从小鼠胚胎神经管的神经嵴细胞的分离和培养
June 2nd, 2012
胚胎神经嵴的神经管分离，便于使用在体外学习迁移，自我更新和多能神经嵴的方法。
留出三个小时来执行此协议。一旦您有经验，该协议应该需要一个半小时到两个小时才能完成，具体取决于解剖的胚胎数量。该协议描述了如何在皮质胚胎后 9.5 天在耳中段斑块代码处进行切割，并且可能 4 天以分离含有迷走神经管的组织。切削。
因此，螨虫 16 和 22 将分离出包含躯干神经管的组织。迷走神经嵴从迷走神经管迁移。当躯干神经嵴从躯干神经管迁移时，解剖的组织将在胶原酶不良溶液中被酶消化，空间清洗，非神经表皮和中胚层将被解剖掉。
分离的神经管将再洗涤两次，然后接种在自我更新的培养基中。我是范德堡大学 Bosky 实验室的 Elise Graph。今天，我将演示如何在解释培养中将神经嵴与神经管分离。
该技术将使您能够在体外研究神经嵴的特征。让我们开始吧。首先将 100 微升 1 毫克/密耳纤连蛋白稀释到 3.2 毫升无菌 DPBS 中。
放置足够的 30 μg/mL 纤连蛋白溶液，以覆盖四孔板的每个孔的底部。轻轻敲击四孔板的角，确保每个孔都均匀覆盖。在制作和过滤介质时，让板放在一边。
盘子应静置至少 15 分钟。收集以下试剂以制备培养基。培养基在使用前在新鲜的生物安全柜中配制而成。
请务必始终使用无菌技术。从四孔培养皿中取出纤维 nin，并在揭罩背面盖上盖子晾干。纤维 nin 干燥大约需要 15 分钟。
板干燥后，向每个板中加入 500 微升自更新培养基。在开始解剖之前，将 37 度的板放入加湿的 5% 二氧化碳培养箱中，将 50 微升胶原酶椎间盘空间混合到 5 毫升 DPBS 中。确保添加所有胶原酶 dispa 以确保有效消化。
使用 0.2 微米注射器过滤器将胶原酶 dispa 溶液过滤到 12 孔板的三个孔中。每个孔应接收 5 毫升溶液的三分之一，将大约 1 毫升的洗涤培养基移液到其余每个孔中。将板放在冰上，直到您准备好消化分离的组织。
接下来，用无菌剃须刀片将 P 20 移液器吸头从斜面边缘正下方切下。将尖端浸入洗涤介质中，以便胚胎和分离的组织碎片。在溶液之间转移时，不要粘在尖端上。
对定时交配的 P 1000 的尖端执行相同的作。从膜中取出子宫。在无菌 DPBS 中完成解剖。
使用任何方法（例如热灭菌）对解剖工具进行灭菌。如果 DPBS 变得浑浊，则将具有临界值 P 1000 的胚胎移动到新鲜的无菌 DPBS 培养皿中，从切割组织开始。轻轻地将子宫组织从蜕膜上梳理开。
接下来，轻轻地从蜕膜内取出胚胎。胚胎的位置在这里用卡通表示。分离 9.5 天后胚胎后，用胰岛素针轻轻取出卵黄袋。
如果基因分型是实验方案的必要部分，请在干净、无菌的 DPBS 中清洗卵黄袋和任何剩余的胚胎组织。将组织放入 1.5 毫升试管中，并将试管储存在负 80 摄氏度，直到准备好分离 DNA。让自己适应胚胎的解剖结构。
您将在 SOMITES four 16 和 22 中剪切中间的 OTIC PLA 代码。您需要调整显微镜的焦距 为了计数体节。在中间的 Otic PLA 代码处进行第一次切割。
像使用剪刀刀片一样使用针头，而不会损坏神经管的其余部分。在四螨之后进行第二次切割。接下来切到 15 号螨虫，紧接着切。
在 so mite 22 之后或最后一次，所以 mite 进行最终剪辑。如果胚胎发育较早。该组织包含躯干神经管，以分离包含迷走神经管的组织。
将心脏从耳中平台和第四螨之间的组织切开。注意分离组织块之间的大小差异。包含迷走神经管的那一块比另一块宽。
这种物理区别允许您将这两个部分一起处理。使用截止 P 20 将神经管转移到胶原酶 dis 空间。可以保留剩余的组织进行基因分型。
如前所述，将分离的组织碎片放入胶原酶分散空间的孔之一中。现在在室温下。静置 10 分钟。
在 10 分钟的孵化过程中，您可以开始解剖 Next 胚胎。10 分钟后，从胶原酶 dis 空间中取出分离的组织，在洗涤介质中上下吹打洗涤，将消化的组织放入 DPBS 中。这就是消化后组织应该是什么样子。
下一步涉及去除非神经真皮和中胚层。首先，将非神经真皮从神经管中抬起。接下来，可以从神经管中取出中胚层。
为了演示非神经真皮和中胚层的去除，我们将重点介绍迷走神经管。躯干神经管也可以完成相同的过程。首先用一根针按住非神经组织。
用另一个轻轻去除非神经真皮。接下来，轻轻去除与神经管相邻的体节，以去除任何非神经组织的残留物。使用截止的 P 20 移液器吸头轻轻迭代。
用洗涤介质洗涤神经管两次。将神经管放入自我更新培养基中，然后接种到准备好的 4 个培养基中。嗯，碟子。
将四孔板放入缺氧室中。确保腔室已密封。连接氧气分析仪并打开混合气体的来源。
使用 1% 氧气、6% 二氧化碳和 93% 氮气的混合物。为缺氧室充电，直到氧气量为 3%。关闭混合气体，将缺氧室置于 37 摄氏度。
24 小时后。看看神经管解释。神经嵴细胞应从用实线勾勒的神经管中迁移出来，以防止被用胰岛素针在神经管外部切割的非神经嵴组织污染。
接下来，从解释中取出神经管和任何剩余的非神经嵴细胞。用新鲜的自我更新培养基更换培养基，并将板放回缺氧室。充电并将其置于 37 摄氏度。
培养 24 小时后，神经嵴将从神经管中移出。生长的范围用虚线表示。箭头突出显示的神经嵴生长物纯度约为 96%，细胞表达 P 75、SOX 10 和 Fox D 3。
可以用这些培养的嵴细胞进行的实验包括但不限于以下内容。有时，如果发生这种情况，不太理想的培养物将无法产生有效的生长物。仔细检查缺氧条件、纤连蛋白浓度以及组织在胶原酶 DYS Space 中消化的时间 今天我已经演示了从神经管培养神经嵴的基础知识。
祝你的实验好运。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本协议概述了从神经管中分离胚胎神经嵴的方法，从而能够在体外研究迁移、自我更新和多能性。该程序专注于解剖9.5天皮质后胚胎的组织，以研究迷走神经和干神经嵴。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 神经嵴细胞对于各种发育过程至关重要。
- 了解它们的行为可以提供对发育障碍的洞察。
- 该协议促进了神经嵴迁移和分化的研究。
- 胚胎神经嵴分离对于体外实验至关重要。
研究目的
- 分离神经嵴细胞进行详细研究。
- 研究迁移和自我更新的机制。
- 探索神经嵴细胞的多能性。
使用的方法
- 在特定发育阶段解剖胚胎。
- 对解剖组织进行酶解。
- 分离迷走神经和干神经嵴细胞。
- 体外培养技术用于研究细胞行为。
主要结果
- 成功从胚胎中分离出神经嵴细胞。
- 展示了迷走神经和干神经嵴的迁移模式。
- 建立了研究自我更新和多能性的协议。
- 为未来神经嵴生物学研究提供了基础。
结论
- 该协议对于分离神经嵴细胞是有效的。
- 体外方法可以阐明神经嵴细胞的行为。
- 进一步的研究可以加深对发育过程的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube enables high-purity, feeder-free access to multipotent progenitors for early discovery and mechanistic de-risking. This protocol supports predictive confidence in developmental biology and neurobiology pipelines by providing a robust in vitro system for functional target validation and genetic manipulation studies. The approach is broadly applicable across mouse genetic backgrounds, facilitating portfolio-wide translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neural crest multipotency and lineage specification in a controlled environment.
- Supports functional validation of genetic targets through manipulation and phenotypic assessment.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating premigratory neural crest populations with preserved migratory properties.
- Provides a platform for comparative studies across wild-type and mutant backgrounds.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, feeder-free system for quantitative analysis of neural crest cell behaviors.
- Ensures reproducibility and standardization by yielding approximately 96% pure neural crest populations.
- Enables scalable preparation of cells for downstream compound screening or functional assays.
- Supports reliable evaluation of migration, proliferation, and differentiation endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying neural crest-derived pathologies and developmental disorders.
- Maintains continuity from genetic manipulation to phenotypic readout in preclinical settings.
- Provides a foundation for risk-adjusted advancement of neural crest-targeted therapeutics.
- Enables exploration of translational biomarkers in neural crest biology when supported by downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions neural crest cell isolation at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of neural crest function, migration, and differentiation.
- Screening: Provides assay-ready, high-purity cell populations for reproducible screening and quantitative analysis.
- Analytics: Enables measurement of migration, marker expression, and lineage outcomes for comparative analytics.
- Translational Research: Supports continuity from genetic manipulation to disease-relevant phenotypes in vitro.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to diverse genetic models and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural crest research.
- Operational Value: Streamlines isolation without FACS or feeder layers, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust target validation and functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neural crest-related programs and genetic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and neural tube anatomy.
- Needs access to hypoxic culture infrastructure and validated marker analysis tools.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to various mouse genetic backgrounds for broad research applicability.
- Limitations include removal from embryonic context, potentially affecting in vivo relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Introduction
1:36
Prepare Plates
2:18
Preparation of Self Renewal and Wash Media
3:06
Preparation of Collagenase/Dispase
4:22
Isolating Vagal and Trunk Neural Tube
11:46
Representative Results
12:35
Conclusions
8:21
Removal of Non-Neural Ectoderm and Mesoderm
11:06
Removal of the Neural Tube
