培养成年的背根神经节神经元轴突再生的遗传研究
2012年8月17日
一个在体外
该程序的总体目标是建立一个体外模型，用于使用成人背根神经节神经元或 DRG 神经元研究哺乳动物轴突再生。这是通过首先从成年小鼠中解剖出 DRG，然后将其解离成单个细胞来实现的。然后通过电穿孔转染解离的神经元并培养几天，以遗传作其基因表达。
最后一步是重悬和充气神经元以进行额外的过夜培养。最终，基于显微镜的轴突长度分析用于研究遗传纵神经元的轴突再生。该技术中使用的细胞复苏悬液和重复步骤的主要优点是它允许分析已经经过基因作的神经元的轴突生长。
该技术对于功能丧失特别有用 使用 RNI 方法下调目标基因的研究将证明该程序将是我实验室的博士后研究员 Dr.Sfu。要首先准备神经元培养物盖玻片，将它们在 10% 盐酸中沐浴过夜。第二天，将它们在蒸馏水中加热一个小时。
分三个 20 分钟分段，将清洁后的盖玻片存放在 70% 乙醇中，并在使用前让其风干。接下来涂上干燥的盖玻片。设置一个多孔板，每孔有 100 微升的涂层溶液。
将板在 37 摄氏度下孵育 1 至 2 小时，不要任何搅拌。孵育后，去除涂层溶液，用无菌的 1 个 XPBS 清洗盖玻片 3 次。在牺牲了一只完全麻醉的 6 至 10 周龄成年小鼠后，对疼痛感无反应。
首先，去除它的背皮。其次，切掉从颈部到尾巴的所有椎骨，包括附着的组织。最后，去除附着在组织内部的所有内部器官。
用一个 XPBS 冲洗切除的脊柱两到三次，然后将其固定在解剖板腹侧朝上。小心地去除肌肉以暴露感觉神经。在腰椎水平连接到 DRG 的神经最粗，很容易定位。
因此，对于大多数实验，仅收获腰椎 DRG。用小剪刀沿中心线切开每个椎骨，然后小心地去除椎间盘以隔离椎骨。从 L 1 开始，使用镊子劈开每个椎骨并解剖出腰椎 DRG。
通过沿着每条腰神经朝向脊髓追踪，用镊子找到 DRG。对 L 2 到 L 6 重复此过程。接下来，使用弹簧剪刀修剪孤立的 DRG 的周围神经背根和腹根。
如有必要，将 DRG 储存在装有 em EM 培养基的冷冻 1.5 毫升离心管中。相同的程序可用于从其他脊柱水平收集 DRG。收集所有 DRG 后，用 1 毫升、胶原酶 A 溶液替换 MEM 培养基，并在 37 摄氏度下孵育 DRG 90 分钟。
接下来，用 500 微升 1 x 三重 E 快速消化溶液替换胶原酶 A 溶液，并在第二次消化后将试管放回培养箱中再放置 15 至 20 分钟。用一毫升含有 5% FBS 的制备培养基替换溶液来洗涤 DRG，旋转 DRG 并让它们沉淀。重复此洗涤。
在继续之前，请执行两次步骤。去除最后一次洗涤后，加入 600 微升培养基，轻轻上下移液以对组织进行三角化。在 tri 之后，使用 1000 微升移液器吸头执行此作 20 到 30 次，让未解离的组织沉降到微量离心管的底部。
仅将细胞悬液转移到 10 mL 无菌管中，再添加 600 μL 培养基。重复 tri 步骤，直到大部分组织解离。悬浮液包含神经元和非神经元细胞。
通常，从 6 个 dgs 中收集约 50， 000 个细胞，足以进行一次电穿孔反应，离心 6 个 dgs 的解离细胞并丢弃尽可能多的上清液。然后，通过 200 μL 移液器吸头轻轻敲击 3 至 4 次，将细胞重悬于 100 μL 含有 DNA 质粒或 SI RNA 的转染溶液中。将悬浮液转移至电穿孔中，检查并在电穿孔后对细胞进行电穿孔。
立即向 vete 中加入 500 μL 含有 FBS 的温热培养基。对于大多数需要 Resus 悬浮液和重新接种培养的实验，塑料培养皿上的神经元每孔 10 至 20， 000 个细胞。然而，为了在电穿孔后直接检查轴突生长，可以将神经元直接接种在涂层玻璃盖玻片上，每孔 3 至 5， 000 个细胞。
细胞培养 4 小时后，神经元将附着在底物上。用 500 μL 新鲜加热的培养基轻轻更换被转染溶液污染的培养基，然后将板放回培养箱中。电穿孔后仅数小时即可分析 DNA 质粒的基因表达。
然而，为了分析新轴突生长中基因表达的下调，需要更长的培养时间。在高密度板上培养三天后，用 1 毫升预热的新鲜培养基更换培养基，然后用移液管轻轻划动 6 到 10 次，将神经元冲洗到溶液中。然后非神经元细胞将保持附着在板上，将重悬的神经元转移到微量离心管中，并轻轻地将它们 T 10 至 15 次以解离细胞团块。
为确保在培养三天后更容易使用附着神经元的悬浮液，在初始培养前对培养皿的包被限制在仅 1、2、3 小时。在 S 悬浮步骤中，我们通常在倒置显微镜下不断检查细胞，以观察细胞是否从培养皿板中分离。第二天，将神经元以低密度放到新制备的盖玻片上，分析新的轴突生长。
在没有任何添加的细胞外生长因子的情况下，成年 DRG 神经元通常开始生长轴突。首次接种后 48 小时，轴突通常显示分支形态。相比之下，重新电镀的神经元在电镀后仅几个小时就开始延伸轴突，并且轴突伸长，分支减少。
这些结果表明，重新电镀的神经元与体内再生神经元具有相似的特性。通过使用这种方法，使用功能丧失研究来检查轴突再生相关转录因子 JU 在成年 DRG 神经元轴突生长中的作用。体外研究。
结果表明，一组针对 cgen 不同区域的 4 种不同 irna 的电穿孔显着降低了成年 DRG 神经元中 cgen 的蛋白水平。转染后 3 天，当神经元重新接种和培养过夜时，来自 cgen 敲低神经元的轴突生长显著减少。这些结果表明，培养的成年 DRG 神经元为研究成年神经元的轴突生长提供了一个有用的模型系统。
看完这个视频，你应该对如何剖剖转染和培养有一个很好的了解。成人还必须根神经节神经元才能在体外研究膜意外再生。
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概览
本文描述了一种用于研究成年小鼠背根神经节（DRG）神经元轴突再生的体外模型。该方法涉及神经元的基因操作，用于分析轴突再生，特别适用于功能丧失研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 轴突再生对神经损伤后的恢复至关重要。
- DRG神经元是研究周围神经系统再生的关键模型。
- 基因操作技术可以阐明轴突生长机制。
- RNA干扰（RNAi）是功能丧失研究的强大工具。
研究目的
- 建立可靠的体外轴突再生研究模型。
- 实现对DRG神经元的基因操作以进行功能分析。
- 促进对操作后轴突生长动力学的研究。
使用的方法
- 将成年小鼠的DRG分离成单细胞悬液。
- 通过电穿孔转染分离的神经元。
- 培养神经元数天以允许基因操作。
- 重悬和重新铺板神经元以进行进一步的培养和分析。
主要结果
- 成功实现了对DRG神经元的基因操作。
- 显微镜分析显示操作后的神经元轴突再生。
- 重悬方法允许有效评估轴突生长。
- 获得了轴突再生分子机制的洞见。
结论
- 该模型为研究轴突再生提供了宝贵的工具。
- 基因操作可以揭示神经元生长的重要见解。
- 该方法可以适用于各种功能丧失研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This in vitro model enables mechanistic interrogation of axon regeneration pathways using genetically manipulated adult DRG neurons, supporting target validation in neurodegenerative disease programs. By decoupling intrinsic neuronal growth capacity from inhibitory CNS environments, the system provides predictive confidence for de-risking CNS repair strategies. The resuspension-replating workflow specifically addresses timing challenges in loss-of-function studies, enhancing assay reliability for target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of axon regeneration-associated genes through gain- and loss-of-function approaches.
- Operational Value: Facilitates target de-risking by isolating intrinsic neuronal growth mechanisms from extrinsic inhibitory factors.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying axon regrowth as a functional readout for target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized neuronal cultures with quantifiable axon length metrics for compound or genetic screening.
- Reproducibility: Resuspension-replating step ensures consistent axon growth assessment post-gene manipulation.
- Scalability: Electroporation-based transfection allows high-throughput genetic perturbation in primary neuronal systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intrinsic axon growth capacity relevant to CNS injury and neurodegenerative conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro target validation to in vivo conditioning lesion paradigms for enhanced regeneration.
- Mechanistic De-risking: Clarifies molecular drivers of axon regeneration to inform therapeutic target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling target validation prior to assay development and preclinical efficacy testing in axon regeneration programs.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of axon growth pathways via genetic manipulation of primary sensory neurons.
- Screening: Generates reproducible axon length readouts for evaluating gene or compound effects on regeneration.
- Analytics: Microscopy-based axon length analysis provides quantitative, objective measurements for comparative condition assessment.
- Translational Research: Aligns with in vivo conditioning lesion models to enhance predictive value for CNS repair strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple axon regeneration projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of axon regeneration targets through controlled genetic perturbation.
- Operational Value: Standardized workflow with resuspension-replating step ensures reliable loss-of-function analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking target modulation to functional axon regrowth outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on axon growth predictive assays.
Implementation Considerations
- Expertise in primary neuronal dissection, dissociation, and electroporation techniques.
- Instrumentation for nerve tissue dissection, cell transfection, and live-cell imaging systems.
- Standardization of transfection efficiency and replating timing across experimental batches.
- Adaptation considerations for different neuronal subtypes or disease-relevant genetic backgrounds.
- Practical limitations include transfection efficiency variability and the 3-4 day protein knockdown timeline affecting loss-of-function study design.
