恒压控制的挤压方法制备纳米脂质体
2012年6月22日
本协议描述了一个准备一个高度同质化的亚微米大小的脂质体的挤压方法。此方法使用脂质体的制备与控制氮流量压力控制系统。脂质准备 1,2，脂质体挤压，大小特征将在此呈现。
以下实验的总体目标是提出一种用于生物学相关脂质囊泡的稳健制备方法。这是通过将磷脂混合和转移到玻璃瓶中，并用水性缓冲液水合以产生多层 SLE 悬浮液来实现的。作为第二步，进行冻融方法，随后从多个薄片囊泡中产生 Ella 囊泡。
接下来，脂质体悬浮液使用确定的最佳压力通过挤出机，以产生所需大小的均匀脂质囊泡。根据动态光散射和纳米颗粒跟踪分析，获得的结果表明一致的亚微米囊泡大小。与超声处理和沉淀等现有方法相比，该技术的主要优点是该方法使用压力控制系统，具有最佳确定的氮气流速，用于高效的脂质囊泡尺寸制备。
要开始此程序，请取回一个带有特氟龙内衬盖的 20 毫升玻璃瓶，使用前用氯仿清洁所有玻璃器皿和注射器，以防止污染。使用 250 μL 气密玻璃注射器将 100 μL 试剂级氯仿转移到玻璃瓶中。使用 100 μL 气密玻璃注射器，将 30 μL 试剂级甲醇添加到同一个玻璃样品瓶中。
通过转移 216 微升 10 毫克/毫升的 pop C 42 微升 10 毫克/毫升来制备 2 毫摩尔的 pop C 罂粟胆固醇脂质溶液。Pop e 和 20 微升，每毫升 11 毫克。20 毫升玻璃样品瓶中的胆固醇溶液使用慢流氩气或氮气蒸发有机溶剂，直到在样品瓶底部观察到一层脂质薄膜，将未加盖的玻璃样品瓶置于真空干燥中至少 30 分钟。
要去除残留溶剂，将之前通过 0.2 微米过滤器的 2 mL 缓冲液转移到玻璃瓶中，以水合脂质。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜，并在 48 小时内用于 30 至 100 纳米大小的脂质体。在液氮中释放脂质体悬浮液 15 秒。
然后使用加热块在 42 度 SIU 解冻脂质体悬浮液约三分钟。重复冻融过程，总共五个循环。冷冻和随后的解冻从多片状囊泡中产生 Ella Les，并提高了挤出过程中的脂质捕获效率。
接下来，按照 Avastin 说明准备挤出，以如此快速地小心组装脂肪。LF 50 挤出机的正确装配对于防止氮气泄漏至关重要，氮气泄漏会影响所需的流速。为确保成功，请仔细执行以下步骤。
产生气密密封。将大孔支撑滤网放在支撑过滤器底座中，然后是圆形中心培养皿、一个排流盘和一个聚碳酸酯膜。将黑色小 O 形圈放在膜顶部，并将其固定到支撑过滤器底座上。
通过拧紧四个相应孔中的四个螺钉来连接顶部过滤器挤出机。将过滤器挤出机单元组装在大型挤出机料筒下方。将脂质体溶液添加到挤出桶顶部的圆筒桶中。
放置一个大的圆形 O 形圈、窄帽、大的圆形 O 形圈和圆形帽。将气体调节器连接到挤出机料筒顶部并关闭所有阀门以防止漏气，包括泄压阀。将 20 毫升玻璃瓶或 50 毫升锥形瓶放在挤出机过滤装置下方。
安全阀连接到调节器，如果压力超过 600 PS，安全阀将释放。我打开氮气并打开连接到挤出机的燃气阀。将 400 纳米脂质体的氮气压力提高到 25 PSI，100 纳米脂质体增加到 125 PSI，30 纳米脂质体增加到 400 到 500 PSI。观察脂质体悬浮液，直到它在被氮气推动的同时喷射到容器中。
保持氮气流动，直到没有观察到液体。通过挤出机过滤器进入玻璃文件以执行 DLS 分析。首先，制备 50 微升用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 稀释的 20 微摩尔脂质体溶液。
然后打开电源和 lamp 源。继续打开 dynapro 软件。将软件设置为算法模型以检测所需大小的脂质体。
连接到硬件移液器后，将 14 微升脂质体样品放入石英瓶中并插入细胞支架中，在大约 20 到 30 次采集后按开始，按停止。分析直方图上记录的平均脂质体直径峰。纳米颗粒示踪分析从制备溶解在 PBS 中的 500 μL 0.1 μmol 脂质体溶液开始，用水和乙醇冲洗样品室。
然后用无绒纸巾擦干样品室。打开激光电源，计算机将 300 微升 0.1 摩尔脂质体溶液输送到样品室。打开温度控制和纳米粒子跟踪分析软件。
按下 Capture 按钮以打开激光。使用水平和垂直调整来移动载物台并调整显微镜焦距。设置所需的温度和录制时间。
按下录制按钮可在指定时间内拍摄脂质体颗粒的多个照片帧。分析与直方图上脂质体直径大小相对应的峰，因为它跟踪每个颗粒的运动。DLS 是一种收集散射光以确定颗粒直径的成熟方法，用于确定脂质体的大小。
如书面方案中所述，水合脂质体以各种尺寸和压力通过聚碳酸酯膜挤出。通过 DLS 测量的 30 纳米孔径的脂质体直径为 66 正负 28 纳米。对于 100 纳米，孔径为 138 正负 80 纳米，对于 400 纳米，孔径为 360 正负 25 纳米。
使用 50 纳米抛光 Irene 珠子的悬浮液作为校准标准，它记录的直径为 47 正负 16 纳米。多聚分散性百分比表明脂质体大小内没有重叠。使用 DLS 分析时，通常会观察到大于 30 纳米的直径，因为该仪器已知偏向于较大的颗粒。
尽管存在这种仪器限制，但校准曲线描述了非线性相关性。纳米粒子跟踪分析是一种新技术，它通过直接观察液体介质中的扩散来测量每个粒子的大小，而与粒子的折射率或密度无关。这种高分辨率技术可用于补充 DLS 对脂质体的测量，NTA 记录的直径为 95 正负 48 纳米和 356 正负 51 纳米，两种 100 纳米和 400 纳米聚苯乙烯溶液用于校准。
脂质溶液的直径相对于 DLS 具有更可比的直径，对于 30 纳米孔径，产生的平均尺寸为 29 正负 14 纳米，对于 100 纳米孔径，平均尺寸为 95 正负 17 纳米，对于 400 纳米孔径，平均尺寸为正负 73 纳米。NTA 可能是一种更通用的量化微观颗粒的表征技术，因为它的灵敏度允许测量 50 至 1000 纳米的颗粒。校准曲线显示聚碳酸酯膜暂停与记录的 NTA 直径负染色透射之间的线性相关性电子显微镜图像显示挤出尺寸 3、100 和 400 纳米后的每个脂质体尺寸彼此明显不同。
放大倍数设置为 25， 000 倍，比例尺代表 0.5 微米。对三种脂质体大小进行了时程实验。在挤出后立即测量每种脂质体溶液的 DLS。
所有脂质体溶液均在 4 摄氏度下储存过夜。孵育过夜后，DLS 再次记录它们的直径。孵育 60 小时后几乎没有观察到变化在尝试此程序时，重要的是要记住，多次通过挤出过滤器将提高 Vesco 溶液的均匀性。
此外，请记住使用玻璃样品瓶和注射器进行样品制备，以防止聚丙烯管从氯仿中浸出而受到污染。
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概述
该协议描述了一种使用压力控制系统制备生物学相关脂质囊泡的稳健方法。该方法确保亚微米级脂质囊泡具有高度的均一性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 生物物理学
- 纳米技术
背景
- 脂质囊泡对各种生物应用至关重要。
- 传统的超声波方法可能无法提供一致的尺寸。
- 压力控制系统可以增强制备过程。
- 动态光散射和纳米颗粒追踪用于尺寸表征。
研究目的
- 提出一种高效的脂质囊泡制备方法。
- 实现囊泡尺寸的高度均一性。
- 比较该方法与传统技术的有效性。
使用的方法
- 将磷脂与水性缓冲液混合以创建多层片状SLE悬浮液。
- 应用冷冻和解冻方法生产Ella囊泡。
- 使用最佳压力的挤压机进行脂质体悬浮液处理。
- 通过动态光散射和纳米颗粒追踪分析表征囊泡尺寸。
主要结果
- 实现了一致的亚微米囊泡尺寸。
- 该方法比超声波和沉淀显示出优势。
- 最佳的氮气流速增强了制备效率。
- 结果证实了所生产的脂质囊泡的均一性。
结论
- 该方法为脂质囊泡制备提供了可靠的方法。
- 它在尺寸一致性和均一性方面提供了显著的改进。
- 压力控制系统是该协议的关键创新。
常见问题
Executive Industry Relevance
Consistent preparation of nano-sized lipid vesicles is critical for biopharma R&D, enabling reliable modeling of membrane dynamics and drug encapsulation studies. The constant pressure-controlled extrusion method addresses longstanding challenges in vesicle size homogeneity, supporting predictive confidence in early discovery and formulation workflows. This capability enhances translational continuity from mechanistic studies to preclinical evaluation of lipid-based delivery systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of membrane curvature effects on protein-lipid and protein-protein interactions.
- Supports functional validation of membrane-associated targets by providing uniform vesicle platforms.
- Facilitates mechanistic de-risking in studies of endocytosis, exocytosis, and membrane fusion.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, size-defined liposomes for standardized assay development.
- Improves assay reliability by minimizing vesicle heterogeneity and batch variability.
- Enables scalable preparation of vesicles for high-throughput compound screening and encapsulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides stable vesicle formulations for drug delivery and encapsulation research.
- Ensures continuity in vesicle properties from in vitro mechanistic studies to preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of lipid-based delivery candidates by demonstrating vesicle stability and size fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both mechanistic studies and formulation development for lipid-based therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on membrane curvature and protein trafficking using uniform vesicle systems.
- Screening: Provides assay-ready liposomes with validated size distributions for compound evaluation.
- Analytics: Employs DLS and NTA for quantitative vesicle size measurement and batch-to-batch comparability.
- Translational Research: Maintains vesicle stability and size for downstream preclinical and encapsulation studies.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, scalable platform for repeated vesicle preparation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane biology and drug delivery research.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation, reducing variability and manual error.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by ensuring reliable vesicle properties for downstream studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-based candidates through reproducible formulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid chemistry and vesicle characterization techniques.
- Needs access to pressure-controlled extrusion apparatus and analytical tools such as DLS and NTA.
- Demands rigorous cleaning protocols to prevent sample contamination.
- Adaptable to various lipid compositions and vesicle sizes as supported by protocol.
- Instrumental limitations in size measurement (e.g., DLS bias) should be considered in data interpretation.
