一个在体外共感染模型研究恶性疟原虫

该程序的总体目标是开发一种体外模型，以研究疟原虫 fpar 感染的红细胞对人原代单核细胞衍生的巨噬细胞中 HIV one 复制的影响。这是通过首先使用 veac 系统分离疟原虫、假 para 感染的红细胞，然后将人单核细胞衍生的巨噬细胞暴露于受感染的细胞来实现的。接下来，红细胞暴露的单核细胞衍生的巨噬细胞感染完全复制的 HIV 或编码单复制荧光素酶的 HIV。

最后，在感染后第 3 天、第 6 天、第 9 天和第 12 天收获培养物上清液，以获得荧光素酶编码病毒的完全复制病毒。感染 72 小时后感染的细胞是谎言。最终，可以通过 Eliza 定量上清液中 HIV 1 P 24 衣壳蛋白的量来监测病毒复制，并且可以通过细胞裂解物的荧光素酶定量来监测病毒转录。

这种方法可以帮助回答疟疾、HIV 合并感染领域的关键问题。例如，疟原虫寄生虫感染如何影响 HIV 复制？虽然这种方法是为了研究巨噬细胞中疟原虫和 HIV one 之间的相互作用而开发的，但它也可以应用于其他细胞类型。

例如，证明该程序的树突状细胞、单核细胞或 CD 四个 T 细胞将是 Guadalupe Andreani。实验室的博士后研究员首先从培养板中收集红细胞，在 10 毫升单核细胞来源的巨噬细胞培养基中洗涤回收的细胞，然后在 12 毫升单核细胞来源的巨噬细胞培养基中重悬沉淀。现在慢慢地将细胞悬液加入 Milton ECS 柱中，用新鲜培养基洗涤柱一次后让悬浮液流过，将其从磁铁中取出并冲洗 12 毫升单核细胞衍生的巨噬细胞培养物。

培养基通过色谱柱，将感染的红细胞逃逸到无菌管中，以将单核细胞衍生的巨噬细胞暴露于感染或未感染的红细胞中。将适当的红细胞悬浮液体积添加到先前制备的含有单核细胞来源的巨噬细胞的 24 孔板的每个孔中。4 小时后，将共培养物在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育，去除含有红细胞的培养基，然后轻轻地向每个 PBS 中加入 600 微升无内毒素的 PBS，每次洗涤后立即吸出 PBS 三次。

现在，每个井中加入 200 微升冰、冷的无菌水，以溶解 20 秒后吸出水的红细胞。然后，向每个孔中加入 600 微升单核细胞衍生的巨噬细胞培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物 24 小时。评估疟原虫假疟原虫对单核细胞衍生巨噬细胞中 HIV one 复制的影响，在 300 微升含有 P 24 的 NL 4 3 BO IV 1 病毒的单核细胞衍生巨噬细胞培养基中，放入类似于本图中描述的方案的适当孔中。

共培养物孵育 2 小时后，用 600 μL 无内毒素 PBS 洗涤细胞 3 次。然后以 600 μL 的新鲜单核细胞衍生的巨噬细胞培养基注入每个孔中，并在第 3、6、9 和 12 天继续孵育共培养物。在初始病毒感染后，收获 200 μL 每个 snat，用 200 μL 新鲜的单核细胞衍生巨噬细胞替换回收的细胞悬液。中等。此后，将收获的上清液储存在零下 20 摄氏度，以供 Eliza 稍后分析。

为了确定寄生虫对 HIV 的影响，在 300 微升含有 P 24 荧光素酶 ENC 包被病毒的单核细胞衍生巨噬细胞培养基中，单核细胞衍生巨噬细胞中的一个基因表达到相应的孔中，类似于此处所示的方案。如刚才所示的非荧光素酶 ENC 包被病毒孵育和洗涤代码培养物后，感染后 72 小时去除培养基并加入 200 微升荧光素酶测定。Hit 裂解缓冲液现在在室温下轻轻摇动裂解细胞，然后将共培养物储存在零下 20 摄氏度。

解冻板后，将 40 μL 裂解物从每个孔转移到 96 孔发光计板中的相应孔中。然后向每个中加入 100 μL 荧光素酶测定试剂盒荧光素酶底物。最后在光度计中测量萤火虫荧光素酶活性。

根据本实验中制造商的说明，将单核细胞衍生的巨噬细胞暴露于感染或未感染的红细胞中，然后用 NL four three blen 感染。正如刚才所示，然后通过 ELIZA 监测病毒蛋白 P 24 的产生，以便在初始病毒感染后的不同时间点在无细胞上清液中监测 HIV one P 24。请注意，通过用寄生虫预处理的单核细胞衍生巨噬细胞的上半胱天中的 HIV 一 P 24 衣壳蛋白测量，第 12 天病毒颗粒释放的显着减少。

在该实验中，将单核细胞衍生的巨噬细胞暴露于感染和未感染的红细胞，然后用荧光素酶编码的病毒感染，正如刚才所示，然后在初始病毒感染后 72 小时在细胞裂解物中评估荧光素酶表达。单核细胞衍生的巨噬细胞感染此类病毒，携带外源性 VS。VG 或 HIV 一糖蛋白导致暴露于 p 假晶石的细胞中荧光素酶的产生显着减少。值得注意的是，由于 VSPG 伪型颗粒的感染效率更高，VSVG 伪型病毒产生的荧光素酶活性比其在对应病毒上的 JRFL 高得多。

这项技术将使疟疾、HIV 合并感染领域的研究人员能够在适用于多种免疫细胞类型研究的体外模型中探索这两种病原体之间的相互作用。