Name: 采样使用超探头棒棒糖样的土著人的唾液多肽:简化和增强肽的临床质谱检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解棒棒糖状超滤探针采集唾液多肽的方法，用于临床质谱检测。该技术通过NanoLC-LTQ质谱直接分析，有效去除高丰度蛋白，提升低丰度肽段检测灵敏度，简化样本前处理流程。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01-AI067395-01、R21-R022754-01 和 R21-I58002-01）的支持。我们感谢 C. Niemeyer 对稿件的审阅。

1. LLUF 探针的制备
<ol>
 <li>使用环氧树脂将聚醚砜膜（2 cm2）粘合在聚丙烯三角桨片（University of California, San Diego）的边缘，实现密封。实验采用带负电荷、截留分子量（MWCO）为30 kDa的聚醚砜膜。</li>
 <li>将特氟龙氟化乙烯丙烯管（内径/外径，0.35/0.50 cm）连接至聚丙烯三角桨片的圆柱形出口，以便将LLUF探针连接至20 ml注射器。</li>
 <li>将聚醚砜膜浸泡于培养皿（直径50 mm）中的人类唾液后，通过抽拉注射器产生负压。在负压作用下，注射器驱动超滤过程，实现唾液中蛋白质的采样。</li>
 <li>探针在使用前用70%酒精灭菌过夜。为验证密封性良好，将LLUF探针置于含蓝色葡聚糖（50 mg/ml，平均分子质量为2,000 kDa）的溶液中2小时。收集样品中未检出蓝色葡聚糖，表明探针制备和采样过程中无泄漏发生。</li>
</ol>
2. 唾液采集
<ol>
 <li>从三名健康志愿者（两名男性和一名女性，年龄在20至40岁之间）收集全唾液，这些志愿者未服用任何药物，且无明显牙龈炎或龋齿症状6。</li>
 <li>用水漱口后，通过自然吐出的方式收集全唾液样本，不进行化学刺激，并将样本收集至冰浴冷却的容器中。</li>
 <li>所有样本混合后，在采集过程中始终保持在冰上。</li>
 <li>采集后立即取唾液（200 μl）用于LLUF探针采样。采样在4 °C的环境中进行。</li>
 <li>含有或不含LLUF探针采集的唾液蛋白（1.0 μg/μl）均直接进行纳米液相色谱-质谱分析，无需胰蛋白酶消化。蛋白质浓度使用Bio-Rad蛋白质测定法测定12。</li>
</ol>
3. 纳米液相色谱-LTQ 质谱分析
<ol>
 <li>将未消化的唾液样本（5 μl）通过自动进样器直接上样至Eksigent NanoLC系统的捕获柱，使用100%缓冲液A（2%乙腈/0.1%甲酸）。NanoLC系统在线连接Finnigan LTQ质谱仪。</li>
 <li>样本上样并洗涤后，切换阀门，以500 nl/min的流速对捕获柱和分离柱（长度10 cm，内径100 μm，自制填充Synergi 4 μm C18）施加线性梯度洗脱。梯度在45分钟内从0%升至50%缓冲液B（80%乙腈/0.1%甲酸）。</li>
 <li>NanoLC-LTQ MS仪器在Xcalibur软件控制下以数据依赖模式运行。对强度高于1 × 105的四个最强MS离子进行MS/MS谱图采集，启用动态排除功能，碰撞能量设定为35%。</li>
 <li>每个样本均由NanoLC-LTQ MS系统重复运行两次，共使用三个独立制备的样本。在三个独立样本中均可检测到的肽段列于补充表1和表2中。NanoLC-LTQ MS谱图的代表性结果见图3。</li>
</ol>
4. 数据分析与蛋白质数据库搜索
<ol>
 <li>每个 RAW 文件均使用 Readw.exe 转换为 mzXML 文件。</li>
 <li>将mzXML文件输入SEQUEST Sorcerer 2系统，并针对由相应美国国家生物技术信息中心（NCBI）蛋白质数据库生成的人源数据库进行搜索，酶切特异性设为非特异性。母离子的质量容差设为1.5 Da。为考虑甲硫氨酸的氧化修饰，在差异搜索中为其分子质量增加16 Da。</li>
 <li>在 SEQUEST 搜索后，结果由 PeptideProphet 和 ProteinProphet [系统生物学研究所 (ISB)] 自动进行过滤、验证和展示。PeptideProphet 基于肽段的 SEQUEST 评分（Xcorr、ΔCn、Sp、RSp）以及所鉴定的每条肽段序列的附加信息，估算出该肽段指认“正确”与“错误”的综合概率（P 值）。ProteinProphet 则根据指认到 MS/MS 谱图的肽段，计算出每种蛋白质从 0 到 1 的概率评分。</li>
 <li>为尽量减少假阳性鉴定，我们采用了严格的筛选标准。首先，设定可接受肽段的最低 P 值阈值为 0.8，以确保极低的错误率（远低于 3%）并保持合理的高灵敏度。其次，排除所有含有 &gt;0.8 P 分值必须同时具有较高的交叉相关（Xcorr）得分：对于 +1、+2 和 +3 电荷态，分别为 1.9、2.2 和 3.0。</li>
</ol>
5. 使用 LLUF 探针去除口腔细菌
<ol>
 <li>为确定LLUF探针对口腔细菌的清除能力，将使用LLUF探针采集前后（第3节）的唾液样本涂布于琼脂平板上进行细菌检测。</li>
 <li>需氧细菌在无抗生素的LB（Lauria-Bertani）琼脂平板上，于37 °C培养一天。</li>
 <li>厌氧细菌在无抗生素的Brucella肉汤琼脂平板（BD，Sparks，MD）上，使用Gas-Pak（BD Biosciences，San Jose，CA）在厌氧条件下，于37 °C培养一天。</li>
</ol>
6. 代表性结果
1. LLUF探针的制备及在模拟口腔环境中采集唾液
如果采集唾液的过程可以像吮吸棒棒糖一样完成，该方法将避免唾液在收集装置中发生降解13-14。更重要的是，这将使得临床医生能够从口腔局部对患者进行动态监测。此外，如果基于唾液的样本前处理过程能够被简化，临床医生便可更便捷地实施该操作，从而加快下一步临床决策的制定。质谱技术是目前最灵敏的技术之一，可在极短时间内检测甚至测序蛋白质。然而，复杂的样本前处理流程限制了该技术在临床中的应用。此外，已知临床样本中高丰度蛋白或高分子量蛋白（例如唾液中的淀粉酶）会在质谱分析中掩盖低丰度蛋白15-16。为克服上述障碍，我们开发了一种棒棒糖状的超滤装置，称为LLUF探针（图1）。将一片分子截留量为30 kDa的带负电聚醚砜膜（图1A, a）粘附于聚丙烯桨状柄上（图1A, b），并置于LLUF探针前端，用于过滤唾液中的大分子蛋白。为了模拟人口腔环境（图1A, g），将一块海绵（图1A, e）浸入培养皿中的唾液（图1A, f）内。在完全回抽注射器（图1A, d）后，过滤后的唾液开始沿连接管（图1A, c）流动并被收集。
2. 通过纳米液相色谱-线性离子阱质谱鉴定本土唾液肽组
通过比较液相色谱图，我们发现唾液在使用LLUF采样前后的色谱图存在明显差异（图2），表明LLUF采样后唾液中的蛋白质组成发生了变化。为了确定蛋白质组成，我们采用了NanoLC-LTQ质谱分析技术，该技术能够快速对多种蛋白质混合物中的肽段进行测序。更重要的是，为了简化临床应用中的样品制备流程，我们直接将未经化学或酶解处理的全唾液用于NanoLC-LTQ MS分析。出乎意料的是，在未消化的唾液中鉴定出131个肽段（补充表1）。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质、肌动蛋白、α-淀粉酶、α1-珠蛋白、β-珠蛋白、组蛋白1、角蛋白1、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、唾液富酪蛋白以及S100A9。而在经过LLUF探针过滤后的唾液中，共鉴定出26个独特的肽段（补充表2），这些肽段主要来源于各种富含脯氨酸的蛋白质。来源于聚合免疫球蛋白受体（83.24 kDa）和α-淀粉酶等蛋白质的肽段则无法检测到，这证明了LLUF探针具有去除大分子量且高丰度蛋白质的能力。图3A展示了对应于α-淀粉酶内部肽段PFIAIHAEAESKL的MS/MS质谱图。尤为引人注目的是，在去除大分子蛋白质后，LLUF探针采集的唾液中可检测到26个测序肽段中的18个（表1）。这18个肽段来源于富含脯氨酸的蛋白质或假设蛋白质，其C末端为脯氨酸（P）-谷氨酰胺（Q）（-PQ）、-SR、-SP或-PP序列。图3B展示了在LLUF探针采集的唾液中检测到的PQGPPQQGGHPRPP肽段的MS/MS质谱图。该肽段可能来源于富含脯氨酸的蛋白质HaeIII亚家族1和2（表1）。
<img alt="用于液体样品分离的注射器过滤装置；图中已标注各组件。" src="/files/ftp_upload/4108/4108fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. LLUF 探针的组成及从模拟人口腔中采集全唾液。 图示 A：(a) 截留分子量为 30 kDa 的半透性聚醚砜膜；(b) 聚丙烯桨片；(c) 聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管；(d) 20 ml 注射器。图示 B：将一块海绵 (e)（模拟舌体）浸入盛有人类唾液的培养皿 (f) 中，以构建人工口腔环境 (g)。通过完全抽拉注射器产生负压，驱动收集的液体沿连接管路（箭头）进入注射器内的空腔（箭头指示处）。标尺：2.0 cm。
<img alt="显示化合物分析中相对丰度与时间关系的色谱图，两个样本结果。" src="/files/ftp_upload/4108/4108fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 唾液在 LLUF 采样前后的差异性液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）色谱图。 人全唾液中的蛋白质（1.0 μg/μl）在有或无 LLUF 探针的情况下进行过滤。未经过胰蛋白酶消化的蛋白质直接进入 NanoLC-LTQ 质谱仪分析，该质谱仪与 Eksigent Nano LC 系统连接，具体方法见材料与方法部分。图中展示了 LLUF 采样前（A）和采样后（B）唾液的基峰色谱图（保留时间为 44 分钟）。
<img alt="质谱分析、肽段碎裂模式、质荷比、离子丰度、数据分析。" src="/files/ftp_upload/4108/4108fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 通过 NanoLC-LTQ MS 测序检测唾液肽组。 如实验方法所述，使用 NanoLC-LTQ MS 分析了使用 LLUF 探针采集前（A）和采集后（B）的唾液蛋白。未经过胰蛋白酶消化的天然人唾液来源的唾液肽组展示于补充表 1 和 2中。一条来源于α-淀粉酶的肽段（PFIAIHAEAESKL）仅在未使用 LLUF 探针采集的唾液样本中被检测到（A），表明 LLUF 探针对大分子蛋白具有去除能力。许多具有-PQ、-SR、-SP 或-PP 羧基末端的肽段仅存在于经过 LLUF 探针超滤后的样本中。其中一条来源于多种富含脯氨酸蛋白的肽段（PQGPPQQGGHPRPP）如图所示（B）。MS/MS 谱图中特征性的“y”和“b”系列离子确认了这两条肽段的身份。
<img alt="凝胶电泳结果；LLUP处理下的蛋白质分离比较；实验数据。" src="/files/ftp_upload/4108/4108fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 使用LLUF探针去除口腔细菌。LLUF探针的构建方法如“材料与方法”部分所述。将探针置于模拟口腔环境的人类唾液中（图1）。通过回抽LLUF探针末端的注射器产生负压，驱动超滤过程以采集唾液样本。在采样过程中，全唾液选择性地穿过聚醚砜膜并积聚在注射器内。未经LLUF探针采样的全唾液作为对照。分别取LLUF探针采样前后的唾液各10 μl，涂布于琼脂平板上用于细菌检测。图A：将经过（+LLUF）和未经（-LLUF）LLUF探针采样的唾液并排涂布于无抗生素的LB琼脂平板，在37 °C下培养一天。图B：将经过和未经LLUF探针采样的唾液分别涂布于无抗生素的布氏肉汤琼脂平板，在厌氧条件下使用Gas-Pak（BD Biosciences, San Jose, CA）于37 °C培养一天。经LLUF探针采样的唾液涂布的琼脂平板上未见细菌生长，表明LLUF探针能够有效清除需氧及厌氧的口腔细菌。标尺：1.0 cm。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>肽序列/实测肽质量</td>
 <td>登录号</td>
 <td>名称</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ
 2485.3</td>
 <td>gi|41349484</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349482</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|60301553</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>GGHQQGPPPPPPGKPQ 
 1576.9</td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 
 3126.2</td>
 <td>gi|37537692</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族4前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 
 2028.3</td>
 <td>gi|113423660</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 
 2077.8</td>
 <td>gi|113423262</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白异构体5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349482</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|60301553</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|113423663</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349484</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349486</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体3前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 
 2918.5</td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 
 2131.3</td>
 <td>gi|113423660</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 
 2030</td>
 <td>gi|113423663</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349482</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|113423262</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白异构体5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|60301553</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9</td>
 <td>GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 
 1866.6</td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>GPPQQGGHPPPPQGRPQ 
 1713.8</td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>11</td>
 <td>GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 
 2083.1</td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12</td>
 <td>GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 
 2512.6</td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13</td>
 <td>NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 
 2720.2</td>
 <td>gi|113423262</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白异构体5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|113423663</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>14</td>
 <td>PQGPPQQGGHPRPP 
 1450.1</td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15</td>
 <td>QGRPQGPPQQGGHPRPP 
 1791.1</td>
 <td>gi|4826944</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|9945310</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16</td>
 <td>SPPGKPQGPPPQ 
 1186.9</td>
 <td>gi|113423262</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白异构体5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349482</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|60301553</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|113423663</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349484</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349486</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体3前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>17</td>
 <td>SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 
 2720.3</td>
 <td>gi|113423663</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|41349482</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|113423262</td>
 <td>PREDICTED: 假定蛋白异构体5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>gi|60301553</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18</td>
 <td>SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 
 1870.9</td>
 <td>gi|37537692</td>
 <td>富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族4前体</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 肽段仅在LLUF采集的样本中可被检测到。
补充表 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4108/4108table1.xls" target="_blank"> 点击此处查看补充表 1</a>。
补充表 2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4108/4108table2.xls" target="_blank"> 点击此处查看补充表 2</a>。

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<li>Wilmarth, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+liquid+chromatography+study+of+the+human+whole+saliva+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome.</a> J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).</li>
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<li>Lo, C. S., Hughes, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+protease+from+Streptococcus+oralis+C104%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104.</a> Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).</li>
<li>Harrington, D. J., Russell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+two+extracellular+proteases+of+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).</li>
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<li>Linhares, M. C., Kissinger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+monitoring+in+subcutaneous+tissue+using+in+vivo+capillary+ultrafiltration+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes.</a> Pharm Res. 10, 598-602 (1993).</li>
<li>Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intact+proteins+in+mixtures+by+alternated+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+and+LC+ESI+infrared+multiphoton+dissociation+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).</li>
<li>Whitelegge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Sequence+Polymorphisms+and+Post-translational+Modifications+in+Proteins+from+Human+Saliva+using+Top-Down+Fourier-transform+Ion+Cyclotron+Resonance+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).</li>
<li>Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Streptococcus+mutans+to+salivary+proteins+in+caries-free+and+caries-susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Odontol.+Latinoam%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals.</a> Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).</li>
<li>Challacombe, S. J., Sweet, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+immunity+and+HIV+infection%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal immunity and HIV infection: current status.</a> Oral Dis. 8, 55-62 (2002).</li>
<li>Jensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+acidic+proline-rich+proteins+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们发现，人类未消化的唾液中存在大量肽段。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质、肌动蛋白、α-淀粉酶、α1-珠蛋白、β-珠蛋白、组氨肽1、角蛋白1、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、萨瑟肽、S100A9等。产生具有未确定切割位点的肽段可能受多种因素影响。例如，某些肽段可能天然存在于人全唾液中。已鉴定出许多具有-PQ羧基末端的肽段表1以及补充表1和2。富含脯氨酸的蛋白质可分为酸性、碱性或糖基化蛋白质，由位于单一区域的六个基因编码17由等位基因变异、差异性RNA剪接、蛋白水解加工以及翻译后修饰产生的富含脯氨酸的蛋白质有三十多种 17分泌后，酸性富含脯氨酸的蛋白质会迅速附着于牙齿表面，并通过牙菌斑的蛋白水解作用降解为潜在的天然免疫肽 18-19革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表达多种糖苷酶和蛋白酶 18已有报道称，酸性富含脯氨酸的蛋白质可在口腔中被降解为具有潜在类先天免疫活性的肽段 链球菌 和 放线菌属 物种 18谷氨酰胺（Gln）-甘氨酸（Gly）裂解在生物学上具有重要意...

<table><tbody><tr><td>聚醚砜膜</td><td>Pall Corporation</td><td></td><td>30 kDa 截留分子量</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色葡聚糖</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳升液相色谱系统</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 捕获柱</td><td>Agilent</td><td>5065-9913</td><td></td></tr><tr><td>LTQ 线性离子阱质谱仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer 2</td><td>Sage-N Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈-0.1% 甲酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9832-03</td><td>LC/MS 级</td></tr><tr><td>水-0.1% 甲酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9834-03</td><td>LC/MS 级</td></tr></tbody></table>

使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

尽管人类唾液蛋白质组和肽组已被揭示1-2，但这些成分主要来源于唾液蛋白质经胰蛋白酶消化后的鉴定。由于人体唾液中的内源性肽段在疾病诊断、疾病进展预测以及治疗效果监测方面具有潜在价值，因此迫切需要在不使用外源酶预先消化的情况下，直接鉴定人类唾液的内源性肽组。合适的样本采集是提高人类唾液内源性肽组鉴定效果的关键步骤。传统的人类唾液采样方法通常包括离心去除碎片3-4，但该过程可能耗时过长，难以适用于临床实践。此外，通过离心去除碎片可能无法有效清除大多数感染性病原体，也无法去除高丰度蛋白质，而这些高丰度蛋白质常常会阻碍低丰度肽组的鉴定。
传统的蛋白质组学方法主要采用二维凝胶电泳（2-DE）结合胶内消化技术，能够鉴定出多种唾液蛋白质5-6。然而，该方法通常灵敏度不足，难以检测低丰度的肽段或蛋白质。基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的蛋白质组学是一种无需预先进行2-DE分离即可鉴定蛋白质的替代方法。尽管该方法具有更高的灵敏度，但通常需要在分析前对样品进行预分级7以及胰蛋白酶预消化，这限制了其在临床中的应用。
为克服质谱分析中因样品制备带来的障碍，我们开发了一种称为毛细管超滤（capillary ultrafiltration, CUF）探针的技术8-11。实验室数据显示，CUF探针能够以动态且微创的方式从动物体内多种微环境中原位捕获蛋白质8-11。由于在样品采集过程中仅需通过注射器回抽即可产生负压，因此无需离心步骤。CUF探针与液相色谱-质谱联用（LC-MS）已成功鉴定出经胰蛋白酶消化后的蛋白质8-11。在本研究中，我们对超滤采样技术进行了改进，设计出一种棒棒糖状超滤（lollipop-like ultrafiltration, LLUF）探针，可轻松置于人口腔内。无需胰蛋白酶消化的直接LC-MS分析表明，人唾液中天然存在大量来源于多种蛋白质的肽段片段。使用LLUF探针采集唾液样品可避免离心操作，同时有效去除许多分子量较大且丰度较高的蛋白质。质谱分析结果表明，在利用LLUF探针滤除大分子蛋白质后，大量低丰度肽段得以被检测到。低丰度唾液肽段的检测不依赖于多步骤的色谱分离过程。在临床应用方面，LLUF探针结合LC-MS技术未来有望用于通过唾液监测疾病进展。

考虑到唾液取样在未来的临床应用，研制了一种棒棒糖状的超滤（LLUF）探针，以适应人口腔结构。通过NanoLC-LTQ质谱对未经消化的唾液进行直接分析，证明LLUF探针能够去除大分子蛋白和高丰度蛋白，从而使低丰度肽段更易于被检测到。

尽管人类唾液蛋白质组和肽组已被揭示1-2，但这些成分主要来源于唾液蛋白质的胰蛋白酶消化产物。鉴定……

本研究对唾液肽组的分析采用类似棒棒糖的超滤探针，随后进行直接的纳米液相色谱-LTQ质谱分析。首先，使用聚醚砜膜和乙烯丙烯管组装LLUF探针。接着，采集志愿者的唾液样本，并通过LLUF探针处理以获取唾液样品。然后直接进行纳米液相色谱-线性离子阱-质谱分析，对经LLUF探针处理与未经处理的唾液样本数据进行分析。最终，通过分析液相色谱-质谱-质谱数据并比较两组样本中鉴定出的肽段，可获得唾液肽谱。这种将棒棒糖式超滤探针与直接纳米液相色谱-LTQ质谱分析相结合的方法，相较于将唾液蛋白质酶解为肽段等其他方法，具有显著优势。随后进行质谱分析，LUF PRO 可简化并净化唾液，同时增强全唾液中肽段的质谱检测能力，适用于临床应用。使用环氧胶将聚醚类手机膜密封在三角形聚丙烯桨片的边缘上。然后将聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管连接至三角形结构的圆柱形出口。使用聚丙烯桨叶将探针在70%乙醇中浸泡过夜以进行灭菌，并评估密封性；将LLUF探针浸入50毫克/毫升的蓝色葡聚糖溶液中两小时。确认所收集的样品中无蓝色葡聚糖存在。招募20至40岁的健康志愿者。用清水漱口后，让受试者将全唾液样本吐入预冷的冰上容器中。收集所有样本并置于冰上保存。采集后立即携带200微升唾液进入4摄氏度房间，使用LLUF探针对唾液进行取样。将聚醚细胞膜放入培养皿中的人类唾液中浸润。通过抽吸注射器产生负压，模拟从唾液中进行超滤取样的过程。接下来，测定蛋白质浓度。为进行纳米液相色谱-质谱分析，将唾液蛋白质样品配制成每微升含一微克蛋白质的溶液。在样品分析过程中，我们使用一台Exigent纳米液相色谱系统，该系统在线连接Finnegan LTQ质谱仪。首先，通过自动进样器将五微升未消化的唾液样品加载至纳米液相色谱系统的捕获柱上。洗涤步骤后，切换阀门，向捕获柱和C18分离柱输送0至50%的缓冲液B线性梯度。使用Excalibur的数据依赖模式，采集强度高于1×10⁴的四个最强MS离子的二级质谱（ms/ms）谱图。对每个样品，进行三次独立制备的重复测定，每次制备均做两次重复运行。然后将数据文件导入 Sequester Sorcerer Two 系统，选择针对适当的 NCBI 人类蛋白质数据库进行搜索，并使用非酶特异性条件。Sequester 搜索完成后，结果将自动过滤、验证，并在 Peptide Prophet 和 Protein Prophet 中基于 Sequester 的结果进行展示。Peptide Prophet 会估算每条肽段鉴定结果为正确或错误的综合概率 P 值评分，同时提供每条肽段序列的附加信息。蛋白质置信度基于分配给质谱图的肽段，为每种蛋白质计算一个从0到1的概率评分。本部分旨在评估LLUF探针清除口腔细菌的能力，以用于细菌检测培养；通过在螺旋平板上对采集LLUF探针前后获取的唾液样本进行需氧菌检测。需氧菌培养使用无抗生素的LB螺旋平板，在37摄氏度下培养一天；厌氧菌培养则需使用气体发生包进行培养。将样本在布鲁氏肉汤中，于37摄氏度厌氧条件下，在螺旋平板上培养一天。棒棒糖状的超滤装置有助于在模拟口腔环境中采集唾液样本。在该系统中，将分子截留量为30千道尔顿的带负电荷聚醚砜膜粘附于聚丙烯桨片上，并置于LLUF探头前方，以滤除唾液中较大的蛋白质。为了模拟人口腔环境，使用注射器将海绵浸透唾液。唾液通过连接的导管进行过滤并收集。通过比较唾液在使用LLUF取样前后的液相色谱图，结合纳米液相色谱-串联质谱技术，鉴定了唾液中的内源性肽段。由于这些差异色谱图无需化学或酶解消化即可获得，因此简化了临床用途的样品制备流程。在此样品中，LLUF解析出不同的蛋白质组成，并在未消化的唾液中鉴定出131种肽段。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质，包括肌动蛋白、α-淀粉酶、α-珠蛋白、β-珠蛋白、组蛋白、角蛋白、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及S100A9。经过LLUF探针筛选后，在唾液中鉴定出26种独特肽段，主要为各种富含脯氨酸蛋白质的片段。这种源自α-淀粉酶的肽段仅在未使用LLUF探针采集的唾液样本中被检测到，说明了LLUF探针在去除大分子蛋白质方面的有效性。最引人注目的是，在去除大分子蛋白质后，使用LLUF探针采集的唾液样本中可检测到多个序列肽段，尤其是经过超滤LLUF探针处理后的样本中鉴定出了富含脯氨酸C末端的肽段。现在，您应该已充分了解如何使用A-L-L-L-L-U-F PRO对唾液进行简单处理以用于质谱分析。在一致的条件下收集和采集简单的唾液样本对于更佳的分析至关重要。一旦掌握，我相信该技术可在三小时内正确完成。这种采用类似棒棒糖的超滤探针结合直接纳米液相色谱-串联质谱分析的方法，有助于生物标志物在人类疾病诊断中的临床应用。

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Research

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Medicine

医学

采样使用超探头棒棒糖样的土著人的唾液多肽：简化和增强肽的临床质谱检测

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

本文介绍了一种对人脑脊液（CSF）中内源性肽进行质谱分析的方法。通过采用分子量截断过滤、色谱预分离、质谱分析以及后续多种肽段鉴定策略的组合，与以往研究相比，已知的脑脊液肽组规模几乎扩展了十倍。...

人脑脊液中内肽组学分析的样品制备

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本文介绍了基于常压质谱技术的一种独特实时分析方法的样品制备步骤。该方法使我们能够在无需任何特殊预处理的情况下，对生物分子进行实时的活体分析。...

探针电喷雾电离质谱分析的样品制备

本方案涵盖了利用液相色谱-质谱联用技术，并结合高级特征提取和生物信息学分析软件，对肽聚糖组成进行的详细分析。...

利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

本文介绍了一种经过优化的滤膜上消化方案，并详细说明了以下步骤：蛋白质消化、肽段纯化以及数据非依赖性采集分析。该策略应用于表达性前列腺分泌物——尿液样本的分析，可实现尿液蛋白质组的高覆盖度和低缺失值的无标记定量分析。...

通过FASP消化和数据非依赖性分析获得的EPS尿液蛋白质组谱

一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

本文介绍了一种从干血清样本中检测低丰度生物标志物的实验方案，以胃泌素释放肽前体（ProGRP）这一生物标志物为例。采用抗体包被的磁珠对特征性ProGRP肽段进行选择性纯化与富集，捕获的肽段随后通过液相色谱-串联质谱法进行分析。...

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

本文提供了一种详细的方案，用于清洗和重复使用聚碳酸酯超速离心管，以进行适用于蛋白质组学实验的细胞外囊泡分离。...

聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用

本文展示了一种创新的视觉方法（摄影发声法或照片引谈法），旨在为患有慢性疾病的患者在临床诊疗中实现公平的诊疗流程，揭示临床知识中的空白，建立更佳的治疗关系，并确定以患者为中心的治疗目标及促进康复的可能性。...

运用视觉与叙事方法实现临床医疗中的公平诊疗流程

了解棒棒糖状超滤探针采集唾液多肽的方法，用于临床质谱检测。该技术通过NanoLC-LTQ质谱直接分析，有效去除高丰度蛋白，提升低丰度肽段检测灵敏度，简化样本前处理流程。

使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

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