基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

本实验的总体目标是通过基于DNA载体的RNA干扰技术来确定基因功能。首先设计并构建靶向特定基因的S-H-R-N-A载体，随后产生携带SH RNA表达盒的慢病毒，以此实现研究目的。

随后，通过用慢病毒感染细胞来建立稳定的细胞系，并将感染了慢病毒的细胞用于多种体外和体内实验，以评估目的基因沉默的效果。最终，根据所采用的实验方法，结果可显示由于基因敲低，通过体外增殖、迁移和侵袭实验以及体内异种移植成瘤模型，细胞肿瘤发生能力的变化。本实验操作将由 Daniel Stowell、Juan Ma 演示，其中 Daniel 是我实验室的研究生，Ma 是技术员。

Chang 是一名博士后研究员。该方法有助于解答癌症研究领域中的关键问题，例如特定基因是否在癌症的发生和发展中发挥作用，以及其在这些过程中的哪些方面可能具有重要性。首先，根据所述标准设计并订购寡核苷酸，即针对目标基因中20至23个核苷酸靶序列的两条反向互补寡核苷酸。

它们将在两端形成 eco R I 位点和 Hind III 位点。经过退火后，另一条寡核苷酸链包含与目标序列互补的反向序列，并在其 3' 端与 H1 或 U6 启动子的 3' 端通过上游引物进行连接。

使用PCR扩增出一个在两端分别含有BAM H I和Hind III酶切位点的片段。同时，对慢病毒载体和PCR片段进行酶切消化。然后，在载体、PCR片段和Anil寡核苷酸之间进行三片段连接反应。

以1:10至10的摩尔比进行反应时，所获得的载体将在发夹环区域含有Hindi三序列，从而产生目标HRNA。若使用诱导型载体，则HRNA的表达将依赖于诱导分子的存在，例如Tet-on系统中的强力霉素（doxycycline）。接下来，利用连接产物转化高效的感受态大肠杆菌DH5α细胞，并通过基于菌落的PCR筛选方法鉴定阳性载体。

扩增跨越载体和诱导型启动子连接位点的产物。使用 commercial kit 从阳性菌落中制备质粒 DNA。然后通过 BAM H one 和 ECO R one 酶切及 DNA 琼脂糖凝胶电泳确认插入片段的存在。

此外，使用 LIGA 核苷酸 P 五对包含启动子和 S-H-R-N-A 的区域进行测序。使用无内毒素 MIDI 或大提纯试剂盒，制备携带 HRNA 表达盒的慢病毒 DNA。通过测量 260 纳米处的光吸收来确定 DNA 浓度，并通过检测 260 与 280 纳米光吸收比值是否在 1.8 至 2.0 之间来确保 DNA 的纯度。

最后，将慢病毒质粒在琼脂糖凝胶上进行电泳，以确认其为超螺旋状态。转染前，先通过移液管向溶液B中缓慢滴加0.9毫升溶液A，同时用移液管向溶液B中通入空气起泡。然后将混合物在室温下孵育30分钟。接着，将0.6毫升该混合物缓慢滴加到三个分别含有HEK 293T细胞的10厘米培养皿中。

4至6小时后将细胞放回培养箱。更换为7毫升完全DMEM培养基。24小时后，再加入5毫升培养基，再过24小时后，收集含有慢病毒的培养上清。

将收集的培养基在室温下以1500 RPM离心10分钟。使用0.45微米滤器过滤上清液。通过超速离心对含有慢病毒的滤过培养基进行离心。

将上清液倒入含有5%次氯酸钠的废液容器中。用0.5至1毫升的冷的1×PBS重悬慢病毒沉淀。然后将慢病毒溶液分装为每份50至100微升，于-80摄氏度保存。

最后，使用一种可靠的技术测定慢病毒的滴度。通常，在进行细胞感染之前，一个10厘米的培养皿可产生5000万至1亿个感染单位。可使用试剂盒或逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）来确定慢病毒滴度的感染复数（MOI）。

建议使用低于4的感染复数（MOI）。首先将待感染的细胞以30%至40%的融合度接种于六孔板中，并培养过夜。第二天。

加入一毫升新鲜培养基，其中含有聚脑或鱼精蛋白。然后加入一百万至两百万 IU 含有荧光标记或抗生素抗性标记的慢病毒。

轻轻振荡培养板10秒以混匀，然后孵育6小时。6小时后，将培养基更换为正常的完全培养基，并继续培养细胞2天。无论使用何种慢病毒，2天后培养基中均不应含有抗生素或诱导剂。

如果慢病毒含有抗生素标记，则加入相应的抗生素。同样，如果慢病毒具有可诱导性，则向一半的培养物中加入诱导剂。在含抗生素和诱导剂的条件下继续培养细胞两到三天后，进行蛋白质印迹分析，以在异种移植胰蛋白酶眼实验前检测目的基因的敲低效果。

从大尺寸细胞培养皿中收集细胞，并将其重悬于含有50% Matrigel的原始培养基中。必须始终保持癌细胞在50% Matrigel中处于悬浮状态，并将注射器置于冰上。否则，Matrigel可能凝固，导致接种失败。

用70%乙醇彻底清洁手术部位，并在诱导室连接良好通风装置和异氟烷废气过滤器后实施麻醉。在细胞接种前3至5分钟，使用2%异氟烷与1.5%氧气混合气体对胸腺裸鼠进行麻醉。随后通过鼻罩持续给予2%异氟烷与氧气混合气体以维持麻醉状态。

将小鼠置于设定为30摄氏度的加热垫上。使用25½号针头的注射器装载细胞，用于皮下注射；或使用28至30号针头的注射器，用于原位注射。在麻醉诱导后5分钟，在一个或两个位点以200微升的体积注射1×10⁶至1×10⁷个细胞。

细胞数量取决于癌细胞的恶性程度或侵袭性。对于组成型表达载体，使用两组小鼠，分别注射表达目标基因 S-H-R-N-A 或乱序 S-H-R-N-A 对照的细胞。对相同的两组小鼠，再各自分为接受或不接受饮水中添加诱导剂的亚组。

每周更换两次装有水的笼盒。使用卡尺每周或每两周监测一次肿瘤体积，确保肿瘤体积不超过机构或动物护理与使用委员会（A CUC）规定的限值，对出现广泛性溃疡、坏死、明显感染、无法控制的出血或终末期病症的动物实施安乐死。为通过生物发光标记监测肿瘤生长和转移情况，需先对工作区域进行消毒，然后将小鼠置于成像舱内，使用气体麻醉剂进行麻醉。

首先，进行两到五分钟的曝光，检查信号强度，并据此进行调整。如果肿瘤体积超过1000立方毫米或达到机构规定的尺寸上限，则在处死动物时记录肿瘤大小，并保留样本以供进一步分析。本方案用于研究Y基因1敲低对表达荧光素酶的人乳腺腺癌细胞在裸鼠体内异种移植成瘤的影响。

对人源YY1的S-H-R-N-A靶序列和一个随机对照S-H-R-N-A序列（该序列与任何已知的人类转录本均无显著相似性）进行了测试。结果构建了两种慢病毒载体，并用于产生两种慢病毒。这两种病毒分别用于感染两种不同的细胞群体，获得了多克隆细胞群体。

嘌呤霉素筛选后，Western印迹分析证实，在这些感染的细胞系中，DS诱导了YY1基因的敲低。接下来，对感染了可诱导型YY1 shRNA以及对照shRNA的3号克隆的多克隆细胞群体进行分析。

使用慢病毒测试 YY1 耗竭对细胞侵袭能力的影响。我们观察到，YY1 耗竭降低了细胞的侵袭性。Western blot 分析证实，携带诱导型 YY1 shRNA 的细胞中，药物诱导了 YY1 的沉默，而对照组细胞则无此现象。

S-H-R-N-A 未表现出此效应。随后将这些细胞用于异种移植小鼠模型研究，并与对照组进行比较。与对照组相比，携带 YY1 S-H-R-N-A 的小鼠在供给含水的药物后，通过生物发光成像观察到肿瘤形成显著减少，且肿瘤重量测量结果也显著降低，符合预期。通过蛋白质印迹法可轻松证实这些异种移植肿瘤中 YY1 的沉默效果。

请注意，根据美国国家卫生研究院（NIHB）对慢病毒载体研究的安全考量，使用慢病毒可能具有极高的危险性，因此在所有实验室环境中均需采用增强的生物安全二级防护措施。