使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

本研究对唾液肽组的分析采用类似棒棒糖的超滤探针，随后进行直接的纳米液相色谱-LTQ质谱分析。首先，使用聚醚砜膜和乙烯丙烯管组装LLUF探针。接着，采集志愿者的唾液样本，并通过LLUF探针处理以获取唾液样品。

然后直接进行纳米液相色谱-线性离子阱-质谱分析，对经LLUF探针处理与未经处理的唾液样本数据进行分析。最终，通过分析液相色谱-质谱-质谱数据并比较两组样本中鉴定出的肽段，可获得唾液肽谱。这种将棒棒糖式超滤探针与直接纳米液相色谱-LTQ质谱分析相结合的方法，相较于将唾液蛋白质酶解为肽段等其他方法，具有显著优势。

随后进行质谱分析，LUF PRO 可简化并净化唾液，同时增强全唾液中肽段的质谱检测能力，适用于临床应用。使用环氧胶将聚醚类手机膜密封在三角形聚丙烯桨片的边缘上。然后将聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管连接至三角形结构的圆柱形出口。

使用聚丙烯桨叶将探针在70%乙醇中浸泡过夜以进行灭菌，并评估密封性；将LLUF探针浸入50毫克/毫升的蓝色葡聚糖溶液中两小时。确认所收集的样品中无蓝色葡聚糖存在。

招募20至40岁的健康志愿者。用清水漱口后，让受试者将全唾液样本吐入预冷的冰上容器中。收集所有样本并置于冰上保存。

采集后立即携带200微升唾液进入4摄氏度房间，使用LLUF探针对唾液进行取样。将聚醚细胞膜放入培养皿中的人类唾液中浸润。通过抽吸注射器产生负压，模拟从唾液中进行超滤取样的过程。

接下来，测定蛋白质浓度。为进行纳米液相色谱-质谱分析，将唾液蛋白质样品配制成每微升含一微克蛋白质的溶液。在样品分析过程中，我们使用一台Exigent纳米液相色谱系统，该系统在线连接Finnegan LTQ质谱仪。首先，通过自动进样器将五微升未消化的唾液样品加载至纳米液相色谱系统的捕获柱上。

洗涤步骤后，切换阀门，向捕获柱和C18分离柱输送0至50%的缓冲液B线性梯度。使用Excalibur的数据依赖模式，采集强度高于1×10⁴的四个最强MS离子的二级质谱（ms/ms）谱图。对每个样品，进行三次独立制备的重复测定，每次制备均做两次重复运行。

然后将数据文件导入 Sequester Sorcerer Two 系统，选择针对适当的 NCBI 人类蛋白质数据库进行搜索，并使用非酶特异性条件。Sequester 搜索完成后，结果将自动过滤、验证，并在 Peptide Prophet 和 Protein Prophet 中基于 Sequester 的结果进行展示。Peptide Prophet 会估算每条肽段鉴定结果为正确或错误的综合概率 P 值评分，同时提供每条肽段序列的附加信息。

蛋白质置信度基于分配给质谱图的肽段，为每种蛋白质计算一个从0到1的概率评分。本部分旨在评估LLUF探针清除口腔细菌的能力，以用于细菌检测培养；通过在螺旋平板上对采集LLUF探针前后获取的唾液样本进行需氧菌检测。需氧菌培养使用无抗生素的LB螺旋平板，在37摄氏度下培养一天；厌氧菌培养则需使用气体发生包进行培养。

将样本在布鲁氏肉汤中，于37摄氏度厌氧条件下，在螺旋平板上培养一天。棒棒糖状的超滤装置有助于在模拟口腔环境中采集唾液样本。在该系统中，将分子截留量为30千道尔顿的带负电荷聚醚砜膜粘附于聚丙烯桨片上，并置于LLUF探头前方，以滤除唾液中较大的蛋白质。

为了模拟人口腔环境，使用注射器将海绵浸透唾液。唾液通过连接的导管进行过滤并收集。通过比较唾液在使用LLUF取样前后的液相色谱图，结合纳米液相色谱-串联质谱技术，鉴定了唾液中的内源性肽段。

由于这些差异色谱图无需化学或酶解消化即可获得，因此简化了临床用途的样品制备流程。在此样品中，LLUF解析出不同的蛋白质组成，并在未消化的唾液中鉴定出131种肽段。

这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质，包括肌动蛋白、α-淀粉酶、α-珠蛋白、β-珠蛋白、组蛋白、角蛋白、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及S100A9。经过LLUF探针筛选后，在唾液中鉴定出26种独特肽段，主要为各种富含脯氨酸蛋白质的片段。

这种源自α-淀粉酶的肽段仅在未使用LLUF探针采集的唾液样本中被检测到，说明了LLUF探针在去除大分子蛋白质方面的有效性。最引人注目的是，在去除大分子蛋白质后，使用LLUF探针采集的唾液样本中可检测到多个序列肽段，尤其是经过超滤LLUF探针处理后的样本中鉴定出了富含脯氨酸C末端的肽段。现在，您应该已充分了解如何使用A-L-L-L-L-U-F PRO对唾液进行简单处理以用于质谱分析。

在一致的条件下收集和采集简单的唾液样本对于更佳的分析至关重要。一旦掌握，我相信该技术可在三小时内正确完成。这种采用类似棒棒糖的超滤探针结合直接纳米液相色谱-串联质谱分析的方法，有助于生物标志物在人类疾病诊断中的临床应用。