在操作式饮酒自我给药期间进行乙醇微透析及通过气相色谱法测定乙醇含量

本实验的总体目标是在乙醇自我给药过程中监测脑部透析液中的乙醇水平。为了将该测量结果与同步的自我给药行为进行比较，首先需通过外科手术植入微透析导向套管、插管和头部连接螺栓，然后训练大鼠通过操作性条件反射自我给药乙醇。第二步是使大鼠适应头部连接装置的系绳，以确保在微透析期间该装置不会干扰乙醇的自我给药行为。

然后在乙醇自我给药过程中进行微透析，并将部分透析液制备用于乙醇分析。接着，使用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪分析透析液样本中的乙醇浓度。最终，所得结果展示了在乙醇自我给药过程中，乙醇到达目标脑区的时间过程。

与现有的尾静脉或隐静脉穿刺等方法相比，该技术的主要优势在于采样时对动物的干扰极小，能够在动物执行行为学任务的同时，对目标脑区内的药物浓度进行随时间变化的测定。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到一定困难，因为该操作需要掌握多项专业技能，其中许多技能只能通过反复练习或实践经验获得。此外，本实验操作将由本实验室的本科研究助理 Jeffrey Dilley 进行示范。

所有展示的动物实验程序均经德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循《实验动物护理与使用指南》的所有规定。德克萨斯大学奥斯汀分校是经ALAC认证的实验机构，实验所用为经过良好训练的Long Evans大鼠，其颅内目标脑区上方已手术植入21号套管，用于开展行为学微透析实验。所有动物在开始以下实验程序前，均应接受至少一周的术后护理与恢复，并确保健康状态良好。

将大鼠放入配备有 Lichter 可伸缩杠杆和倾倒管的 Med Associates 操作箱中，训练其按压杠杆以获取 10% 蔗糖溶液。当大鼠学会通过按压杠杆获取蔗糖溶液后，开始实施适当的训练计划，在多次饮酒阶段的前一晚，逐渐向溶液中添加乙醇，直至倒数第二次操作任务之前完成添加。在对动物实施麻醉并检查其镇静程度后，将套管弹簧连接至大鼠头部固定装置上的套管螺栓，使其适应该装置，该装置包括平衡杠杆、臂、旋转套管、弹簧和环形支架。

将大鼠置于操作室内的笼中过夜，自由摄取食物和水，次日进行训练，连接套管及相关设备，为微透析实验做准备。用异氟烷麻醉大鼠后，通过夹趾法检查麻醉效果，随后插入灌流有人工脑脊液的微透析探针。妥善固定探针后，将探针灌流速度调整至 0.2 µL/min。

将大鼠放回操作室内的原代鼠笼中过夜，保持所有透析设备处于原位，并提供自由摄食和饮水。在插入探针后的第二天，于实验开始前至少两小时，将探针调节至其工作流速。使用 Hamilton 注射器检查探针流速是否稳定，且至少达到设定流速的 90%。

如果要分析透析样本中的神经递质，应在实验的所有阶段采集样本。首先在动物处于饲养笼中时收集透析样本，并以适当方式储存样本以备后续分析。

小心地将大鼠转移至操作箱中，并启动控制该箱的操作程序。在大鼠等待杠杆伸入箱内的过程中持续采样，在杠杆伸入前采集两个样本。开始收集每份透析液样本的一部分用于乙醇分析：用移液器吸取适量透析液至一个2毫升玻璃小瓶中，并用密封隔垫迅速密封小瓶，移液并密封乙醇样品时应快速操作。

由于乙醇具有挥发性且样品体积较小，不一致或缓慢的样品制备将导致结果不准确。剩余样品应储存用于神经递质分析。20分钟的饮酒期从Med Associates计算机程序将杠杆伸入实验舱且大鼠按压杠杆以获得饮用溶液瓶的时刻开始。

在整个饮酒阶段持续采集样本，饮酒阶段结束后，计算机程序将瓶子从实验腔室中收回。微透析实验结束时，将动物继续留在腔室内额外20分钟作为饮酒后阶段。麻醉大鼠后，取出探针。

若动物未立即实施人道安乐死，应重新插入套管以确保可视化探针通道。在实验后三天内采集脑组织。使用配备火焰离子化检测器、加热至50摄氏度的顶空自动进样器以及以氦气为流动相的毛细管柱的气相色谱仪，将样品与外部乙醇标准品一同进行分析。

使用色谱工作站软件记录和分析色谱图，以准备系统进行乙醇分析。使用循环水浴加热自动进样器样品盘，并打开空气和氢气钢瓶。接下来，启动开机程序。

准备就绪后，启动20分钟的灼烧程序，以对纤维进行去污染处理。使用100毫升容量瓶，将238微升95%乙醇用水稀释至100毫升终体积，配制标准溶液。采用1:1的系列稀释法制备标准品。

将标准品移液至玻璃小瓶中，并按照与样品相同的方法进行密封。务必同时运行一个水空白对照。将标准品和样品放入自动进样器样品盘中，加热至全部液体等分试样完全蒸发。

为了运行标准品和样品，需创建一个样品列表，注明每个样品所在的自动进样器插槽位置，并注明每个样品都应进行穿刺。将数据文件定向至选定的文件夹后，选择适合样品的分析方法并开始运行。系统完成样品运行后，检查程序是否已正确积分每一个峰。

绘制各已知外部标准品的峰高随乙醇浓度变化的曲线图。利用该数据点给出的线性函数，内插计算每个透析液样品中的乙醇浓度。

该图展示了三种浓度乙醇标准品以及一次乙醇自给药实验结束后采集的大鼠透析液样本的色谱图示例。乙醇峰应相对对称，保留时间一致，且信噪比大于10。若无法满足这些标准，则表明系统需要维护；良好的色谱结果以及正确的标准品可生成一条线性标准曲线，用于计算乙醇自给药动物在自给药过程中所采集透析液样本中的乙醇浓度。

所获得的透析液乙醇浓度未校正体内探针回收率，仅为脑组织乙醇浓度的一部分。若需进行乙醇的定量微透析，需通过实验测定乙醇从细胞外间隙扩散进入探针的提取分数。若操作得当，掌握该技术后，整个过程大约需要四到五小时即可完成。

这将根据行为实验的持续时间而有所不同。实验中微透析阶段的成功在很大程度上取决于前期准备阶段的质量。在实施该操作时，重要的是确保大鼠已被充分适应操作环境，并已习惯在透析实验过程中可能出现的任何潜在干扰刺激，以避免影响动物的自我给药行为。