基于DNA载体的RNA干扰在癌症研究基因功能
June 4th, 2012
RNA干扰（RNAi）拥有超过基因敲除的许多优点，在基因功能研究的工具已被广泛使用。基于DNA载体的RNAi技术的发明，已作出长期和诱导基因敲除可能，也增加了基因沉默的可行性在体内。
该程序的总体目标是通过使用基于 DNA 载体的 RNA 干扰来确定基因功能。这是通过首先设计和生成靶向特定基因的 S-H-R-N-A 构建体来实现的。第二步是生产携带 SH RNA 表达盒的慢病毒。
然后通过用慢病毒感染细胞来产生稳定的细胞系，并且用慢病毒感染的细胞用于各种体外和体内测定，以确定沉默目标基因的效果。最终，根据所使用的检测方法，结果可以通过使用体外增殖、迁移和侵袭检测以及体内异种移植物形成模型来显示基因敲低导致细胞肿瘤致病性的变化。演示该程序的是 Daniel Stowell，马 Juan，Daniel 是我实验室的研究生，马 马 是一名技术员。
Chang 是一名博士后研究员。这种方法可以帮助回答癌症研究领域的关键问题，例如特定基因是否在癌症发展和进展中发挥作用，以及它对这些过程的哪些方面可能很重要。首先，根据所述标准 Anil 对寡核苷酸进行设计和排序，将两个反向互补寡核苷酸（在靶基因中包含 20 至 23 个核苷酸的靶序列）确定。
他们将在两端形成 eco R one 和 Hindi three 站点。跪下后，另一个寡核苷酸包含与目标序列及其三个引物末端相反的互补序列。Neils 到带有上游引物的 H 1 或 U 6 启动子的三个主要末端。
使用 PCR 制备两端各具有 BAM H 1 位点和 Hindi 3 位点的片段。同时消化慢病毒载体和 PCR 片段。然后在载体、PCR 片段和 Anil 寡核苷酸之间进行三片段连接反应。
在 1 比 10 到 10 的摩尔比下，所得载体将产生感兴趣的 HRNA，并在环区域中具有印地语 3 序列。如果使用诱导型载体，HRNA 的产生将取决于诱导剂分子（如 Tet on 系统的多西环素）的存在。现在使用连接产物转化高效、感受态的大肠杆菌 DH 5 α 细胞，并使用基于集落的 PCR 筛选鉴定阳性载体。
扩增跨越载体和诱导型启动子连接位点的产物。使用市售试剂盒从阳性菌落中制备血浆 DNA。然后通过 BAM H one 和 ECO R one 消化以及 DNA 琼脂糖电泳确认插入片段的存在。
此外，使用 LIGA 核苷酸 P 5 对包含启动子和 S-H-R-N-A 的区域进行测序。使用不含内毒素的 MIDI 或 maxi 制备试剂盒，制备携带 HRNA 表达盒的慢病毒 DNA。通过测量 260 纳米处的光吸收来确定 DNA 浓度，并通过检查 260 至 280 纳米的光吸收比是否在 1.8 至 2.0 之间来确保 DN a 的纯度。
最后，在气凝胶上运行慢病毒质粒，确保其 S 卷曲。转染前，首先将 0.9 mL 溶液 A 缓慢滴入 0.9 mL 溶液 B 中，同时用移液管在溶液 B 中鼓泡空气，以准备转染。然后将混合物在室温下孵育 30 分钟。接下来，将 0.6 毫升混合物缓慢滴入三个不同的 10 厘米板上，并带有 HEK 2 93 T 细胞。
然后在 4 到 6 小时后将细胞放回培养箱中。用 7 毫升完整的 DMEM 培养基替换培养基。24 小时后，再加入 5 毫升培养基，再过 24 小时后，收获含有慢病毒的培养基。
在室温下以 1500 RPM 的速度旋转收获的培养基 10 分钟。使用 0.45 微米过滤器过滤上清液。通过超速离心使流过含有慢病毒的培养基。
将上清液倒入含有 5% 漂白剂的废液容器中。将慢病毒沉淀重悬于半至一毫升冷的 XPBS 中。然后将慢病毒溶液分成 50 至 100 微升等分试样，在零下 80 摄氏度下储存。
最后，使用可靠的技术确定慢病毒的滴度。通常，在进行细胞感染之前，一个 10 厘米的培养皿将产生 50 到 1 亿个感染单位。对于此过程，使用试剂盒或 R-T-P-C-R 确定慢病毒滴度的 MOI。
建议 MOI 低于 4。首先将要感染的细胞接种在六孔板中，以达到 30% 至 40% 的 co fluency，然后培养过夜。第二天。
用 1 毫升新鲜的含有 poly brain 或鱼精蛋白的培养基替换培养基。然后添加 1 到 200 万 IU。含有荧光或抗生素标记物的慢病毒。
缓慢摇动板 10 秒钟，混合并孵育 6 小时。6 小时后，用正常完全培养基替换培养基，并将细胞增殖 2 天。培养基不应含有抗生素或诱导剂，无论两天后使用哪种慢病毒。
如果慢病毒含有抗生素标志物，则添加适当的抗生素。同样，如果慢病毒是可诱导的，则向一半的培养物中加入诱导剂。用抗生素和诱导剂再培养细胞两到三天后，进行蛋白质印迹血液分析，以在异种移植胰蛋白酶眼之前测试靶基因的敲低。
来自大细胞培养皿的细胞，并将它们重悬于含有 50% 基质胶的原始培养基中。必须保持癌细胞重悬并置于 50% 基质胶和冰上的注射器中。否则，基质胶有凝固的风险，感染将不得不对其进行 AB 处理。
用 70% 乙醇彻底清洁手术部位，准备手术部位，并以良好的通风和连接到诱导室的 isof 氟清除剂过滤器进行麻醉。在细胞接种前 3 至 5 分钟，使用 2% isof 氟与 1.5% 氧混合麻醉胸腺裸鼠。然后通过鼻锥使用 2%isof 氟与氧气混合维持麻醉。
将鼠标放在设置为 30 摄氏度的加热垫上。将细胞装入带有 25 号半号针头的注射器中，用于皮下注射，或 28 至 30 号针头用于原位注射。在一个或两个部位诱导麻醉后 5 分钟，在 200 微升推注中注射 1 至 1000 万个细胞。
细胞数量取决于癌细胞的恶性或侵袭性。对于组成型活性载体，利用两组小鼠注射细胞，这些细胞表达靶基因 S-H-R-N-A 或载体上加扰的 S-H-R-N-A 强化。使用相同的两组，并将它们分别分为子组，这些子组是或不提供的。
每周更换两次含水的 docs。每周或每两周用 C 监测肿瘤体积，确保肿瘤体积不超过机构或 A CUC 限制，并对任何显示广泛溃疡、坏死、明显感染、不受控制的出血或终末期疾病的动物实施安乐死。为了通过生物发光标记物监测肿瘤生长和转移，对工作区域进行消毒，并在成像室中用气体麻醉麻醉小鼠。
首先，进行 2 到 5 分钟的曝光并检查信号强度，然后进行相应调整。如果肿瘤大小超过 1000 立方毫米或机构大小限制，请在处死时对动物实施安乐死，记录肿瘤大小并保留它们以供进一步分析。该方案用于研究为什么 Y one 敲低对植入胸腺裸鼠体内表达荧光素酶的人乳腺癌细胞的异种移植肿瘤形成的影响。
测试了人类 YY 1 的 S-H-R-N-A 靶序列和加扰对照 S-H-R-N-A，它们与任何已知的人类转录本都没有显着相似性。结果，构建了两个慢病毒载体并用于生产两个慢病毒。两者都用于感染两种不同的细胞群，并获得多克隆细胞群。
pur 霉素选择后。蛋白质血液分析证实 DS 在这些感染细胞系中诱导了 YY 1 敲低。接下来，用诱导型 YY 一 S-H-R-N-A 感染的克隆 3 的多克隆细胞群和对照。S-H-R-N-A.
慢病毒用于测试 YY 1 耗竭对侵袭的影响。我们观察到 YY 1 耗竭降低了细胞的侵袭性。蛋白质血液分析证实 docs 在含有 indu YY one S-H-R-N-A 的细胞中诱导 YY one 沉默，而含有对照的细胞。
S-H-R-N-A 没有显示这种效果。然后将这些细胞用于异种移植小鼠模型研究，与对照组 indu、YY ONE S-H-R-N-A 植入的小鼠相比，当通过生物发光观察和按预期测量肿瘤重量时，肿瘤形成显着减少。YY 在这些异种移植肿瘤中沉默很容易通过 western blot 证实。
研究 不要忘记，根据 NIHB 安全考虑，使用慢病毒载体进行研究可能非常危险 所有实验室设置都需要增强 B 级安全 2 级遏制程序。
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概述
本文讨论了使用基于DNA载体的RNA干扰（RNAi）来确定基因功能的方法。该方法允许长期和可诱导的基因敲低，促进体内基因沉默。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因功能研究
- RNA干扰技术
- 体内基因沉默
背景
- RNA干扰是基因功能分析的强大工具。
- 基于DNA载体的RNAi增强了基因敲低的可行性。
- 长期基因沉默对于研究基因功能至关重要。
- 体内应用提供了对生物过程的洞察。
研究目的
- 设计并生成靶向特定基因的S-H-R-N-A构建体。
- 生产携带SH RNA表达盒的慢病毒。
- 创建用于功能测定的稳定细胞系。
使用的方法
- 设计用于基因靶向的S-H-R-N-A构建体。
- 生产传递SH RNA构建体的慢病毒。
- 用慢病毒感染细胞以建立稳定细胞系。
- 进行体外和体内测定以评估基因敲低效果。
主要结果
- 测定显示基因敲低导致肿瘤发生能力的变化。
- 利用了体外增殖、迁移和侵袭测定。
- 体内异种移植形成模型显示了显著结果。
- 稳定细胞系有效促进了基因功能研究。
结论
- 基于DNA载体的RNAi是基因功能研究的有价值方法。
- 该方法允许长期和可诱导的基因敲低。
- 结果有助于理解在各种生物学背景下的基因功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
DNA vector-based RNA interference (RNAi) enables precise, long-term, and inducible gene silencing in cancer models, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery pipelines. This approach facilitates functional interrogation of candidate oncogenes and supports translational continuity from in vitro assays to in vivo xenograft models. Its adaptability and efficiency make it a strategic asset for portfolio triage and early-stage decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes implicated in cancer progression.
- Supports mechanistic de-risking by allowing inducible and reversible gene knockdown.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene roles in tumorigenicity and metastasis.
- Provides a platform for rapid assessment of gene function across multiple cell lines.
Screening & Assay Development
- Generates stable cell lines with defined gene knockdown for reproducible phenotypic assays.
- Standardizes assay conditions using inducible or constitutive shRNA expression systems.
- Enables quantitative readouts in proliferation, migration, and invasion assays.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro gene silencing with in vivo xenograft models for translational relevance.
- Supports biomarker-driven studies by enabling controlled modulation of gene expression.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on functional tumorigenicity data.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in oncology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA vector-based RNAi method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in cancer research.
- Discovery Biology: Enables targeted hypothesis testing and pathway clarification by silencing specific genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing gene knockdown effects in cell-based assays.
- Analytics: Delivers measurable phenotypic changes and statistical outputs for robust data interpretation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo tumor models for enhanced predictive value.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for gene function studies across diverse oncology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes gene silencing workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, lentiviral production, and cell culture techniques.
- Needs access to biosafety level 2 facilities and animal care infrastructure for in vivo studies.
- Demands rigorous cross-team standardization for construct design and assay execution.
- Adaptable to various cell lines and compatible with multiple selection markers.
- Subject to institutional biosafety and animal care committee approvals for compliance.
