Name: lensfree芯片断层用人多角度的光照和像素超高分辨率的显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习无透镜光学断层扫描技术，通过多角度部分相干照明和像素超分辨率算法实现生物样本的三维高分辨率成像。该方法适用于芯片实验室平台的大体积高通量成像应用。

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1. 成像设置
LOT 可以组装成紧凑轻便的可现场携带式结构8，也可另选组装为具备分段成像能力的光流控显微镜9。然而，在本报告中，我们将描述用于静态样品断层成像的台式实现的基本成像装置。
<ol>
 <li>照明模块： 在LOT中，可以使用部分相干光源，例如发光二极管（LED）。为了提高实验灵活性，我们采用配备氙灯的单色仪（Cornerstone T260，Newport Corp.）。将单色仪调节至输出光谱宽度约为1-10 nm，中心波长位于 例如 450-650 nm。该部分相干光随后耦合至多模光纤（Thorlabs AFS105/125Y），以将部分相干光传输至系统。 
光纤安装在电动旋转台（Thorlabs PRM-1Z8，由Thorlabs TDC001控制器驱动）上，以调节照明角度。将带有光源的电动旋转台安装于二维线性X-Y平移台（Newport ILS50CC，由Newport MFA-PPD控制器驱动）上，用于在给定角度下实现光源在平面内的位移。 </li>
<li>检测： 无透镜光学断层成像是可扩展的技术，可根据应用需求选择探测器阵列，而无需显著改变图像采集步骤或数据处理流程。本报告中采用的CMOS传感器阵列具有5百万像素，像素尺寸为 2.2 μm （IDS成像，UI-1485LE-M）。该探测器用于记录宽视场（例如 24 mm2全息图像的样品被直接放置在探测器活性区域的顶部。如果要实施双轴断层扫描设置 7，探测器还应安装在水平（相对于光学平台）旋转台上（例如 Thorlabs RP-01）以在垂直于光轴的平面内旋转样品（连同探测器一起）。 7</li>
</ol>
2. 样品制备
尽管无透镜光学断层成像技术可用于成像多种物体，如细胞和微生物，但我们将通过对秀丽隐杆线虫（C. elegans）样本进行三维显微成像来阐述其基本原理。
<ol>
 <li>使用解剖刀或刮铲，从含有C. elegans培养物的培养皿中取一小块琼脂。每边几毫米大小的立方体琼脂块即可包含数百条线虫。</li>
 <li>将小块琼脂放入一个聚丙烯小管中，加入1 ml去离子水（DI水）。</li>
 <li>轻轻涡旋振荡0.5-1分钟，静置10-15分钟，直至线虫从琼脂块中爬出并进入去离子水中。</li>
 <li>为暂时固定线虫，加入1 ml 5-10 mM的左旋咪唑溶液（Sigma-Aldrich），静置10分钟。</li>
 <li>从管底吸取5-10 μl样品，夹在两张盖玻片之间。此样品含有大量暂时固定的线虫（例如 50-100条），可置于探测器上开始数据采集。
 </li>
</ol>
3. 数据采集
在此，我们总结了典型LOT实验的图像采集步骤，该实验通过使用自行开发的LabView界面实现了自动化。
<ol>
 <li>调节旋转台的初始角度至 -50 °，其中 0° 对应于光源的垂直位置。</li>
 <li>将X-Y载物台的初始位置调整至(0,0)，即 HOME 位置。</li>
 <li>调整探测器的曝光时间，以最大限度地利用其动态范围，使图像在不出现饱和像素的情况下尽可能明亮。 </li>
 <li>在不改变旋转台角度的情况下，拍摄9张图像。对于每张图像，将X-Y平移台移动至3×3方阵网格中的一个新位置，使每张图像相对于前一张图像移动约四分之一个像素。在每个角度下采集更多图像， 例如 在一个 6μ6格网格可能会根据物体类型和信噪比（SNR）提高分辨率。 10</li>
 <li>将 X-Y 载物台的初始位置调整至 (0,0)，即 HOME 位置。</li>
 <li>以固定角度增量增加旋转台的角度 2°，直至达到+50°每次增量后， 即 在每个新角度下，重复步骤3-5。角度增量可根据采集时间与成像分辨率的权衡优化而设定得更小或更大。</li>
 <li>（如果采用双轴断层扫描方案，则为可选步骤）旋转支撑探测器的水平载物台 90°然后，重复步骤1-6。</li>
</ol>
4. 数据分析
按照第3节中的步骤1-6，获取一组共459幅图像，其中包含51个不同照明角度下每个角度对应的9幅亚像素位移图像。首先，使用像素超分辨率算法10对每组9幅图像进行数字处理，以获得每个照明角度对应的一幅高分辨率（HR）投影全息图。需要注意的是，像素超分辨率指的是克服像元尺寸对无透镜图像空间分辨率的限制，而非突破衍射极限。随后，对这些经过像素超分辨率处理的全息图进行数字重构7-10，得到51幅投影图像。接着，利用TomoJ（ImageJ的一个插件，ImageJ为开源图像分析软件）11对这组51幅投影图像进行反投影运算。该反投影操作输出样品的三维图像（断层图）。尽管本文未实施，但也可采用如参考文献7所述的双轴层析成像方案。在此方案中，通过将光源绕与第一旋转轴正交的轴旋转，获得第二组断层图，从而提供关于样品的更多空间信息，并提高轴向分辨率。
5. 代表性结果
在图1中展示了无透镜光学断层成像的大视场（FOV）。由于样品直接放置在探测器阵列上方，因此可在24 mm2的视场范围内记录物体的全息图像，若采用具有更大有效面积的新型探测器阵列，该视场还可进一步扩大。
尽管探测器阵列的像素尺寸限制了记录的全息图像的分辨率，但像素超分辨率技术可以缓解这一问题。 图2 显示像素超分辨全息图及重建图像（即 提供亚微米级空间分辨率的投影图像，对应三种不同的照明角度。
投影图像可以利用断层成像重建技术进行组合（例如 滤波反投影）以计算断层图像（即 样本的三维图像 图3 显示了三条穿过蠕虫前部的 x-y 平面切片图像，其中咽部管状结构仅在 z= 处的切片中可见8 μm，正如这种横截面近似为圆柱形的结构所预期的那样，其直径约为~5 μm 外径。此外，x-z 平面的横截面图像（插图中） 图3 上图清晰显示了线虫的边界及内部咽管结构（箭头所示），表明咽部的三维成像已成功实现。
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig1.jpg" alt="显示可见生长模式的细菌显微镜图像；微生物学分析，1 mm 比例尺指示。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1 显示了使用无透镜光学断层扫描（LOT）装置在垂直照明下记录的全视场（24 mm2）全息图像。由于 LOT 具有较大的成像面积，单次数据采集即可同时对大量线虫进行成像。
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig2.jpg" alt="弯曲鞘分析，角度 θ=-40°, 0°, +40°，实验成像，显微镜对比。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2 展示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）在三个不同照明角度下的像素超分辨全息图（左侧面板）和数字重建的投影图像（右侧面板）（从大视场中裁剪而来）。每个投影图像包含来自不同观察角度的信息，从而可通过滤波反投影运算计算出其三维结构。
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig3.jpg" alt="线虫在不同z层面的显微镜示意图；显示前后端，并附有比例尺。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3展示了图2中C. elegans线虫的计算断层图像。（上排）显示了在z=3 μm处整个线虫的切片图像。插图为线虫前端的横截面图像。插图的比例尺为50 μm。（下排）显示了穿过线虫前端的三个切片图像，展示了无透镜光学断层成像技术的光学切片能力。图中各处箭头指示的是线虫咽管上同一位置。同时提供了一张显微镜图像（×40，0.65-NA）用于视觉对比。

<ol><li>Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitt%2C+JM+%22Quant.+Elect%22">Quant. Elect</a>. 5, 1205-1215 (1999).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
<li>Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Projection+Tomography+as+a+Tool+for+3D+Microscopy+and+Gene+Expression+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+diffraction+tomography+for+high+resolution+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging.</a> Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).</li>
<li>Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+microscopy+and+diffractive+microtomography+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples.</a> Meas. Sci. Technol. 19, 074009(2008).</li>
<li>Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+specimen+tomography+by+digital+holographic+microscopy%3A+Morphometry+of+testate+amoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba.</a> Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-free+optical+tomographic+microscope+with+a+large+imaging+volume+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-portable+Lensfree+Tomographic+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Field-portable Lensfree Tomographic Microscope.</a> Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+tomography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22App.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optofluidic tomography on a chip.</a> App. Phys. Lett. 98, 161109(2011).</li>
<li>Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lensfree+on-chip+microscopy+over+a+wide+field-of-view+using+pixel+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution.</a> Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).</li>
<li>Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).</li>
<li>Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+Microscopy%3A+A+Method+for+Implementing+High+Resolution+Optical+Microscope+On+A+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip.</a> Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

需要强调的是，片上无透镜全息显微镜独特的几何结构是实现像素超分辨率和断层成像的关键因素。由于所记录的图像并非如非相干接触成像方法12中假设的投影图像，而是投影全息图，因此可以通过全息重建对透射光传播至探测器过程中的衍射效应进行数字校正。因此，样品与传感器之间距离的变化可以被有效补偿。此外，由于样品与传感器之间的距离通常约为 ~0.5–5 mm，而光源距离样品约 4–10 cm，因此实现亚像素位移并不需要大幅移动光源。结果表明，仅将光源移动 50–100 μm 即可在探测器平面上实现亚像素位移，从而避免在i)照明方向/视角以及ii)每个光源位置下的有效样品-传感器距离上产生不必要的变化。若不加以控制，这些变化可能导致像素超分辨率图像中出现显著的像差。因此，在给定角度下，每个光源位置记录的全息图实际上可被视为同一全息图像的亚像素位移版本。此外，无透镜光学断层成像几乎无需对准的设计使其能够非常简便地在不同角度记录投影全息图，只需旋转光源7,9，或在不同角度使用多个光源（如LED）...

<table><tbody><tr><td>线性 X-Y 平台</td><td>Newport Corp.</td><td>MFA-PP</td><td>微型线性平台</td></tr><tr><td>电动旋转平台</td><td>Thorlabs</td><td>PRM1Z8</td><td>电动精密旋转支架</td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>AFS105/125Y</td><td>多模光纤</td></tr><tr><td>光源</td><td>Newport Corp.</td><td>6255</td><td>无臭氧氙灯</td></tr><tr><td>单色仪</td><td>Newport Corp.</td><td>74100</td><td>Cornerstone 260 1/4 m 单色仪</td></tr><tr><td>CMOS 传感器阵列</td><td>Aptina Inc.</td><td>MT9P031STC</td><td>500 万像素 CMOS 传感器</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 样品</td><td>Carolina Biosupply</td><td>173500</td><td>野生型 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td>盐酸四咪唑</td></tr></tbody></table>

无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

断层成像技术在医学领域已被广泛应用，因其能够提供不同尺度物体的三维（3D）结构信息。在微米和毫米尺度上，光学显微技术的应用日益增多，这得益于可见光的非电离特性，以及丰富的照明光源（如激光器和发光二极管）和探测元件（如大尺寸CCD和CMOS探测器阵列）的可用性。近年来发展的光学断层显微技术包括光学相干断层成像、光学衍射断层成像、光学投影断层成像以及光片显微镜技术1-6。这些平台可对细胞、微生物以及模式动物（如C. elegans、斑马鱼和小鼠胚胎）进行断层成像。
现有的三维光学成像仪通常具有相对庞大且复杂的结构，限制了这些设备在先进实验室之外的普及，并阻碍了其与芯片实验室平台和微流控芯片的集成。为了提供一种替代性的断层显微技术，我们近期开发了无透镜光学断层成像（lensfree optical tomography, LOT），作为一种高通量、紧凑型且成本低廉的光学断层成像模式。7 LOT摒弃了透镜和庞大光学元件的使用，转而依赖多角度照明和数字计算，从而在大成像体积上实现对微小物体的深度分辨成像。LOT可在15–100 mm3的大成像体积内，对生物样本实现空间分辨率分别优于&lt;1 μm（x方向）、&lt;1 μm（y方向）和&lt;3 μm（z方向）的成像，尤其适用于芯片实验室平台。

无透镜光学断层成像是一个三维显微技术，在x、y和z方向上的空间分辨率分别达到&lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm，成像体积可达15–100 mm3，特别适用于与芯片实验室平台的集成。

断层成像技术作为医学领域广泛应用的工具，能够提供不同物体的三维（3D）结构信息……

本实验的总体目标是实现对大成像体积内生物样本进行无透镜、基于芯片的三维成像。该目标通过以下步骤实现：首先将样本直接放置在传感器芯片上，并提供部分相干照明；第二步是横向移动光源至不同位置进行记录。样品的子像素位移全息图像。随后进行子像素位移。在多个照明条件下记录全息图像，用于断层成像。最后一步是数据处理，其中获取的数据集将被数字重建，最终获得样本的三维断层图像。与传统的光学显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其紧凑的架构中实现了高通量成像。这使得我们的平台特别适用于与黎巴嫩芯片平台集成。本报告描述了用于静态样品断层成像的台式系统的基本成像装置。使用配备氙灯的单色仪，调节至在 450 至 650 纳米的中心波长附近输出光谱宽度约为 1 至 10 纳米的光。该部分相干光输出随后耦合至多模光纤，以将部分相干光传输至系统。光学光纤安装在电动旋转台上，以改变照明角度。带有光源的电动台安装在二维线性XY平台上，用于在给定角度下实现光源在平面内的平移，以便进行检测。采用一个具有五百万像素、像素尺寸为2.2微米的CMOS传感器阵列。探测器用于记录样本的宽视场全息图像。必须将传感器阵列放置在与光源旋转轴相同的轴向平面上，以确保检查传感器在大角度照明下是否接收到足够的光。尽管无透镜光学断层成像技术可对多种物体（如细胞和微生物）进行成像，但本文通过使用手术刀或刮勺对海兔卵样本进行三维显微成像，来演示其基本原理。从含有接种器官培养物的培养皿中取一小块琼脂。每边几毫米的立方体琼脂块将包含数百条线虫。将一小块琼脂放入含有1毫升去离子水的聚丙烯小瓶中。轻轻涡旋30秒至1分钟。10到15分钟后，线虫应从琼脂中爬出进入去离子水中。注意，此处线虫体型过小而无法看见，以暂时固定线虫，加入一毫升5至10毫摩尔的Lima。将溶液静置10分钟。用移液器从离心管底部吸取5至10微升样品，夹在两张盖玻片之间。此样品中含有大量暂时固定的线虫，可置于检测器上以开始数据采集。为便于说明，本节总结了典型的无透镜光学断层扫描（LOT）实验的图像采集步骤。然而，整个过程已通过定制开发的 LabVIEW 界面实现自动化。若需手动操作，首先将旋转台的初始角度调整至负 50 度，其中 0 度对应光源的垂直位置。接着将 XY 平台的初始位置调整至 0,0，即归零位置。调整探测器的曝光时间，以最大限度地利用其动态范围，使图像在不改变旋转台角度的情况下尽可能明亮，且无任何像素饱和。每幅图像采集九张图片。移动XY载物台，在一个3×3的方形网格中到达新位置，使每幅图像相对于前一幅图像移动约四分之一个像素。在每个角度采集更多图像可能会提高分辨率，具体效果取决于物体类型和信噪比。在初始角度采集完九幅图像后，将 XY 载物台的位置调回零零位置。随后以两度为增量逐步增加旋转台的角度，直至达到正 50 度。每次在新角度增加后，重复上述步骤。角度增量可根据采集时间与成像分辨率之间的优化需求设置得更精细或更粗糙。数据采集完成后，将获得一组共459幅图像，其中包含在51个不同照明角度下、每个角度对应的9幅子像素位移图像。每组九幅图像通过像素超分辨率算法进行数字处理，以获得一幅高分辨率投影图像。随后，对每个角度的全息图像素超分辨率结果进行数字重建，以获得51幅投影图像。此处展示的数据处理使用笔记本电脑完成。使用图形处理单元，全视场的重建将耗时不到一秒。这组51个投影图像随后使用Tom OJA插件进行反投影。对于Image J，首先将投影图像加载到Image J中，然后调用Tom OJ插件。将提供每幅投影图像对应观测角度的查找表加载至OJ。利用加权反投影方法，可获得样品的三维断层图像。此处展示了无透镜光学断层成像的大视场特性，样品被直接放置在探测器阵列上方。物体的全息图像可在24平方毫米的视场范围内被记录，若采用具有更大有效面积的新型探测器阵列，该视场还可进一步扩大。尽管探测器阵列的像素尺寸限制了记录的全息图像的分辨率，但像素超分辨率技术可以缓解这一问题。此处展示的是经过像素超分辨率处理的全息图，以及重建后的投影图像，这些投影图像在三种不同的照明角度下实现了亚微米级的空间分辨率。可通过断层成像图像重建技术将这些投影图像进行组合，以计算出样品的三维断层图像。此处展示了通过蠕虫前部在XY平面上的三个切片图像，其中咽管结构仅在Z等于8微米的切片中可见，这与该近似圆柱形结构（外径约5微米）的预期相符。此外，XZ 平面的横截面图像清晰地显示了线虫的边界以及内部咽管的结构，表明咽部的三维成像已成功实现。随着该技术的发展，研究人员将能够对数十毫米成像体积的管状样本进行三维显微观察。因此，无透镜光学断层扫描技术可成为黎巴嫩芯片平台中高通量成像应用的有力工具。

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科研

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生物工程

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