+Platform+for+Measuring+Average+Speed+and+Drug-Induced+Paralysis+in+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multimodal+optical+control+of+neurons+and+muscles+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).</li>
<li>Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+imaging+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).</li>
<li>Wittenburg, N., Baumeister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%3A+an+approach+to+the+study+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

研究运动和自然行为需要非侵入性的追踪技术，并结合数据降维方法。本文展示了一种易于使用的追踪系统，可记录秀丽隐杆线虫（C. elegans）在琼脂平板表面爬行时的详细行为图像。这些图像包含的信息量巨大且具有高维度，因此我们还开发了将数据降维至仅四个基本指标的方法。这些指标全面且易于解释，能够清晰反映线虫的行为特征。在本研究中，我们发现线虫在其波动周期的不同相位点更倾向于发生前进与后退状态之间的转换，这一测量结果难以通过肉眼观察实现。本工作与已有的低倍率下测量线虫行为的追踪系统8,9,10相辅相成，同时也与利用基因编码试剂来测量或调控神经元活动的系统互为补充11,12。
尽管单个生物体追踪是量化行为的有力方法，但该技术也存在一些局限性。首先是系统一次只能追踪单个生物体。与能够同时追踪多个生物体的固定摄像头追踪系统相比9,10，本追踪系统的通量较低。然而，我们能够对单个生物体的行为进行远比多虫追踪系统更长时间的观测，这对于量化饥饿、产卵和觅食等长时间尺度的行为尤为重要。此外，该追踪系统需要能够清晰将线虫与...

<table><tbody><tr><td>CCD 相机</td><td>Basler</td><td>A601f</td><td></td></tr><tr><td>镜头</td><td>Edmund Optics</td><td>MMS 系列</td><td></td></tr><tr><td>光纤照明</td><td>Dolan Jenner</td><td>DC-950H</td><td></td></tr><tr><td>平移台</td><td>Deltron</td><td>LS3-4</td><td></td></tr><tr><td>步进电机</td><td>US digital</td><td>MS23C</td><td> </td></tr><tr><td>步进电机驱动器</td><td>Gecko</td><td>G201</td><td></td></tr><tr><td>步进电机控制器</td><td>SimpleStep</td><td>SSXYZ</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">所有程序代码均可获取。请向通讯作者发送请求邮件。</td></tr></tbody></table>

c. elegans 追踪与行为学测量

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

我们开发了仪器设备、图像处理和数据分析技术，用于量化 C. elegans 在琼脂平板表面爬行时的运动行为。由于 C. elegans 遗传操作简便、适用于显微观察，并表现出多种复杂行为（如趋向性、学习和社会互动1,2），因此是研究行为的遗传、生化和神经基础的理想模式生物。基于追踪线虫在琼脂平板上爬行运动的行为分析，在感觉行为3、运动机制4以及一般突变表型分析5的研究中尤为有用。我们的系统通过在固定不动的琼脂平板上移动相机和照明系统来实现追踪，从而确保不会对线虫施加任何机械刺激。我们的追踪系统操作简便，并包含半自动校准功能。所有视频追踪系统面临的一个挑战是会产生大量本质上高维度的数据。我们的图像处理和数据分析程序通过将线虫的形态简化为一组独立成分来应对这一挑战，从而仅用3-4个维度即可全面重构线虫的行为6,7。作为该流程的一个示例，我们展示了线虫以特定相位的方式进入和退出其反向运动状态。

示例：在觅食过程中，C. elegans 会从前进运动转为后退运动，通常在恢复前进运动前会执行一次重新定向（欧米伽转弯）。量化这一转变对于理解线虫的觅食运动模式及其运动控制机制具有重要意义。使用我们的追踪装置能够揭示运动行为的细微细节。
以自由在琼脂平板上爬行约30分钟的线虫为研究对象，通过采集其高分辨率图像，观察其从前进到后退以及从后退到前进的运动转换过程。利用本征模式分析（图3），我们可以测量线虫波动运动的相位。相位测量结果进一步使我们能够计算线虫的运动速度以及从前进到后退的转换过程（图4）。通过绘制线虫速度与相位的联合概率分布图，可以看出前进与后退之间的转换是以特定偏好相位的概率方式发生的（图5a）。若将从前进到后退与从后退到前进的转换过程分别分析，并考察线虫进入和退出后退行为时相位的条件概率，我们发现这两类转换具有明显不同的相位分布特征（图5b,c）。
<p class="jove_content" fo:keep...

我们开发了一种视频速率追踪显微镜系统，能够以高分辨率和高速度记录并量化秀丽隐杆线虫（C. elegans）的行为。同时，我们还开发了计算方法，将线虫图像的维度降低为一组基本测量参数，这些参数可完整描述线虫的形态。

C. elegans 追踪与行为学测量

我们开发了仪器设备、图像处理和数据分析技术，用于量化秀丽隐杆线虫（C. elegans）在表面爬行时的运动行为。

表型分析。海葵的运动是发现参与其行为相关基因和神经元的重要工具。海葵通过改变自身形态，表现出一系列刻板的运动行为，例如前进、后退以及多种类型的转向。为了在较长距离上以高空间和时间分辨率量化这些运动，我们构建了一种蠕虫追踪系统，用于捕捉海葵在琼脂平板表面爬行时的运动轨迹。我们还开发了软件，利用实验室编写的 LabVIEW 和 MATLAB 自定义程序，对这些运动进行定量分离和分析。所有视频追踪系统面临的一个挑战是会产生大量高维度的数据。我们的图像处理和数据分析程序通过将线虫的形态简化为一组独立成分，应对了这一挑战，从而仅用三到四个维度就全面重构了线虫的行为模式。采用光纤光源照射琼脂平板，并用相机进行成像。该系统安装在XY平移台上。平移台由标准的步进电机驱动，步进电机连接至步进电机控制器。控制器和相机连接到计算机，并由使用LabVIEW编写的自定义程序进行控制。相机对琼脂平板表面成像，并在浅色背景上识别深色物体。通过戳破琼脂表面来制作自动校准过程的校准标记。使用线虫挑针调节图像质量，以便计算机程序能够实时量化物体。可调节相机的增益、亮度和快门速度，以在白色背景上呈现深色物体。可检查跟踪程序所使用的过滤后的二值化图像。该软件具有自动校准功能，通过移动测试物体一段固定距离来计算校准矩阵。校准矩阵将像素距离与步进电机运行的步数进行对应校准。校准完成后，系统即可投入使用，除非改变放大倍数或重新调整相机位置，否则无需重新校准。使用铜环将线虫围住，防止其迁移到培养皿边缘。首先将铜环置于加热块或等效装置上进行加热。应将环加热约一分钟。将环放置在新的琼脂平板上，并轻轻按压，使其嵌入琼脂表面。将使用含有NGM缓冲液的琼脂平板清洗四龄幼虫和年轻成虫阶段线虫的食物残渣。将线虫挑入 NGM 缓冲液后，让其游动几分钟。小心地将一条洗涤过的线虫放置在追踪培养皿中环的中心附近。该培养皿后续将用于线虫追踪仪。将准备好的培养皿放置到线虫追踪仪的载物台上。运行LabVIEW程序，并根据需要选择选项，例如图像保存位置、图像类型、测量参数和相机设置。使用操纵杆移动显微镜，直至在线虫追踪仪的计算机屏幕上看到线虫的图像。然后按“track”以启动追踪程序。此处展示的是实时追踪的线虫。计算机程序可对经过二值化滤波处理的图像进行运动测量，如图所示，并能对该图像进行实时测量。追踪完成后，可根据步进电机的运动重建出整体运动轨迹，同时可详细观察线虫局部形态的变化。线虫通过产生波动式运动进行爬行。我们通过将线虫骨架化为一条中心曲线来捕捉这些运动，并将该曲线描述为一组角度。随后，我们将骨架分解为其基本形状，即所谓的特征向量。利用这些特征模态，我们可以重构线虫的形态，并量化其运动行为。通过前两个模态，我们能够特异性地捕捉线虫波动周期的相位位置，如第二幅图所示。第一个图显示了模式一和模式二的联合分布，突出呈现了一个环形的极限环。沿一个方向的相位移动对应于向前运动，而沿相反方向的相位移动则对应于向后运动。因此，相位速度对应于蠕虫的运动速度。在实空间中，最后一幅图显示了相位与真实世界速度之间的强相关性。利用由本征模式导出的相速度，我们可以揭示出一些海蠕虫运动行为的细微特征，而这些特征是肉眼观察所无法发现的。例如，相速度与相位的联合分布清楚地表明，这些蠕虫倾向于在运动周期的特定相位离开或进入前进状态。在此，我们展示了一种易于使用的追踪系统，可记录硅胶表面及ACA平板上爬行行为的详细图像。这些图像包含的信息量巨大且具有高度维度，因此我们还建立了一种方法，将数据的维度简化为四个基本测量指标。这些指标在解释线虫行为方面具有良好的可读性。本研究旨在检测行为学上的线虫在较低修饰条件下的反应，该系统还可用于通过基因编码和包被区域来测量神经元活性。整个系统设计灵活，可与其他爬行系统（如 Doof law、LOEs）结合使用。

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神经科学

线虫跟踪和行为测量

研究人员可以通过施加电场来触发秀丽隐杆线虫（C.

趋化性电泳实验：一种观察秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动行为的方法

本视频介绍了使用视频和追踪软件在实验区域内记录线虫运动的方法。...

C. elegans 运动追踪：一种评估线虫运动能力的方法

本视频演示了使用径向运动实验评估表达野生型或ALS突变型人类TDP-43蛋白的C. elegans中运动功能障碍的方法。让表达不同水平野生型或突变型TDP-43的线虫自由爬行，并通过其在实验平板上从中心点出发所移动的径向距离来测量其运动能力。该实验根据不同C.

使用径向运动检测法评估 C. elegans 模型中的运动功能障碍

一种用于测量乙醇对运动速度影响的检测方法 秀丽隐杆线虫

本文展示了如何追踪和量化 C. elegans...

使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

本文介绍了一种高效且简便的基于计算机分析线虫在液体中游泳行为的方法。该方法对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CeleST 软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为进行自动化分析

我们介绍了一种行为记录装置和实验方案，可实现对线虫Caenorhabditis...

线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析

我们介绍了使用宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）的实验方案，该平台可实现对大量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

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动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

本方案描述了两种灵敏的检测方法，可用于区分肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）的 C. elegans 模型中轻度、中度和重度运动功能障碍，也可广泛适用于运动能力改变的 C. elegans...

肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

本文介绍了一种使用智能手机和发光二极管（LED）光源箱等 readily available 物品记录秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）草坪回避行为的简单且低成本方法。我们还提供了一个 Python...

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