使用氧化偶氮甲烷（AOM）和硫酸葡聚糖钠（DSS）建立结肠炎相关性癌症模型

在第0天，小鼠注射偶氮甲烷或OM，次周开始进行处理。其饮用水被替换为含葡聚糖硫酸钠（DSS）的溶液。第3周时，小鼠恢复饮用纯水，持续两周。

该DSS水循环需额外重复两次。在第二次DSS循环结束后，可通过内窥镜检查对小鼠进行肿瘤评估。

第10周后，处死小鼠并取出结肠。结肠经冲洗后沿纵轴切开，评估肿瘤大小和肿瘤数量。

将结肠纵向分为三段，进行包埋并提交用于组织学分析。通过光学显微镜可对肿瘤进行计数和分类。我们展示了一种实验方案，即先给予基因毒性试剂AOM，随后进行三个周期的促炎剂处理。

DSS 可快速且稳定地在小鼠中诱导结肠肿瘤，其形态学和分子特征与人类结肠炎相关癌症相似。在第0天，使用尾部标记或耳标对每只小鼠进行个体标记，记录每只小鼠的初始体重于表格中，随后每只小鼠注射10毫克/千克剂量的OM溶液。操作OM时需谨慎，因其为一种具有基因毒性的试剂。第7天起，为小鼠提供含2.5% DSS溶液的饮用水，持续一周。制备该溶液时，将DSS粉末加入蒸馏水中，搅拌至完全溶解。

溶液经0.2微米醋酸纤维素滤膜过滤后即可使用。为持续提供为期七天的DSS溶液，每两到三天更换一次DSS。

在此期间结束后，将小鼠换回普通水喂养两周。每周称重两到三次，并观察直肠出血和腹泻情况。肿瘤较大的小鼠可能会暂时出现直肠脱垂，但通常不会降低存活率。

体重相对于基线的下降被用作结肠炎严重程度的替代指标。在完成一个完整的DSS内镜周期后的一周内，预计会出现最高达10%的体重下降，并伴随两至三天的腹泻和直肠出血。可在处死动物前进行第二次或第三次DSS周期，以确认体内肿瘤的生长情况。

由于A-O-M-D-S-S模型在诱导肿瘤方面具有较高的可靠性，因此该步骤通常并非必需。仅需使用此方法评估少数小鼠，因为该方法可能对小鼠肿瘤造成干扰。你的操作区域应包括一个盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯以及一个空烧杯。

弃用的 PBS 可抽取 8 至 10 毫升 PBS 注入注射器中，每次使用后连接至内窥镜末端。冲洗管腔内容物时，使用吸入或注射镇静剂对每只小鼠进行麻醉，并用胶带将小鼠固定在平板上，固定部位为尾部和胸部，小鼠脚垫可被夹住。为确保充分镇静，用拇指和食指夹住小鼠下腹部以暴露肛门，然后将 muren 内窥镜插入小鼠直肠。

轻柔地使用 PBS 进行充盈和灌洗，以改善管腔内的视野并清除粪便内容物。在观察显示器的同时，缓慢继续推进内窥镜。在第 70 天，每只经 A-O-M-D-S-S 处理的小鼠应携带多个结肠肿瘤，可用于评估。

如果需要更大的肿瘤，该状态可延迟数周至数月。准备一支装有PBS的注射器，并连接灌胃针。注射器内装入10%福尔马林，另备基础外科剪刀、圆头剪刀。

使用一支装有1%伊文思蓝溶液的小型注射器和精细镊子。同时准备好一个冷盘、一个装有预冷PBS的培养皿、一把用于切片的新剃刀，以及一个盛有10%福尔马林的固定液盆。通过异氟烷麻醉、氟烷麻醉和颈椎脱位或其他机构批准的方法处死每只小鼠。可进行最终体重及其他相关测量。

此时，将小鼠仰卧置于解剖板上，暴露其腹侧。用70%乙醇喷洒腹部，以防止毛发污染解剖区域。用镊子夹住腹部中线处皮肤，剪开一小口，暴露腹膜。

轻轻牵拉，将皮肤与腹膜分离，充分暴露整个腹腔。切开腹膜，并沿两侧肋缘延长切口。使用闭合的剪刀将小肠和结肠推向一侧。

这将暴露肠系膜淋巴结，可根据需要选择性地进行采集。为进行评估，将泌尿生殖道向下清扫，以暴露降结肠和直肠，必要时切除膀胱和生殖器官，以进一步暴露盆腔，注意避免破坏邻近组织。

切开耻骨下支和耻骨上支，暴露肛管直肠交界处。在肛管直肠交界处周围切开皮肤，游离结肠，同时施加轻柔的向上牵引力。使用肠系膜镊子，可切除或分离结肠的系膜附着部分。

保留肛门直肠交界处的部分皮肤非常重要，因为该区域常受到发育异常的影响。在盲肠近端处将大肠与小肠切断。使用连接于5毫升注射器的18号灌胃针，将盲肠与相邻的结肠分离。

使用钝头剪刀沿生理方向用预冷的 PBS 冲洗结肠，使液体沿生理方向流出。沿肠系膜剪开结肠。将打开的结肠铺在冰冷的托盘上。

确保托盘已充分解冻，以免冻住组织。用手指涂抹数滴1%伊文思蓝，以更清楚地观察肿瘤。使用直尺测量肿瘤数量和大小，或拍摄照片以进行数字分析。

此时可从邻近正常组织中切除少量肿瘤组织，用于后续的RNA、蛋白质或免疫组织化学分析，同时保留部分结肠用于组织学评估。通过注射器或手指将10%甲醛加入冷盘中剩余的结肠内，使组织固定至少30秒。以此方式处理，便于转移至固定液容器中。

在同一个托盘上对新打开的结肠进行涂漆前，务必擦净残留的福尔马林。将结肠转移至盛有10%福尔马林的容器中，并用大头针固定边缘。固定3小时后，弃去福尔马林，更换为70%乙醇。

结肠组织可在70%乙醇中长期保存。用低温加热制备2%琼脂溶液，并在玻璃板上放置一张洁净的载玻片。将固定的结肠组织切成三段，未使用部分放回乙醇容器中。

使用两把剃刀将组织切段修整为大小一致的片段。将结肠组织切片及其层次结构包埋在洁净载玻片的琼脂中。对下一个结肠样本重复此操作。

切取组织断面，去除多余琼脂，将包埋的结肠组织放入包埋盒中进行后续处理，并用苏木精和伊红染色。图一概述了结肠炎相关癌症诱导的实验方案。图二显示了小鼠在OM和DSS处理期间相对于基线的体重变化。

请注意，在每次DSS处理周期后的1周内，小鼠会失去5%至10%的体重。本实验中体重下降是结肠炎严重程度的替代标志。图3显示了在AOM-DSS处理第50天时通过小鼠内镜观察到的远端结肠肿瘤情况。

请注意，与正常结肠相比，图B和图C中远端结肠管腔内存在多个息肉样肿块。图A中图4显示了纵向打开的小鼠结肠，展示了肿瘤的大体形态。可见远端结肠肿瘤负荷较高，而近端结肠具有典型的皱襞状结构，肿瘤生长较少。

图五展示了应用lc和蓝色染色剂后标记出的肿瘤。请注意染料如何凸显结肠的正常纹理以及各个肿瘤的边界。此类染色有助于使用直尺或数字测量方法精确测量肿瘤面积。

图六显示了经OM和DSS处理的小鼠每只平均肿瘤数量的代表性分布情况。请注意，大多数肿瘤位于远端结肠，且直径小于两毫米。图七显示了置于包埋盒中的结肠石蜡包埋纵向切片及其相应的苏木精和伊红（H&E）染色切片。

请注意，残留的S染料和蓝色染色不会干扰苏木精和伊红（H&E）染色。在切片图像上用圆圈标出一个较大的肿瘤。远端、中段和近端的命名是根据从盲肠到肛门将整个结肠均分为三段后进行切片而确定的。

图八显示了在远端结肠中由OM和DSS处理后产生的肿瘤的代表性组织学图像。所示显微照片经H和E-B-R-D-U以及β-catenin染色，显示出类似于人类结肠腺癌的异型增生改变。在本视频中，我们展示了一种利用单次OM注射后接三个为期七天的DSS循环，以诱导小鼠炎症驱动的结肠肿瘤发生的实验方案。

在10周时间内，该模型诱导产生的肿瘤在组织学和分子改变方面与人类结肠炎相关癌症高度相似，为研究该疾病中的肿瘤发生机制及化学预防提供了极具价值的模型。