微环境微阵列（MEArrays）的制备与应用

以下实验的总体目标是通过将贴壁细胞类型平行暴露于多种组合式微环境（Combinator microenvironments），来测量不同微环境对贴壁细胞功能的影响。该目标首先通过制备打印基底，以支持微环境蛋白混合物的吸附；随后制备微环境蛋白的主板，用于使用毛细管笔（quill）或毛细管针（capillary pin）微阵列打印机器人打印微环境（ME）阵列。

接下来制备含有微环境蛋白的主培养板。然后将贴壁细胞培养在 ME 芯片上，并可选择性地控制细胞数量。所获得的结果通过免疫荧光分析，展示了不同微环境对细胞功能（如分化或增殖）的影响。

我们最初萌生这一方法的想法，是源于希望量化组织微环境对人类记忆干细胞命运决定的影响，但我们意识到在体内进行研究是不可能的。如今该方法已得到开发，在细胞生物学、基础研究和药物发现领域具有广泛的应用。PDMS 作为一种基底材料，可模拟较硬的组织，因其成本低廉、易于制备且易于打印而被采用。

然而，使用PDMS时，其疏水性可能与某些细胞系不相容。请使用非乳胶手套，因为乳胶会抑制PDMS的聚合。首先，在一次性塑料杯中，按10:1的比例将Cigar 184硅酮弹性体基质与固化剂混合，并用木质或塑料压舌板充分搅拌。

接下来，在室温下将混合物置于真空干燥箱中脱气30分钟。然后将标准显微镜载玻片置于旋转涂布仪的真空卡盘中央，将0.5毫升混合好的弹性体聚合物滴加在载玻片表面中心，以6,000 RPM转速旋转涂布60秒。将涂有PDMS的载玻片在70°C下固化4小时至过夜。

载玻片可在室温下密封保存数月。PA 是一种水凝胶，可模拟较软组织的特性，PA 细胞仅会附着在含有支持细胞黏附蛋白的位点。首先用氢氧化钠蚀刻载玻片。

将载玻片置于80摄氏度的加热板上。在每张载玻片上滴加1毫升0.1当量的氢氧化钠溶液。务必覆盖整个载玻片表面，否则PA实验将失败。

让氢氧化钠蒸发，留下一层白色薄膜。如果表面未完全覆盖，可重复此过程。如有需要，载玻片可在室温下保存数天。

接下来，在通风橱中用PES对玻片进行包被。将玻片放入15毫升培养皿中。在每张经氢氧化钠蚀刻的玻片上加入300微升PES。

将A PES与氢氧化钠载玻片精确反应五分钟，不可超过。在载玻片两侧用去离子水彻底冲洗A PES两到三次。

否则，下一步将在载玻片上氧化形成棕色沉淀。现在将载玻片表面的所有溶液吸出至各自的培养皿中。加入 25 毫升含 0.5% 戊二醛的 PBS 溶液。

将载玻片置于暗处，静置 30 分钟。30 分钟后，吸除载玻片表面的戊二醛溶液。然后使用无绒吸水纸小心地将载玻片干燥。

如有需要，载玻片现在可于室温下保存过夜。配制并脱气聚丙烯酰胺（PA）混合液后，将其置于冰上以减缓聚合。在准备载玻片前，立即将过硫酸铵和 TEMED 加入每种冰上预冷的混合液中，并用移液器吹打混匀 5 至 10 秒。

现在将PA混合液移液至载玻片表面。PA的用量根据所需凝胶硬度而定。然后将玻璃盖玻片轻轻置于PA上，避免施加压力，以防产生气泡。

让PA凝胶聚合两小时，然后在去离子水中移除盖玻片。将PA凝胶载玻片置于大号共面玻璃罐中，用水过夜清洗。次日为去除未反应的丙烯酰胺，将载玻片干燥至PA凝胶完全硬化。

载玻片可置于密封的玻片盒中，在 4 摄氏度条件下保存一个月。首先，将塑料腔室安装到双腔玻片上，以包围打印好的微阵列。取下腔室，并用剃刀片将其沿中线切开。

使用1 mL移液器吸头将少量水族馆级硅胶均匀涂抹于腔室边缘，然后将其压紧到Emmy芯片表面。注意避免硅胶接触到芯片结构的任何部分。确保培养腔室与Emmy芯片牢固粘合至关重要，因为密封不良会导致培养液从腔室泄漏，进而引起大范围的细胞死亡。

对于PDMS包被的载玻片，将两种凝胶类型的载玻片均在1% Pluronic F 108水溶液中真空孵育15分钟以进行封闭，然后用含抗生素的细胞培养基清洗阵列，每次清洗5分钟，共清洗三次。此步骤可去除未反应的单体，这些单体在PA凝胶情况下可能对细胞具有毒性。第三次清洗后，再在培养基中额外孵育30分钟，以使凝胶重新水化。

现在将四到五个阵列放入一个15厘米的无菌培养皿中。向培养皿中加入最终培养基体积的一半，并加入所需浓度的目标细胞。ME阵列应置于适合所用细胞类型维持培养的培养箱中。

观察期间，每隔15至20分钟在显微镜下检查细胞是否均匀附着于打印的特征区域。轻轻摇动ME阵列，以区分已附着和未附着的细胞。附着时间可能有所不同，但在PA编码的ME阵列上通常在两小时内完成。

当达到结合饱和或设定的时间限制后，吸出未结合的细胞，并向经 PDMS 涂层处理的 ME 阵列中加注培养基至最终体积。完全移除所有培养基会导致细胞死亡。因此，在这些芯片上进行所有培养基更换时，应逐步替换一半体积的培养基，然后再补充至最终体积。

在正常更换培养基的情况下，培养可进行多天。常见的固定剂（如多聚甲醛、醛类以及甲醇丙酮）均可与 Emmy 阵列系统兼容。请注意，即使对 PDMS 涂层的 ME 阵列进行染色时，也必须始终保持其湿润状态。

继续使用半量置换法制备受染色的 ME 芯片的载玻片。使用刀片去除小室，并用封片胶将盖玻片固定。使用毛笔上的方形硅针将 G 蛋白沉积到打印的 PDMS 编码 ME 芯片上。

通过使用抗体进行免疫荧光检测，验证了微阵列打印机器人对多种蛋白质的点样沉积。主板中蛋白质溶液的稀释梯度反映了其在打印基底表面沉积的量，细胞以明显的图案化方式附着于所打印的特征区域。同样，当在40,000次通量规模上打印Emmy芯片时，也出现相同的明显图案化细胞附着现象。

PA凝胶上的两种微环境蛋白在人源多能乳腺上皮前体细胞系中诱导出浓度依赖性的角蛋白表达谱。角蛋白8信号与角蛋白14信号的对数比值展示了信号的变化性和可重复性。培养24小时后，在对12个微阵列的分析中，未结合的细胞被洗去。

采用标准统计分析方法，以确定不同浓度的I型胶原蛋白和重组人P-钙黏蛋白共刺激是否引起角蛋白表达的变化。最初，细胞在刚贴壁后各项特征与均值相比无显著差异。然而，24小时后，高浓度I型胶原蛋白显著提高了角蛋白8的表达水平。

而高浓度的PCA在此处引发了强烈的角蛋白14信号。该发现与先前关于双潜能记忆前体细胞的报道一致。由于这些细胞与其微环境相互作用具有动态性和相互性，这些细胞自身可改变所打印微环境的组成。

因此，为了理解所打印微环境的急性影响，按照本方案，暴露时间不应超过48小时。任何可通过荧光或比色法检测的生物过程，均可作为微环境的函数，用于回答其他问题，例如：不同的微环境如何改变癌细胞系的药物反应？这主要通过细胞凋亡和增殖的变化来实现。

或者微环境如何改变前体细胞的分化？