Name: 建模结肠炎相关的癌症与氧化偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 了解使用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠肿瘤的实验方法。该模型通过三轮DSS循环处理，可在十周内稳定产生与人类结肠炎相关癌症具有形态学和分子相似性的肿瘤，为研究肿瘤发生机制和化学预防提供可靠平台。

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本工作部分由DK089016和L30 RR030244（MAC）、CA153036（AS）以及P30-DK52574（资助华盛顿大学消化系统疾病研究中心）提供资金支持。A.I.T. 是霍华德·休斯医学研究所医学研究培训研究员。

1. 结肠炎相关性癌症诱导
<ol>
 <li>准备若干笼性别和年龄匹配的6-8周龄小鼠，用于实验组和对照组。可通过尾部标记或耳标对小鼠进行个体标识。</li>
 <li>第0天，记录小鼠的基线体重，并通过腹腔注射（IP）给予每只小鼠10 mg/kg的AOM工作溶液（用等渗盐水配制成1 mg/ml，由保存于-20 °C的dH2O中10 mg/ml储备液稀释而来）。根据经验，该剂量可在7-14 mg/kg范围内调整和/或在实验早期重复给药。</li>
</ol>
注意：AOM 是一种易挥发的遗传毒性试剂，应根据随附的材料安全数据表（MSDS）小心操作。稀释液应在通风橱中配制，置于冰上保存，并按照各机构特定的规程进行废弃处理。
<ol start="3">
 <li>在蒸馏水中配制2.5%（2.5 g/100 ml）的DSS溶液，并通过真空过滤装置经0.22 μm醋酸纤维素滤膜过滤。该浓度可根据小鼠品系和饲养环境在1–3.5%之间调整。配制好的DSS溶液可在4°C冰箱中保存最多1周。</li>
 <li>第7天起，将DSS溶液作为小鼠的饮用水供给。每更换一次DSS溶液，每个笼盒大约需要250 ml，最多可供应5只小鼠；但具体用量会因动物设施所使用的饮水瓶类型而有所差异，此处仅为估算值。</li>
 <li>为确保连续7天的DSS供给，应在该期间内每2–3天更换一次溶液，共更换三次，使用清洁的饮水瓶。部分研究人员会在更换新溶液前测量小鼠对DSS溶液的消耗量，以评估暴露水平。</li>
 <li>第14天起，将小鼠换回标准饮用水，持续两周。</li>
 <li>在第28天和第49天重复步骤（1.4）至（1.6），以完成第二轮和第三轮DSS处理。每个DSS“处理周期”包括1周的含DSS饮水期，随后接2周的普通（高压灭菌）饮水期。</li>
</ol>
2. 结肠炎和肿瘤进展的临床评估
<ol>
 <li>小鼠应每周称重和观察 2-3 次。体重下降百分比（相对于基线）被用作结肠炎严重程度的替代指标。可根据实验目的定期评估直肠出血、腹泻或脱垂情况，并依据不同的评分系统进行报告。9, 10</li>
 <li>在完成一个完整的 DSS 周期后的一周内，通常可观察到体重下降不超过 10%，并伴有 2-3 天的腹泻和直肠出血（在此 DSS 后的急性期，每日观察可能具有重要意义）。</li>
</ol>
部分小鼠可能无法恢复；体重减轻超过20%的小鼠存活可能性较低，可能需要提前实施安乐死。对这些小鼠进行一次腹腔注射0.5–1.0 ml生理盐水，有助于纠正因腹泻导致的体液丢失，是一种有效的支持性措施。
3. 小鼠内窥镜检查（可选）
<ol>
 <li>可在第二次或第三次 DSS 处理后进行内窥镜检查，以在处死前确认体内肿瘤的生长情况。in vivo 由于 AOM/DSS 模型在诱导肿瘤方面具有较高的可靠性，因此该步骤通常并非必需。仅需使用此方法评估少数小鼠，因其可能干扰小鼠肿瘤的自然发展。11 </li>
 <li>使用吸入性或注射性镇静剂对小鼠进行麻醉。 </li>
 <li>小鼠麻醉后，用胶带将其尾部和胸部固定于平板上。 </li>
 <li>将小鼠内窥镜轻柔地插入小鼠直肠，同时使用生理盐水进行充盈和冲洗，以改善管腔内的视野并清除粪便内容物。（需注意，内窥镜检查也可采用空气灌注代替生理盐水，该技术可能提供更清晰的肿瘤可视化效果。12） </li>
</ol>
4. 小鼠处死与结肠采集
<ol>
 <li>在第70天，每只经AOM/DSS处理的小鼠应已形成多个结肠肿瘤，可进行评估。若需要更大的肿瘤，此时间可推迟数周至数月。（注意：出现严重直肠脱垂的小鼠可能需要提前实施安乐死，以避免动物遭受过度不适，具体应遵循机构动物护理委员会的规定。）</li>
 <li>在解剖前，使用异氟烷麻醉后行颈椎脱位（或其他机构批准的方法）对小鼠单独实施安乐死。此时可记录最终体重及其他相关测量数据。</li>
 <li>将小鼠腹侧朝上放置于解剖板上。用70%乙醇覆盖腹部，以防止在结肠取出过程中毛发污染腹腔内容物。</li>
 <li>使用镊子夹住腹部中线部位，做一小切口以暴露腹膜。</li>
 <li>沿两侧肋缘方向延伸切口。</li>
 <li>使用剪刀剪开骨盆区域，以便将结肠完整取至肛直肠交界处。此步骤至关重要，因为DSS结肠炎损伤在远端直肠最为严重，相应地，肿瘤也主要在此区域形成。</li>
 <li>此时也可同时采集其他组织，如肠系膜淋巴结。</li>
</ol>
5. 准备结肠进行宏观分析
<ol>
 <li>使用连接5 ml注射器的18G灌胃针，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，使液体沿生理方向流出。若结肠组织将用于RNA或基于蛋白质的分析，可通过使用预冷的工作托盘保持组织低温。</li>
 <li>沿肠系膜纵向切开已冲洗的结肠，并将其展平于冷托盘上。将结肠置于深色背景上可更清晰地观察肿瘤。也可使用1%阿尔新蓝（Alcian blue）染料染色以突出显示肿瘤。使用直尺或数显卡尺评估肿瘤的数量和大小。</li>
 <li>此时可切取少量肿瘤组织及相邻的正常组织，用于后续的RNA、蛋白质或免疫组化（IHC）分析，剩余部分结肠则保留用于组织学评估。</li>
</ol>
在完成步骤5.2后立即对大体结肠标本进行数码摄影，有助于精确分析肿瘤负荷，特别是当如上所述需切除结肠的较大部分用于其他形式的分析时。可使用ImageJ等免费软件，通过肿瘤面积/结肠总面积来计算肿瘤负荷（%）。
6. 准备结肠组织用于组织学评估
<ol>
 <li>使用注射器或手指将10%福尔马林滴加到冷托盘上剩余的结肠组织上。以这种方式使组织固定至少30秒，有助于将其转移至固定液容器中。在同一切割托盘上处理另一段新开口的结肠前，务必擦去残留的福尔马林。 </li>
 <li>将结肠转移至盛有10%福尔马林的容器中，并用针固定边缘。 </li>
 <li>固定3小时后，将结肠转移至70%乙醇中。结肠可在70%乙醇中长期保存。 </li>
 <li>可将结肠的三个纵行切片（近端、中段、远端/直肠）嵌入2%琼脂中以稳定结构，并送进行石蜡包埋。确保每只小鼠的近端结肠与远端结肠/直肠方向保持一致。 </li>
 <li>由经验丰富的人员根据已发表的方案10, 13-15对异型增生、隐窝损伤和炎症进行描述与评估。若实验者希望检测早期异型增生事件，可在第70天前处死小鼠。 </li>
</ol>
7. 代表性结果
本文所述的AOM/DSS模型可使研究人员在小鼠中稳定诱导结肠肿瘤。该模型中肿瘤的生长直接受相关炎症过程的影响。应通过监测体重减轻以及腹泻/便血情况来临床评估结肠炎的严重程度（图2）。这些疾病活动的体征通常在DSS处理周期的第5天开始出现，并在停用DSS后持续四天或更长时间。极少数情况下，直肠肿瘤负荷较重的小鼠可能发生直肠脱垂。在第二次或第三次DSS处理周期后，腹泻可能转为持续性。通常在第三次DSS处理周期之前，通过小鼠结肠镜检查即可发现并识别肿瘤（图3）。延长实验时间并进行第三次DSS处理可在处死取材时获得更大的肿瘤（图4）。可使用局部应用的阿利新蓝（Alcian blue）染色来突出显示肿瘤（图5）。结肠肿瘤的照片有助于进行肿瘤测量，从而可在不同实验组之间对肿瘤数量和大小进行定量比较（图6）。固定并包埋于石蜡中的结肠组织样本可进一步用于组织学评估或免疫组织化学染色分析（图7和图8）。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="实验时间线示意图；AOM/DSS处理周数；炎症研究流程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. AOM和DSS给药示意图。在第0天注射AOM（10 mg/kg）。从第二周开始（第7天），将2.5%的DSS溶液加入小鼠的饮水中。给予DSS 7天后，更换为无菌水饮用2周。在处死小鼠前，再进行两个额外的DSS处理周期。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="显示56天内相对体重变化的图表；生物学研究中的数据分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠在给予AOM和DSS期间相对于基线的体重变化。请注意，在每轮DSS处理后的那一周，小鼠会失去5-10%的体重。本实验中体重减轻是结肠炎严重程度的替代指标。 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="内窥镜图像显示解剖结构；标签标示了用于研究的区域1、2和3。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通过小鼠内窥镜在AOM/DSS处理第50天观察远端结肠肿瘤。注意与正常结肠（a）相比，远端结肠腔内存在多个息肉样肿块阻塞（b, c）。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="组织形态图；远端、中段、近端区域；显微镜分析；生物学研究" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 纵向打开的小鼠结肠，显示肿瘤的大体形态。注意远端结肠/直肠区域肿瘤负荷较高（左上方图像），而近端结肠具有特征性的皱褶状纹理（右上方图像），且肿瘤生长较少。远端结肠的放大图像显示多个大小不一的肿瘤（下方）。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="肠道结构，解剖；消化系统解剖图；研究人体胃肠道。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 经阿利新蓝染色后显示的肿瘤。请注意染料如何突出结肠的正常纹理以及各个肿瘤的边界。此类染色有助于使用直尺或数字方法精确测量肿瘤面积。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Tumor distribution bar graph; colon locations; diameter comparison; research analysis." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 经AOM/DSS处理小鼠的平均每只肿瘤数的代表性分布。注意大多数肿瘤位于远端结肠，且为 &lt;2 mm 大小。 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="小鼠结肠切片的组织学切片，标注了解剖区域和位置，示意图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图7. 结肠在包埋盒中的石蜡包埋纵向切片（上方）以及经H&amp;E染色后在载玻片上的切片（下方）。请注意，残留的阿利新蓝染色不会干扰H&amp;E染色。载玻片图像中标出了一个较大的肿瘤（用圆圈标出）。"远端"、"中段"和"近端"的命名是根据从盲肠到肛门之间将整个结肠均分为三段后确定的。
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="组织学分析示意图：H&amp;E、BrdU、β-catenin 染色的组织切片，放大倍数分别为 50 倍和 400 倍。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. AOM/DSS 处理后在远端结肠形成的肿瘤的代表性组织学图像。H&amp;E、BrdU 和 β-catenin 染色切片在 50X（上图）和 400X（下图）下的结果均显示存在类似于人类结肠腺癌的异型增生改变。

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</ol>

无利益冲突声明。

采用AOM和DSS处理小鼠可快速且有效地模拟人类结肠炎相关性癌症。通过基因工程小鼠可方便地研究与结肠炎相关性癌症相关的遗传因素的假设。13, 16 或者，可利用野生型小鼠研究药物靶点在结肠炎相关性癌症中的作用。
尽管该模型在炎症背景下研究结肠肿瘤发生方面备受重视，但仍存在局限性。在此模型中，小鼠所表现出的疾病程度可能因小鼠品系及饲养条件（笼具、喂养、微生物群等）的不同而有显著差异。Suzuki 等人报道，Balb/c 小鼠对 AOM/DSS 最为敏感，随后依次为肿瘤发生率和数量递减的 C57BL/6N、C3H/HeN 和 DBA/2N 小鼠17。单独使用 DSS 和 AOM 对 129/Sv 小鼠进行的实验结果提示，其对联合处理的反应程度中等，与 C57BL/6J 小鼠相似18,19。因此，根据可用的设施和资源，可能需要开展预实验以确定最有效的给药方案。虽然 AOM/DSS 诱导的结肠肿瘤在组织学上类似于人类结直肠癌，但极少发生转移。在分子水平上，已有报道显示 β-catenin、COX-2 和 iNOS 发生改变，...

<table><tbody><tr><td> C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>偶氮甲烷（AOM）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5486-100MG</td><td>&lt;strong&gt;储存液：&lt;/strong&gt;用蒸馏水稀释至 10 mg/ml，分装为 0.5 - 1 ml 每份，于 -20 &amp;deg;C 保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;工作液：&lt;/strong&gt;将储存液用等渗（0.9%）生理盐水稀释至 1 mg/ml</td></tr><tr><td>葡聚糖硫酸钠（DSS）</td><td>TdB 咨询公司</td><td>DB001</td><td>分子量 40 kDa（其他来源的 36-50 kDa 制剂也可接受；单次实验应使用同一批号）&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Coloview 微型内窥镜系统</td><td>Karl Storz</td><td>多种型号</td><td>有关设备和设置的详细说明，请参见 Becker &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>TPP Rapid FILTERMAX 500 ml 瓶式滤器，0.22 &amp;mu;m PES</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99500</td><td>任何标准组织培养滤器均可接受</td></tr><tr><td>200 证明乙醇 ASC/USP</td><td>Pharmaco-AAPER（或其他）</td><td>11ACS200</td><td>用蒸馏水稀释至 70%</td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Butler 动物健康供应公司</td><td>4029405</td><td>将小鼠放入装有浸有麻醉剂的纱布或小块布料的玻璃罐中</td></tr><tr><td>18G 直式灌胃针</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-008</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>用蒸馏水稀释至 1X（0.01 M）</td></tr><tr><td>冷冻托盘（Tissue Tek II 冷冻板）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>NC9491941</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院（免费下载）</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot; target=&quot;_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>甲醛（37%）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>F79-500</td><td>用 PBS 稀释至 10%</td></tr><tr><td>BD Bacto 琼脂</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>DF0140-01-0</td><td>使用加热板在蒸馏水中配制 2% 溶液</td></tr><tr><td>Miltex 眼科敷料镊</td><td>MedPlus 公司</td><td>18-780</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 眼科剪</td><td>MedPlus 公司</td><td>18-1430</td><td>弯曲尖端可在打开结肠时防止损伤组织。</td></tr><tr><td>阿尔新蓝 8GX（粉末）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5268</td><td>将 1 g 粉末加入 100 ml 3% 乙酸溶液中（3 ml 冰乙酸 + 97 ml 蒸馏水）</td></tr><tr><td>1 mL 结核菌素注射器，配 26 G × 3/8 英寸皮内斜面针头</td><td>BD</td><td>305946</td><td>用于 AOM 注射</td></tr></tbody></table>

使用氧化偶氮甲烷（aom）和硫酸葡聚糖钠（dss）建立结肠炎相关性癌症模型

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

炎症性肠病（IBD）患者，如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）患者，相较于健康人群，发生结直肠癌（CRC）的风险更高。该风险与疾病持续时间和累及范围呈正相关，在病程较长且结肠广泛受累的UC患者中，累积发病率可高达30%1。IBD相关的结肠异型增生及结肠炎相关性癌（CAC）被认为是在慢性炎症细胞因子环境中，上皮细胞反复经历损伤与修复循环的结果2。尽管自发性结直肠癌与结肠炎相关性癌均属于腺癌，但其潜在的分子事件发生顺序被认为存在差异3。这一区别凸显了建立特定CAC动物模型的必要性。
目前已有多种小鼠模型可用于结肠炎相关性癌（CAC）的研究。葡聚糖硫酸钠（DSS）是一种对结肠上皮具有直接毒性作用的试剂，可通过饮水方式在小鼠中以多个周期给药，从而诱导慢性炎症状态。在足够长的时间后，部分小鼠将发展出肿瘤。4 若在促癌环境中使用该模型，肿瘤的发生将被加速。这包括携带肿瘤发生通路相关基因突变的小鼠（如 APC、p53、Msh2），以及预先用致突变剂处理的小鼠（如偶氮甲烷 [AOM]、1,2-二甲基联氨 [DMH]）。5
将DSS与AOM联合用于结肠炎相关性癌症的动物模型因其可重复性强、效果显著、成本低廉且操作简便而广受青睐。尽管AOM与DMH具有相似的作用机制，但研究发现AOM在溶液中比DMH更具活性且更稳定。在其他模型中，肿瘤的形成通常需要数月时间，而经AOM注射后给予DSS处理的小鼠在短短7至10周内即可形成充分的肿瘤6, 7。此外，AOM和DSS可应用于任何遗传背景的小鼠（如基因敲除、转基因等），无需与特定的致瘤品系进行杂交。本文展示了一种在小鼠中诱导炎症驱动的结肠肿瘤发生的实验方案，具体为单次注射AOM后，在10周内进行三个为期7天的DSS处理周期。该模型所诱导的肿瘤在组织学和分子改变方面与人类结肠炎相关性癌症（CAC）高度相似，为研究该疾病中的肿瘤发生机制及化学预防提供了极为有价值的实验平台8。

我们展示了一种实验方案，该方案通过给予小鼠致基因毒性试剂偶氮甲烷（AOM），随后进行三轮促炎剂葡聚糖硫酸钠（DSS）处理，可快速且稳定地诱导小鼠结肠肿瘤形成，其形态学和分子特征与人类结肠炎相关性癌症中的肿瘤具有相似性。

使用氧化偶氮甲烷（AOM）和硫酸葡聚糖钠（DSS）建立结肠炎相关性癌症模型

患有炎症性肠病（IBD），如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）的个体，发生结直肠癌的风险增加……

在第0天，Myer注射了偶氮甲烷或OM，随后在接下来的一周内，其饮用水被替换为含葡聚糖硫酸钠（DSS）的溶液。在第三周时，小鼠给予饮水，持续两周。该DSS水循环需额外重复两次。在第二次DSS循环结束后，可通过内窥镜检查对小鼠进行肿瘤评估。第10周后，处死小鼠并采集结肠。结肠经冲洗后沿纵轴剖开，评估肿瘤大小和肿瘤数量。可将结肠纵向三等分的组织切片进行包埋并提交用于组织学分析。通过光学显微镜可对肿瘤进行计数和分类。我们展示了一种实验方案，该方案中先给予致基因毒性试剂 OM，随后进行三个周期的促炎性试剂处理。DSS 能在小鼠中快速且稳定地诱导结肠肿瘤，其形态学和分子特征与人类结肠炎相关癌症相似。在第0天，使用尾部标记或耳标对每只小鼠进行单独标记，记录每只小鼠的初始体重并填入表格，随后每只小鼠注射10毫克/千克剂量的OM溶液。操作OM时需谨慎，因其为一种具有基因毒性的试剂。在第7天，为小鼠提供含2.5% DSS溶液的饮用水，持续一周。制备该溶液时，将DSS粉末加入蒸馏水中，搅拌至完全溶解。溶液经过 0.2 微米的醋酸纤维素滤膜过滤后即可使用。为持续提供为期七天的 DSS 溶液供应，每两到三天更换一次 DSS 溶液。在此期间结束后，将小鼠换回饮用清水，持续两周。每周称重小鼠两到三次，并观察是否出现直肠出血和腹泻。肿瘤较大的小鼠可能会暂时出现直肠脱垂，但通常不会降低存活率。体重相对于基线的下降被用作结肠炎严重程度的替代指标。在完成一个完整的DSS内镜周期后的一周内，预计会出现最高达10%的体重下降，并伴随两到三天的腹泻和直肠出血。可在处死动物前进行第二次或第三次DSS周期，以确认体内肿瘤的生长情况。由于A-O-M-D-S-S模型在成瘤方面具有较高的可靠性，因此该步骤通常并非必需。仅需采用此方法评估少数小鼠，因为该操作可能干扰小鼠的肿瘤。你的操作区域应包括一个盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯以及一个空烧杯。弃用 PBS 时，用注射器抽取 8 至 10 毫升 PBS，按需连接至内窥镜末端。在冲洗管腔内容物时，使用吸入或注射麻醉剂对每只小鼠进行麻醉，并用胶带将小鼠固定于平板上，固定部位为尾部和胸部，必要时可夹住小鼠足垫。为确保充分麻醉，用拇指和食指轻捏小鼠下腹部以暴露肛门，随后将 muren 内窥镜插入小鼠直肠。轻柔地使用 PBS 进行充盈和冲洗，以改善管腔内的视野并清除粪便内容物。在推进内窥镜的同时持续缓慢前进并观察显示器。在第 70 天，每只经 A-O-M-D-S-S 处理的小鼠应携带多个结肠肿瘤，可用于评估。如果需要更大的肿瘤，此状态可延迟数周至数月。准备一支装有 PBS 的注射器，并连接灌胃针。注射器内装有 10% 甲醛，另备基础外科剪刀、尖端圆钝的剪刀。使用一支装有1%伊文思蓝溶液的小型注射器和精细镊子。同时准备好一个冷托盘、一个装有预冷PBS的培养皿、一把用于切片的新剃刀，以及一个盛有10%甲醛的固定液盆。通过异氟烷麻醉、氟化物处理结合颈椎脱位或其他机构批准的方法处死每只小鼠。随后可进行最终体重及其他相关测量。此时，将小鼠仰卧置于解剖板上，暴露其腹侧。用70%乙醇喷洒腹部，以防止毛发进入解剖区域。用镊子夹住腹部中线处的皮肤，剪开一小口，暴露腹膜。使用轻柔的牵拉力将皮肤与腹膜分离，充分暴露整个腹腔。在腹膜上做一切口，并沿两侧肋缘延伸该切口。用闭合的剪刀将小肠和结肠向两侧推开。这将暴露肠系膜淋巴结，可根据需要选择性地进行采集。为进行评估，将泌尿生殖道向下清扫，以暴露降结肠和直肠；根据需要切除膀胱和生殖器官，以进一步暴露盆腔，注意避免损伤邻近组织。切开耻骨下支和耻骨上支，暴露肛管直肠交界处。在肛管直肠交界处周围切开皮肤，游离结肠，同时施加轻柔的向上牵引力。使用肠系膜镊子，可切除或分离结肠的系膜附着部分。保留肛门直肠交界处的部分皮肤非常重要，因为该区域常受到发育异常的影响。在盲肠近端处将大肠与小肠切断。使用连接于5毫升注射器的18号灌胃针，将盲肠与相邻的结肠分离。用钝头剪刀沿生理方向以冰冷的PBS冲洗结肠。沿肠系膜剪开结肠。将打开的结肠铺在冷托盘上。确保托盘已充分解冻，以免组织冻结。用手指涂抹数滴1%伊文思蓝，以更清晰地观察肿瘤。使用直尺评估肿瘤数量和大小，或拍摄照片用于数字分析。此时可切除邻近正常组织中的小块肿瘤组织，用于后续的RNA、蛋白质或免疫组织化学分析，同时保留部分结肠用于组织学评估。用注射器或手指将10%甲醛加入冷托盘中剩余的结肠内，使组织固定至少30秒。以此方式处理有助于将组织转移至固定液容器中。在同一托盘上对新打开的结肠进行染色前，需确保将残留的福尔马林彻底擦净。将结肠转移至盛有10%福尔马林的容器中，并用大头针固定边缘。固定3小时后，弃去福尔马林，更换为70%乙醇。结肠组织可在70%乙醇中长期保存。用低温加热制备2%琼脂溶液，并在玻璃板上放置一张洁净的载玻片。将固定的结肠组织切成三段，未使用部分放回乙醇容器中。使用两把剃刀将组织切段修整为大小一致的片段。将结肠组织切片及其层次结构包埋在洁净载玻片的琼脂中。对下一个结肠样本重复此操作。切取组织段，去除多余琼脂，将包埋的结肠组织放入包埋盒中进行后续处理，并用伊红-苏木精染色。图一概述了结肠炎相关癌症诱导的实验方案。图二显示了在OM和DSS处理期间小鼠体重相对于基线的变化。请注意，在每次DSS处理周期后的1周内，小鼠体重会减轻5%至10%。本实验中体重减轻是结肠炎严重程度的替代指标。图三显示了在A-O-M-D-S-S处理第50天时，通过小鼠内镜观察到的远端结肠肿瘤情况。请注意，与正常结肠相比，B 和 C 图中远端结肠管腔内存在多个息肉样肿块。图 A 中图四显示了纵向打开的小鼠结肠，展示了肿瘤的大体形态。注意远端结肠的肿瘤负荷较高，而近端结肠具有典型的绒毛状结构，肿瘤生长较少。图五展示了应用lc和蓝色染料后突出显示的肿瘤。注意染料如何凸显结肠的正常纹理以及各个肿瘤的边界。此类染色有助于使用直尺或数字测量方法精确测量肿瘤面积。图六显示了经OM和DSS处理的小鼠每只平均肿瘤数量的代表性分布情况。请注意，大多数肿瘤位于远端结肠，且大小小于两毫米。图七显示了置于盒式夹中的结肠石蜡包埋纵向切片以及H和E染色切片。请注意，残留的S和蓝色染色不会干扰苏木精和伊红（H&E）染色。在切片图像上圈出了一个较大的肿瘤。远端、中段和近端的命名是根据从盲肠到肛门将整个结肠分为三等分进行切片而确定的。图八显示了在远端结肠中由OM和DSS处理后产生的肿瘤的代表性组织学图像。所示显微照片经H和E-B-R-D-U及β-catenin染色，呈现出类似于人类结肠腺癌的异型增生性改变。在本视频中，我们展示了一种利用单次OM注射联合三个七天DSS周期来诱导小鼠炎症驱动的结肠肿瘤发生的实验方案。在10周的时间内，该模型诱导产生的肿瘤在组织学和分子改变方面与人类结肠炎相关癌症的发生过程高度相似，为研究该疾病的肿瘤发生机制及化学预防提供了极具价值的模型。

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了解使用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠肿瘤的实验方法。该模型通过三轮DSS循环处理，可在十周内稳定产生与人类结肠炎相关癌症具有形态学和分子相似性的肿瘤，为研究肿瘤发生机制和化学预防提供可靠平台。

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