Name: 微透析的乙醇操作性乙醇的自我管理和乙醇的测定气相色谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习微透析技术结合气相色谱法，实时监测大鼠脑内乙醇浓度变化，用于研究操作性自我管理行为与神经药理学机制。该方法对成瘾研究具有重要价值。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIH/NIAAA）资助（项目编号：AA11852 和 AA007471）。

1. 立体定位手术
<ol>
 <li>所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》，并经机构动物护理与使用委员会批准。</li>
 <li>使用立体定位仪，对经过良好适应性处理的Long-Evans大鼠用异氟烷麻醉后，在其目标脑区上方植入21号导管（用于后续插入微透析探针）（Plastics One, Roanoke, VA），并在头帽阶段集成 tether 螺栓（用于支撑微透析设备）。</li>
 <li>手术期间及术后需密切监测大鼠状态。确保所有动物均接受至少一周的术后护理与恢复，并在开始以下操作前处于健康状态。JoVE网站提供该立体定位手术方法的视频演示。1</li>
</ol>
2. 操作性训练
<ol>
 <li>术后恢复一周后，将动物置于配备有舔触测量仪、可伸缩杠杆和吸管的Med Associates操作箱（MedAssociates, Inc., Vermont, USA）中，训练其按压杠杆以获取10%蔗糖溶液（如Howard et al., 2009）中先前所述）2。所有操作程序均使用MedAssociates提供的软件进行设计（MedAssociates, Inc., Vermont, USA）。</li>
 <li>动物经训练学会对蔗糖溶液作出反应后，开始让大鼠进入适当的训练程序，在多次饮酒训练中逐步向溶液中添加乙醇。</li>
 <li>例如，本实验室目前采用为期8天的训练程序，逐步将乙醇加入溶液中，最终形成含10%乙醇/10%蔗糖的饮用溶液。对照组动物仅给予10%蔗糖溶液或不给予任何饮用溶液。所使用的具体操作程序类型可有多种变化，但下文所述的微透析取样通用步骤仍可照常实施。3</li>
</ol>
3. 微透析前操作：固定导管
<ol>
 <li>第二次训练的前一晚（在本示例中为第7次）th 训练阶段），动物会适应连接在其头基部栓钉上的系留弹簧。该弹簧连接至微透析旋转接头和平衡杠杆臂，杠杆臂通过铁架台和夹具悬挂在笼子旁边，使动物能够在笼内自由活动。系留的动物将在操作室内的自家笼中过夜， 随意摄取 食物和水，使其适应固定装置的设置。 </li>
 <li>次日，将大鼠连接套管后完成操作式程序，使其在执行行为任务的同时适应套管连接的感觉。将套管固定装置安装在操作箱内壁靠近顶部的位置，以便将套管和旋转连接器悬挂在操作箱顶中央上方。所有装置均置于隔音屏蔽箱内。实验结束后，将大鼠放回操作室内的饲养笼中，等待微透析探针插入。 </li>
</ol>
4. 微透析前处理步骤：微透析探针在大鼠完成当日行为学训练后，于微透析实验前一天插入
<ol>
 <li>在微透析实验前一天，当大鼠完成一次带束缚的自主给药实验后，使用异氟烷麻醉大鼠，并从导向套管中移除堵针。将预先用人工脑脊液（ACSF）灌流的微透析探针经颅骨导向套管缓慢（约5分钟）插入目标脑区。我们使用的探针及微透析操作方法参考 Doyon et al., 2003 及 Pettit 和 Justice, 1991 的实验室自制方案。3, 4 </li>
 <li>使用前述的束缚装置，将探针的进液管和出液管悬吊于动物上方。 </li>
 <li>将探针的灌流速度调低至 0.2 μl/min。大鼠再次在操作室中过夜。 </li>
</ol>
5. 微透析实验流程：在具有食欲期和摄食期分离的自我给药实验期间采集样本
<ol>
 <li>实验开始前至少 2 小时，将探针调节至工作流速。我们根据脑区不同，使用 1.0 或 2.0 μl/min 的流速。使用 Hamilton 注射器通过时间测量体积，检查探针流速是否稳定，并至少达到设定流速的 90%。</li>
 <li>在操作行为实验前、中、后采集透析样本（每次 5 或 7 分钟）。采样间隔取决于脑区、待分析的神经递质、分析物在透析液中的浓度，以及后续分析所用化学分析设备的灵敏度。行为阶段如下：
 <ol>
 <li>基线期：实验开始时，在动物的饲养笼内采集透析样本（共 4 个样本）。</li>
 <li>转移期：采集完饲养笼内的基线样本后，将大鼠转移至操作箱。转移连接导管的大鼠时需格外小心，确保微透析液体传输管不缠绕，且大鼠保持安静。转移完成后，立即启动操作程序，并从基线/转移样本切换至第一个等待样本。</li>
 <li>等待期：在大鼠等待杠杆伸入操作箱期间继续采集样本（根据脑区不同，采集 3–4 个样本）。</li>
 <li>饮用期：杠杆出现并被按压后，向大鼠提供一瓶饮用溶液（10% 蔗糖/10% 乙醇或 10% 蔗糖），持续约 20 分钟（采集 3–4 个样本）。</li>
 <li>饮用后期：饮用阶段结束后，瓶子收回，但大鼠仍留在操作箱内约 20 分钟（采集 3–4 个样本）。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
6. 微透析实验步骤：乙醇分析用微透析样品的制备
<ol>
 <li>在动物自我摄入乙醇溶液之前采集的两个样本，以及之后的所有样本，均需进行乙醇浓度检测。用移液器从待测样本中吸取1或2 μl等分试样，加入2 ml玻璃小瓶中。然后用气密隔垫密封小瓶（9 mm红色聚四氟乙烯/硅胶隔垫螺口盖，Agilent Technologies）。乙醇分析所用等分试样的体积（1或2 μl）取决于样本总体积以及后续其他分析所需的样本量。</li>
 <li>如果样本将用于后续神经化学分析，请在移取用于乙醇定量的等分试样后，妥善保存剩余样本。</li>
 <li>例如，本实验室会对样本中的多巴胺进行分析。为此，在实验过程中将样本置于干冰上，实验结束后将样本储存在-80 °C条件下。我们使用2 μl等分试样对采集体积为5 min、流速为2.0 μl/min的伏隔核探针采集样本进行乙醇分析。这样可确保至少剩余7 μl样本用于后续高效液相色谱-电化学检测法分析多巴胺。</li>
 <li>对于前额叶皮层采集的样本，由于其细胞外多巴胺浓度显著较低，我们从流速为1.0 μl/min、采集时长为7 min的样本中取1 μl等分试样用于乙醇分析。</li>
</ol>
7. 微透析后处理步骤
<ol>
 <li>微透析实验结束后，对大鼠实施麻醉并取出探针。若动物未立即实施安乐死，则应插入闭塞器。应在实验后三天内采集脑组织，否则可能无法观察到探针通路。</li>
 <li>脑组织的取出应遵循经批准的动物使用规程。我们采用戊巴比妥钠过量注射（150 mg/kg，ip）后，经心脏灌注生理盐水，随后灌注含盐水的甲醛溶液。在切片前，将脑组织浸入甲醛-生理盐水溶液中至少12小时。</li>
 <li>将脑组织冠状切片为100 μm厚度的切片，用焦油紫（cresyl violet）染色，并检查探针植入位置是否准确。5, 6</li>
</ol>
8. 乙醇浓度样品分析
<ol>
 <li>使用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪分析所采集的样品以及外部标准品（0.3125 - 20 mM 乙醇）。该系统由 Varian CP 3,800 气相色谱仪、配备火焰离子化检测器、Bruker（Varian）8,400 型顶空自动进样器（加热至 50 °C）和 HP Innowax 毛细管柱（30 m x 0.53 mm x 1.0 μm 涂层厚度）组成，以氦气作为流动相。</li>
 <li>使用色谱分析软件（例如本文将具体讨论的 Varian Star 色谱工作站软件）记录和分析色谱图。</li>
 <li>为准备乙醇分析，使用循环水浴加热自动进样器样品盘，并打开另外两个气体钢瓶（空气和氢气）；氦气应始终保持开启，以保护蜡质色谱柱。</li>
 <li>记录气体钢瓶压力，以及计划运行的样品数量，以便统计纤维头和隔垫的使用次数，并在适当时候进行更换（纤维头：500 次进样；隔垫：100 次穿刺）。</li>
 <li>启动开机方法，使系统准备就绪以运行样品（程序参数见表 2）。等待系统显示“就绪”状态。</li>
 <li>启动持续 20 分钟的“灼烧”程序，通过高温处理纤维头，使其脱附在静置期间吸附的任何污染物，从而为样品分析做准备。</li>
 <li>标准品的配制方法：在通风橱中，将 238 μl 的 95% 乙醇用水稀释至 100 ml 的最终体积，使用容量瓶定容，得到 40 mM 的乙醇溶液。采用 1:1 系列稀释法配制 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mM 的标准品。对于每个浓度的标准品，使用与透析样品取样体积相同的 aliquot 量。用移液器将 aliquot 转移至 2 ml 玻璃小瓶中，然后用气密性隔垫密封小瓶。</li>
 <li>所有乙醇样品在自动进样器中加热，直至整个液体 aliquot 完全汽化。我们通常加热约 30 分钟。</li>
 <li>本节介绍我们气相色谱仪所使用的 Star 工作站软件。虽然也可使用其他软件，但以下描述可能不适用于其他系统。</li>
 <li>运行样品时，创建样品列表，注明每个样品所在的自动进样器位置及其穿刺次数。确保将数据文件路径设置为指定文件夹。然后选择适用于样品的分析方法，并开始运行。我们使用表 2 中列出的运行参数。</li>
 <li>我们的透析液乙醇分析程序中，样品吸附时间为 3 分钟，随后在 1 分钟内脱附进入氦气流，进入蜡质色谱柱。然而，程序可根据具体需求进行自定义设置。</li>
 <li>样品组分在蜡质色谱柱中实现分离，随后进入火焰离子化检测器，在此处含碳化合物（如乙醇）发生燃烧并释放离子。这导致检测器阳极与阴极之间的电子流增加，产生电流，该电流被转换为电压信号并记录下来，生成如下图所示的色谱图（图 1）。电压变化与随时间通过检测器的碳含量成正比。</li>
 <li>系统完成样品运行后，需检查每个峰的积分情况。对于 Star 工作站软件，点击工具栏中的蓝色峰图标。点击每个峰的颜色标识，并拖动箭头调整基线。在进入下一组峰之前，重新积分每个峰。峰分析软件可以是任何通用的色谱分析软件。</li>
 <li>对于 Star 工作站软件，点击工具栏中的批处理报告图标。将指定文件夹中的每个样品拖入批处理报告中，以打印样品报告。报告软件可根据大多数常见色谱软件系统进行自定义设置。</li>
 <li>报告可编程显示用户选择的信息内容。我们目前使用峰高，但也可设置为使用峰面积。</li>
 <li>关闭系统时，启动关机方法（参数见表 2），关闭水浴，当色谱柱 oven 温度降至 30 °C 时，关闭氢气和空气钢瓶。</li>
</ol>
9. 乙醇数据
<ol>
 <li>以各已知外标乙醇浓度为横坐标，峰高为纵坐标作图（图 2A）。利用这些数据点所得的线性函数，根据每个透析液样品的峰高计算乙醇浓度。</li>
 <li>通过绘制透析液中乙醇浓度随时间的变化曲线，可以观察在行为实验期间目标脑区乙醇水平的变化模式。如下所示的示例数据（图 2B）表示在自我给药实验期间，透析液中乙醇浓度随时间的变化情况。</li>
</ol>
10. 常规维护：光纤每使用 500 次后应更换，隔垫每使用 100 次后应更换
更换纤维
<ol>
 <li>在气相色谱仪键盘上按下菜单键，选择 8,400，按回车；选择更换进样针，按回车。自动进样器将自动定位，以便取出固相微萃取纤维（SPME Fiber Assembly, 75 μm Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, Bellefonte, PA）。</li>
 <li>打开覆盖纤维的门。拧开锁紧螺母，拨动卡扣以取出纤维组件。取出纤维组件后，拧下固定纤维的螺母，然后将纤维从组件上拧下。</li>
 <li>用新纤维替换旧纤维，并重新组装纤维组件。将组件装回自动进样器中，重新卡紧并旋紧到位。操作完成后，在键盘上按下“更换完成”，自动进样器将准备就绪，可投入使用。</li>
</ol>
更换隔垫
<ol>
 <li>首先，拧开覆盖隔垫的螺帽（Hi-Temp .450 Dia. Generic Conditioned Septa, Varian），然后取下旧的隔垫。将新的隔垫压入接口中。重新拧上螺帽，并用扳手拧紧。然后，使用注射针头穿刺隔垫，以避免首次穿刺时纤维断裂。</li>
</ol>
11. 代表性结果
图1展示了三种浓度乙醇标准品以及一次乙醇自我给药实验结束时采集的大鼠透析液样本的色谱图示例。乙醇峰应相对对称，保留时间一致，且信噪比 &gt; 10。若无法满足这些标准，则表明系统需要维护。良好的色谱结果和正确配制的标准品可产生线性标准曲线（R² ≥ 0.99；图2A），用于计算乙醇自我给药动物在自我给药过程中所采集透析液样本中的乙醇浓度（图2B）。
<img src="/files/ftp_upload/4142/4142fig1.jpg" alt="乙醇浓度色谱图，大鼠透析液；显示毫伏相对于时间的变化，并标注了峰。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 典型色谱图。将1 μl的乙醇标准品或透析液样品加入气相色谱小瓶中，并按照文中所述方法进行分析。A) 来自2.5、5.0和10 mM乙醇标准品的峰叠加图。B) 来自自行摄取乙醇的大鼠透析液样品所产生的峰。
<img src="/files/ftp_upload/4142/4142fig2.jpg" alt="乙醇色谱图，峰高与浓度，时间与透析液浓度。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 显示在图 1中的示例实验的图形结果。A) 乙醇标准曲线。B) 乙醇自我给药过程中透析液乙醇浓度的时间进程。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>硬件</td>
 <td>参数</td>
 <td>启动设置</td>
 <td>运行设置</td>
 <td>静置设置</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">8,400 Bruker (Varian) 自动进样器</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>进样模式</td>
 <td>Spme</td>
 <td>Spme</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>溶剂穿透深度</td>
 <td>0%</td>
 <td>20%</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>样品穿透深度</td>
 <td>20%</td>
 <td>20%</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>吸附时间</td>
 <td>0.01 min</td>
 <td>3 min</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>解吸时间</td>
 <td>19 min</td>
 <td>1 min</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>清洗模式溶剂来源</td>
 <td>I</td>
 <td>I</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>清洗模式吸附与解吸时间</td>
 <td>0.01 min</td>
 <td>0.01 min</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>水浴（加热自动进样器）*</td>
 <td>50 °C</td>
 <td>50 °C</td>
 <td>关闭</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="5">CP-3800 Varian 气相色谱仪</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>进样口炉</td>
 <td>炉电源</td>
 <td>开启</td>
 <td>开启</td>
 <td>开启</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>炉温</td>
 <td>250 °C</td>
 <td>220 °C</td>
 <td>30 °C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>色谱柱炉</td>
 <td>稳定时间</td>
 <td>0.10 min</td>
 <td>0.10 min</td>
 <td>0.10 min</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>温度</td>
 <td>65 °C</td>
 <td>65 °C</td>
 <td>30 °C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>色谱柱</td>
 <td>流动相流速</td>
 <td>8.5 ml/min</td>
 <td>8.5 ml/min</td>
 <td>n/a</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>柱压</td>
 <td>~ 6 psi</td>
 <td>~ 6 psi</td>
 <td>≥ 0.1 psi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FID 检测器</td>
 <td>炉电源</td>
 <td>开启</td>
 <td>开启</td>
 <td>开启</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>温度</td>
 <td>220 °C</td>
 <td>220 °C</td>
 <td>120 °C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>电子元件</td>
 <td>开启</td>
 <td>开启</td>
 <td>关闭</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>时间常数</td>
 <td>快速</td>
 <td>快速</td>
 <td>快速</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>量程</td>
 <td>11</td>
 <td>11</td>
 <td>11</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>自动调零</td>
 <td>是</td>
 <td>是</td>
 <td>是</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 配备火焰离子化检测系统的气相色谱仪参数。该表格列出了用于系统准备（启动设置）、运行（运行设置）以及非使用期间维护（待机设置）的三个程序所对应的参数。

<ol><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880(2008).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li>
<li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li>
<li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li>
<li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+The+Rat+Forebrain%22">Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain</a>. , Academic Press Inc. (1998).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press Inc. (1986).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Principles+of+Instrumental+Analysis%22">Principles of Instrumental Analysis</a>. , 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).</li>
<li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+operant+self-administration+of+10%25+ethanol+plus+10%25+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li>
<li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li>
<li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li>
<li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li>
</ol>

本文由 Med Associates, Inc. 资助。

应用与局限性
在啮齿类动物中，药物自我给药被用于模拟药物成瘾。许多通过这种方式建模的滥用药物可通过静脉注射给予，使药物直接进入中央室，从而可在自我给药过程中精确监测剂量。由于乙醇通常通过口服自我给药，受个体间吸收和代谢差异的影响，其药物浓度的监测难度较大。通过使用微透析技术采集目标脑区的样本，我们不仅能够监测乙醇到达该脑区的动态模式，还能在每次自我给药阶段同步监测同一脑区随时间变化的神经递质水平变化。
大脑中的神经化学变化及药物诱导反应与药物滥用和依赖密切相关；因此，在特定的自我给药阶段同时测量神经化学物质和药物浓度的能力，提供了一种极为强大且独特的研究工具。在将分析物的透析液浓度与行为相关联时，需要注意微透析管路的物理特性。具体而言，液体从微透析探针腔体传输至收集管所需的时间至关重要，时间越短越好。在本实验室中，我们制作的探针使该时间约为90秒。在这些条件下，我们发现乙醇摄入开始时伏隔核多巴胺水平升高，随着透析液中乙醇浓度的增加，在饮酒过程及饮酒后阶段多巴胺水平逐渐下降。2,3,8,9 这些实验若结合药理学研究的数据，可帮助我们区分乙醇本身的药理作用与自我给药相关环境线索对神经递质浓度变化的影响。
需要注意的是，这种结合行为学与微透析技术的特定应用符合我们实验室当前的研究兴趣。该方法旨在评估乙醇进入大脑的时间模式，并将其与同一脑区神经递质变化的模式进行比较，从而将这些测量指标与同步的自我给药行为相关联。所获得的透析液中乙醇浓度未校正in vivo探针回收率，仅为脑组织乙醇浓度的一部分。如果需要进行乙醇的定量微透析，应通过实验测定乙醇从细胞外空间扩散进入探针的提取分数。有关方法及进一步讨论，请参见我们实验室此前发表的文献10,11,12。
尽管本方案以气相色谱法结合固相微萃取技术对微透析样品顶空中乙醇的分析为例，也可采用其他方法检测微透析样品中的乙醇含量。然而，替代方法可能存在某些缺点。例如，灵敏度较低的分析方法可能需要更大的样品体积，从而要求采样时间超过本方案所示的5–7分钟。本文所讨论的系统采用固相微萃取技术，通过将纤维置于密封样品瓶的顶空区域，使乙醇在气相中被纤维吸附而实现富集。与直接顶空进样（通常仅允许注入50–100 μl气体）相比，该方法可显著提高检测限。顶空法的另一主要优势在于，用于分析的进样样品极为洁净且不含盐分。虽然也可采用直接进样液态微透析样品的方法以获得更高的灵敏度，但这会因需定期清洗所注入的盐分而导致仪器停机时间更长。
问题排查及其他注意事项
<ol>
 <li>在实验开始前，请预留充足的时间检查微透析装置是否正常工作，并排除可能出现的问题。我们建议准备一套额外的装置，用人工脑脊液（ACSF）灌流，以便在原有装置出现故障时及时替换，从而节省时间，因为大多数操作式行为实验通常需要每天在固定时间进行。</li>
 <li>插入微透析探针时应持续约5分钟完成，以尽量减少探针穿透脑组织时因剪切作用造成的组织损伤。</li>
 <li>将大鼠转移至操作箱时，建议由两人协作，以避免转移管（微透析装置的一部分）发生缠绕，并确保操作程序能够准时启动。</li>
 <li>确保自动进样器的水浴有足够时间达到设定温度。我们的系统通常需要2小时才能升至50 °C。此外，在分析样品前，应确认样品已完全汽化。我们通常会通过目视确认汽化完成后才开始样品分析。</li>
 <li>应遵循良好的分析化学规范，包括但不限于对人员、仪器和操作流程的验证。简而言之，我们采用以下准则：每位操作人员应能够连续多天稳定地获得标准品浓度的重复性峰高值，并建立线性标准曲线（R² ≥ 0.99）。为验证气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）系统运行正常，每次分析透析液样品前均应先分析标准品，所生成的标准曲线R²值应不低于0.99。</li>
 <li>我们目前使用的大部分设备最初购自Varian, Inc.，该公司于2010年被Agilent Technologies收购。此后，Varian的实验室气相色谱仪器业务由Bruker Scientific Instruments接手。未来如需采购相关设备，可咨询上述任一公司。</li>
 <li>本方案展示的是大鼠的操作式行为实验，但观看者应注意，在体型更小的小鼠模型中，行为干扰可能更为显著。另一个需要注意的问题是，若将微透析探针植入前额叶内侧皮层或伏隔核以外的脑区，可能比本方案所示造成更严重的行为干扰。因此，必须仔细评估多种行为参数，以确定探针植入造成的组织损伤是否引发显著的行为改变。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>95% 乙醇</td><td>AAPER 酒精与化学公司，谢尔比维尔，肯塔基州</td><td>E190, 111000190</td><td></td></tr><tr><td>超纯蔗糖</td><td>MP Biomedicals, LLC，Solon，OH</td><td>821721</td><td></td></tr><tr><td>超高纯氦气</td><td>空气气体</td><td>HE UHP300</td><td></td></tr><tr><td>空气</td><td>空气气体</td><td>AIZ300</td><td></td></tr><tr><td>氢</td><td>空气气体</td><td>AIZ300</td><td></td></tr><tr><td>GC 2 ml 小瓶</td><td>安捷伦科技</td><td>#8010-0015</td><td></td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯/硅胶隔垫的气相色谱小瓶盖</td><td>安捷伦科技</td><td>#8010-0084</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1. &lt;/strong&gt; 特异性试剂</td></tr></tbody></table>

在操作式饮酒自我给药期间进行乙醇微透析及通过气相色谱法测定乙醇含量

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

操作性自我给药方法常用于研究多种滥用药物（包括乙醇）的行为学和药理学效应。然而，乙醇通常通过口服方式自我摄入，而不是像其他许多滥用药物那样通过静脉注射。口服给药的药代动力学比静脉给药更为复杂。由于理解乙醇的药理学与行为学效应之间的关系需要了解饮酒期间及饮酒后乙醇到达大脑的时间过程，我们采用体内微透析结合火焰离子化检测气相色谱法，以监测脑透析液中乙醇浓度随时间的变化。
联合微透析-行为学实验涉及多种技术的使用。本文仅介绍立体定位手术、行为学训练和微透析，这些方法可被调整用于检验多种与自我给药及神经化学相关的假设，其目的在于说明这些技术如何与后续的样本采集及透析液乙醇分析阶段相衔接。文中详细描述了通过气相色谱-火焰离子化检测法对透析液中乙醇浓度进行分析的方法，该方法专用于乙醇研究。这些方法所产生的数据可揭示在自我给药过程中乙醇进入大脑的动态模式，当与对相同透析液样本的神经化学分析相结合时，可进一步推断出乙醇的药理学和行为学效应。

本文描述了一种在操作性乙醇自我给药期间测定大鼠脑内乙醇浓度时间进程的方法。采用气相色谱火焰离子化检测法对透析液样品中的乙醇进行定量，因为该方法对所产生微小体积样品具有所需的灵敏度。

操作性自我给药方法常用于研究多种滥用药物（包括乙醇）的行为学和药理学效应。

本实验的总体目标是在乙醇自我给药过程中监测脑部透析液中的乙醇水平。为了将该测量结果与同步的自我给药行为进行比较，首先需通过外科手术在大鼠脑内植入微透析导向管、套管及 tether 螺栓，随后训练大鼠通过操作性条件反射进行乙醇自我给药。第二步是使大鼠适应头部连接装置的 tether，以确保在微透析过程中不会干扰其乙醇自我给药行为。然后在乙醇自我给药过程中进行微透析，并将部分透析液制备用于乙醇分析。接下来，使用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪分析透析液样本中的乙醇浓度。最终，所得结果展示了在乙醇自我给药过程中乙醇到达目标脑区的时间过程。与现有的尾静脉或隐静脉穿刺等方法相比，该技术的主要优势在于采样时对动物的干扰极小，能够在动物执行行为学任务的同时，对目标脑区内的药物浓度进行随时间变化的测定。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到一定困难，因为该操作需要掌握多项专业技能，其中许多技能只能通过反复练习或实践经验获得。此外，本实验操作将由本实验室的本科研究助理 Jeffrey Dilley 进行示范。所示的所有动物实验程序均经德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循《实验动物护理与使用指南》的所有规定。德克萨斯大学奥斯汀分校是一家经ALAC认证的机构，实验所用动物为经过良好训练的Long Evans大鼠，其大脑目标区域上方已外科植入21号套管，用于行为学微透析实验。所有动物在开始以下实验程序前，均应接受至少一周的术后护理与恢复，且确保健康状态良好。将大鼠放入配备有 Lichter 可伸缩杠杆和滴管装置的 Med Associates 操作箱中，训练其按压杠杆以获取 10% 蔗糖溶液。当大鼠学会通过按压杠杆获取蔗糖溶液后，开始对其进行适当的训练程序，在多次饮酒阶段的前一晚，逐渐在溶液中添加乙醇，直至倒数第二次操作任务之前完成添加。在对动物实施麻醉并检查其镇静程度后，将套管弹簧连接到大鼠头部固定装置的套管螺栓上，使其适应该装置，该装置包括平衡杠杆、臂、旋转套管、弹簧和环形支架。将大鼠置于操作室内的笼中过夜，自由摄取食物和水，次日进行训练，连接套管及相关设备，此操作应在微透析实验前一天完成。用异氟烷麻醉大鼠后，通过夹趾法检查其麻醉效果，随后插入灌流有人工脑脊液的微透析探针。妥善固定探针后，将探针灌流速度调整至0.2 µL/min。将大鼠放回操作室内的原代鼠笼中过夜，所有透析设备保持原位，并提供自由饮食和饮水。在插入探针后的第二天，于实验开始前至少两小时，将探针调节至其工作流速。使用 Hamilton 注射器检查探针流速是否稳定，且至少达到设定流速的 90%。如果要分析透析样本中的神经递质，应在实验的所有阶段采集样本。首先在动物处于饲养笼中时收集透析样本，并以适当方式储存样本，以备后续分析。小心地将大鼠转移至操作箱中，并启动控制该操作箱的程序。在大鼠等待杠杆伸入箱内的期间持续采集样本，在杠杆伸出前采集两个样本。开始收集每份透析液样本的一部分用于乙醇分析：用移液器吸取适量透析液至一个2毫升玻璃小瓶中，并用密封隔垫迅速密封小瓶，移液并密封乙醇样品时应快速操作。由于乙醇具有挥发性且样品体积较小，不一致或缓慢的样品制备将导致结果不准确。剩余样品应储存起来用于神经递质分析。20分钟的饮酒期从Med Associates计算机程序将杠杆伸入实验箱且大鼠按压杠杆以获得饮用溶液瓶的访问权限后开始。在整个饮酒阶段持续采集样本。饮酒阶段结束后，计算机程序将瓶子从腔室中收回。微透析实验结束时，将动物继续留在腔室内额外20分钟作为饮酒后阶段。麻醉大鼠后，取出探针。若动物未立即实施人道安乐死，应重新插入套管以确保可视化探针通路。在实验后三天内采集脑组织。使用配备火焰离子化检测器、加热至50摄氏度的顶空自动进样器以及以氦气为流动相的毛细管柱的气相色谱仪，将样品与外部乙醇标准品一同进行分析。使用色谱工作站软件记录和分析色谱图，以准备系统进行乙醇分析。使用循环水浴加热自动进样器样品盘，并打开空气和氢气钢瓶。接下来，启动开机程序。准备就绪后，启动持续20分钟的灼烧，以对纤维进行去污染处理。使用100毫升容量瓶，将238微升95%乙醇用水稀释至100毫升终体积，配制标准溶液。采用1:1系列稀释法配制各级标准溶液。将标准品移液至玻璃小瓶中，并按照样品的处理方式完全相同进行密封。务必同时运行一个水空白样作为对照。将标准品和样品放入自动进样器样品盘中，加热至全部液体样品完全蒸发。为了运行标准品和样品，需创建一个样品列表，注明每个样品所在的自动进样器位置，并注明每个样品都应进行穿刺。将数据文件定向至选定的文件夹后，选择适合样品的分析方法并开始运行。系统完成样品分析后，检查程序是否已正确积分每一个峰。绘制各已知外部标准品的峰高随乙醇浓度变化的曲线图。利用该数据点给出的线性函数，内插计算每个透析液样品的乙醇浓度。该图显示了三种浓度的乙醇标准品以及一次乙醇自给药实验结束后采集的大鼠透析液样本的色谱图示例。乙醇峰应相对对称，保留时间一致，且信噪比大于10。若无法满足这些标准，则表明系统需要维护；良好的色谱结果以及正确的标准品可生成一条线性标准曲线，用于计算乙醇自给药动物在自给药过程中所采集透析液样本中的乙醇浓度。所获得的透析液乙醇浓度未校正体内探针回收率，仅为脑组织乙醇浓度的一部分。若需进行乙醇的定量微透析，需通过实验测定乙醇从细胞外间隙扩散进入探针的提取分数。若操作得当，熟练掌握该技术后，整个过程大约需要四到五小时即可完成。这将根据行为实验的持续时间而有所不同。实验中微透析阶段的成功在很大程度上取决于前期准备阶段的质量。在实施该操作时，重要的是确保大鼠已被充分适应操作环境，并已习惯在透析实验过程中可能出现的任何潜在干扰刺激，以避免影响动物的自我给药行为。

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