Name: 一个在体外共感染模型研究恶性疟原虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解恶性疟原虫感染红细胞对人单核细胞来源巨噬细胞中HIV-1复制影响的体外共感染模型。该方法通过P24蛋白定量和荧光素酶活性检测监测病毒复制，为研究疟疾与HIV共感染机制提供可应用于多种免疫细胞类型的实验系统。

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本研究工作由加拿大卫生研究院通过共感染与共病机制催化基金资助。人红细胞由拉瓦尔大学医疗中心血库提供。

注意：涉及 HIV-1 和 Plasmodium falciparum 的实验必须在适当的生物安全等级实验室中进行（寄生虫实验在 BSL2，HIV-1 及共感染实验在 BSL3），使用可能被感染的人类血液时必须采取特殊预防措施。
1. 外周血单个核细胞（PBMC）的纯化（基于8和9）
<ol>
 <li>使用经抗凝剂（肝素、柠檬酸盐、酸性柠檬酸葡萄糖或柠檬酸磷酸葡萄糖）处理的健康供者新鲜人血（500 ml）。在分离和纯化外周血单个核细胞（PBMC）以及后续所有步骤中，均应使用无内毒素试剂。</li>
 <li>用70%乙醇对血袋（包括导管）进行消毒，剪断导管，小心将血液转移至T150培养瓶中。</li>
 <li>准备16个50 ml离心管，每管加入15 ml淋巴细胞分离液（Ficoll）（确保Ficoll已恢复至室温）。小心地将30 ml新鲜血液叠加于Ficoll液面上方。</li>
 <li>在20 °C下以400 × g离心30分钟，关闭刹车。</li>
 <li>离心过程中，准备8个50 ml离心管，每管加入25 ml室温的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。</li>
 <li>小心地将界面处的浑浊细胞环（含PBMC）转移至含有HBSS的50 ml离心管中（每管合并2个细胞环）。用HBSS补至50 ml。</li>
 <li>在20 °C下以150 × g离心15分钟，开启刹车。</li>
 <li>在浑浊细胞环离心过程中，收集Ficoll分离步骤中的上层黄色液体，合并血浆以填满一个50 ml离心管。将50 ml离心管在56 °C加热30分钟以灭活补体，随后以1,800 × g离心10分钟。保留上清液（含稀释的自体血浆，可在后续步骤中作为培养基补充物）。</li>
 <li>小心地弃去上清液，将步骤1.7所得细胞沉淀用25 ml HBSS重悬，每两个沉淀合并至一个50 ml离心管中。在20 °C下以300 × g离心8分钟。</li>
 <li>小心弃去上清液，将沉淀用10 ml HBSS重悬，并合并至一个50 ml离心管中。</li>
 <li>取部分细胞悬液，进行台盼蓝排斥试验以评估细胞死亡率，然后计数PBMC。</li>
 <li>用HBSS补至50 ml，以300 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于RPMI 1640培养基中，浓度为5×106 个细胞/ml（从500 ml血液中通常可获得约400–500×106 个PBMC）。</li>
</ol>
2. 单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）分化（基于8和9）
<ol>
 <li>在15 cm培养皿中接种约1.25 × 108 个外周血单个核细胞（PBMC），每皿加入25 ml RPMI 1640培养基。</li>
 <li>将细胞置于37 °C、5% CO2 条件下孵育1–2小时，使其贴壁。</li>
 <li>将未贴壁的细胞转移至新的培养瓶中，用15 ml无内毒素的PBS洗涤培养皿两次（每次5分钟，300 × g离心）。贴壁的细胞即为分离得到的单核细胞。</li>
 <li>为使新分离的单核细胞分化为巨噬细胞（MDM），每皿加入20 ml RPMI 1640培养基，补充5%自体血浆（来自步骤1.8）、人重组巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，25 ng/ml）以及青霉素/链霉素溶液（PS，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）。在37 °C、5% CO2 条件下孵育2天，更换培养基后继续孵育2–3天。</li>
 <li>移除旧培养基，用无内毒素PBS轻柔洗涤一次，加入PBS后立即吸除。为使完全分化的MDM脱落，每皿加入约7 ml Accutase（一种市售的蛋白酶与胶原酶活性混合物，可使细胞从塑料培养皿上脱落），在37 °C、5% CO2 条件下孵育15–20分钟，并在中途轻柔摇晃。</li>
 <li>每皿加入3–5 ml自体血浆（来自步骤1.8），以保护细胞在刮取过程中不受损伤。</li>
 <li>轻柔刮取细胞，确保刮取过程中培养液始终覆盖细胞，将细胞悬液转移或合并至50 ml离心管中。</li>
 <li>用无内毒素PBS冲洗培养皿，尽可能回收残留细胞。</li>
 <li>200 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于5 ml MDM培养基中（RPMI 1640补充10%补体灭活的胎牛血清（iFBS）、PS、25 mM HEPES），进行细胞计数（MDM得率通常为总PBMC的2–8%）。注意：此步骤可取部分MDM样本，通过流式细胞术检测细胞群纯度；通常99%的MDM表达CD14。</li>
 <li>在24孔板中，每孔加入600 μl MDM培养基并接种1×105 个MDM。</li>
 <li>感染前，在37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
</ol>
3. HIV-1 病毒储备液的制备与定量
<ol>
 <li>按照 Fortin et al. 10 的方案，使用磷酸钙转染法在 HEK293T 细胞中制备病毒原液。</li>
 <li>为获得含有荧光素酶报告基因的单周期病毒，将 HEK293T 细胞共转染以下质粒组合之一：20 μg NL4.3Luc+Env-R+ 与 10 μg pHCMV-G，或 15 μg NL4.3Luc+Env-R+ 与 15 μg pJRFLenv。使用 30 μg NL4.3Luc+Env-R+ 以生成糖蛋白缺陷型对照病毒。对于完全复制型病毒，使用 30 μg NL4.3Balenv。质粒 pHCMV-G 和 pJRFLenv 分别编码水疱性口炎病毒（VSV-G）和一种趋化因子受体 CXCR5 嗜性 HIV-1（不同于 NL4.3Balenv）的包膜糖蛋白。有关质粒的更多详细信息可参见文献8。这些质粒可通过美国国家卫生研究院艾滋病研究与参考项目（NIAID, NIH）获取。</li>
 <li>使用针对 HIV-1 p24 衣壳蛋白的 ELISA 方法对所有病毒原液进行定量11，并在使用前验证其感染活性。我们通过 TZM-bl 指示细胞来评估病毒原液的感染性12。</li>
</ol>
4. Plasmodium falciparum 寄生虫的培养（基于 13）
4.1 寄生虫的一般培养与维持
<ol>
 <li>在含有25 mM HEPES和25 mM NaHCO3的RPMI 1640培养基中，添加0.5%（w/v）Albumax II、25 μg/ml庆大霉素和370 μM次黄嘌呤，以4%血细胞比容在37 °C、1%氧气/5%二氧化碳/氮气混合气体环境中，用人红细胞（血型O+）维持P. falciparum 3D7无性阶段寄生虫的培养。</li>
 <li>可通过制备培养物的薄血涂片，并用15%吉姆萨染液染色来监测寄生虫血症水平。</li>
 <li>应始终在与寄生虫相同的条件下维持未感染红细胞（uRBC）的培养皿，作为对照。 
 为获得晚期阶段寄生虫（滋养体/早期裂殖体），按以下方法进行同步化处理：</li>
</ol>
4.2 寄生虫同步化
<ol>
 <li>清晨收获寄生虫培养物，以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
 <li>用 5 倍细胞压实体积的 5% (w/v) D-山梨醇重悬沉淀，于 37 °C 孵育 5 分钟。</li>
 <li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 30 ml 培养基中，放回培养箱继续培养。</li>
 <li>约 8 小时后，重复步骤 4.2.1 至 4.2.3，以获得高度同步的寄生虫。随后于次日清晨收获晚期阶段的寄生虫（滋养体/早期裂殖体）用于实验。在纯化前，进行吉姆萨染色以确认其生活周期阶段。</li>
</ol>
4.3 恶性疟原虫感染的红细胞（iRBC）纯化
<ol>
 <li>使用70%乙醇对VarioMacs分离器（支架和磁铁）进行灭菌，并将其置于生物安全柜中。</li>
 <li>将三通旋塞固定在CS柱底部。</li>
 <li>使用Miltenyi专用切割器剪去针头塑料保护套的末端，并将针头固定在旋塞底部。</li>
 <li>小心地将柱子插入磁铁中。</li>
 <li>用随试剂盒提供的注射器连接旋塞左侧，缓慢注入10 ml MDM培养基，以排除柱内所有气泡。</li>
 <li>用约20 ml MDM培养基洗涤柱子。</li>
 <li>从培养板中收集红细胞（RBC），用10 ml MDM培养基洗涤一次（300 × g，5分钟），并将红细胞沉淀重悬于12 ml MDM培养基中。缓慢加入柱子中，让悬液自然流过（仅含有滋养体或裂殖体阶段寄生虫的感染性红细胞会因含有疟色素晶体而被磁场滞留）。</li>
 <li>用20 ml培养基洗涤一次，当液体流至柱顶白色圆盘处时停止液体流动。</li>
 <li>将柱子从磁铁上取下，用12 ml MDM培养基将感染性红细胞（iRBC）洗脱至干净无菌的离心管中。</li>
 <li>取部分回收的iRBC制备涂片，并进行吉姆萨染色以确认其生命周期阶段。</li>
 <li>使用血细胞计数板对回收的iRBC进行计数（分离得到的红细胞为100%感染性红细胞）。</li>
 <li>离心收集细胞（300 × g，5分钟），弃去上清液，用500 μl新鲜AB+人血清处理细胞（调理作用步骤14）。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2气氛中孵育30分钟。</li>
 <li>用10 ml MDM培养基洗涤一次（300 × g，5分钟），并将iRBC重悬至所需浓度。通常，一个15 cm、寄生率约为10%的培养皿可获得约0.5–1×108个高度同步化的iRBC。</li>
</ol>
5. 单核细胞来源巨噬细胞（MDM）暴露于Plasmodium falciparum
<ol>
 <li>为了使 MDM 与 uRBC 或 iRBC 接触，需将细胞重悬于 MDM 培养基中，以获得 uRBC/iRBC:MDM 为 75:1 的比例。在预先准备好的含 MDM 的 24 孔板中，向每孔加入适量的 RBC 悬液。所有实验均需设三个重复孔。</li>
 <li>将共培养体系在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。</li>
 <li>用 600 μl 无内毒素 PBS 轻柔洗涤细胞 3 次，每次加入 PBS 后立即吸除。</li>
 <li>为裂解残留的红细胞，向孔中加入 200 μl 冰冷的无菌水，作用 20 秒后吸除。</li>
 <li>加入 600 μl MDM 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 24 小时。</li>
</ol>
6. 使用完全复制型 HIV-1 感染 MDM
<ol>
 <li>为了评估P. falciparum对MDM中HIV-1复制的影响，根据图1A所示方案，向相应孔中加入300 μl MDM培养基中含有10 ng p24的NL4.3Balenv病毒；对照孔中仅加入MDM培养基。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2环境中孵育2小时。</li>
 <li>用无内毒素的PBS洗涤细胞3次，每次轻轻加入PBS后立即吸除。每孔加入600 μl新鲜MDM培养基。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2环境中继续孵育。</li>
 <li>自病毒感染开始后的第3、6、9和12天，分别收集各孔上清液200 μl，并随后补充200 μl新鲜MDM培养基。将收集的上清液保存于-20 °C，用于后续根据Fortin et al.10的方法通过ELISA定量检测HIV-1主要衣壳蛋白p24。</li>
</ol>
7. 使用编码荧光素酶的单周期病毒感染 MDM
<ol>
 <li>为确定寄生虫对MDM中HIV-1基因表达的影响，根据图1B所示方案，向相应孔中加入300 μl MDM培养基中含有10 ng p24的NL4.3Luc+Env-R+(VSV-G)、NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv)或NL4.3Luc+Env-R+病毒。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
 <li>用600 μl无内毒素PBS轻柔洗涤细胞3次，每次加液后立即吸除；每孔加入600 μl新鲜MDM培养基。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
 <li>感染后72小时移除培养基，每孔加入200 μl 1X裂解缓冲液（随荧光素酶检测试剂盒提供），室温下轻度振荡使细胞裂解，随后于-20 °C保存。</li>
 <li>解冻样品板，将40 μl裂解物转移至96孔荧光检测板中，加入100 μl荧光素酶底物（随荧光素酶检测试剂盒提供），按照制造商说明在荧光检测仪中测定荧光素酶（萤火虫荧光素酶）活性。</li>
</ol>
8. 代表性结果
利用我们的共感染模型，我们发现P. falciparum暴露可降低巨噬细胞对HIV-1的易感性。事实上，在用寄生虫预处理的MDM中，上清液中HIV-1 p24衣壳蛋白水平显示病毒颗粒释放显著减少（p&lt;0.05；双因素方差分析，第12天）（图2A）。该结果在感染携带荧光素酶报告基因病毒的细胞中得到验证。当MDM感染携带外源性VSV-G或HIV-1糖蛋白的此类病毒时，暴露于P. falciparum的细胞中荧光素酶的产生显著降低（p&lt;0.05，Student t检验）（图2B）。值得注意的是，VSV-G假型病毒产生的荧光素酶活性远高于其JRFLenv对应物，这是由于VSV-G假型颗粒具有更高的感染效率15。鉴于寄生虫暴露对这两类病毒均产生影响，表明其可能影响了病毒基因表达的某个步骤（图2B）。还需指出的是，MDM暴露于iRBC并未影响细胞活力（数据未显示），说明所观察到的抑制作用具有特异性，而非由细胞死亡所致。
<img alt="Cell experiment diagram with mock, uRBC, iRBC, Bal, Δenv, JRFL, vsv-g groups, explores viral assays." src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. A) 使用完全复制型病毒感染MDM的培养板设计示意图。 Mock：未感染的细胞。uRBC：暴露于未感染红细胞的细胞。iRBC：暴露于感染红细胞的细胞 疟原虫（Plasmodium falciparum）-感染的红细胞。Bal：感染NL4.3Bal的细胞环境 Bal/uRBC：暴露于未感染红细胞（uRBC）并感染NL4.3Bal的细胞环境 Bal/iRBC：暴露于iRBC并感染NL4.3Bal的细胞环境 B) 单周期荧光素酶编码病毒感染MDM的培养板设计 Mock：未感染的细胞。uRBC：暴露于未感染红细胞的细胞。iRBC：暴露于感染红细胞的细胞。 疟原虫（Plasmodium falciparum）感染的红细胞。Δenv：感染 NL4.3 的细胞Luc+Env-R+ JRFL：感染NL4.3的细胞Luc+Env-R+(JRFL环境vsv-g：感染 NL4.3 的细胞Luc+Env-R+(VSV-G). Δenv/uRBC：暴露于未感染红细胞（uRBC）并感染NL4.3的细胞Luc+Env-R+ Δenv/iRBC：暴露于感染性红细胞并感染了NL4.3病毒的细胞Luc+Env-R+ JRFL/uRBC：暴露于未感染红细胞并感染NL4.3的细胞Luc+Env-R+(JRFL环境). JRFL/iRBC：暴露于感染性红细胞（iRBC）并感染NL4.3的细胞Luc+Env-R+(JRFL环境vsv-g/uRBC：暴露于未感染红细胞（uRBC）并感染NL4.3的细胞Luc+Env-R+(VSV-G). vsv-g/iRBC：暴露于感染性红细胞并感染了NL4.3的细胞Luc+Env-R+(VSV-G)
<img alt="Graph of HIV protein expression and luciferase activity; y-axis: p24/ng/ml and RLU, x-axis: days/test." src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 图2. A）效应 恶性疟原虫 在MDM中HIV-1病毒的产生 MDM 以 75:1 的比例（uRBC/iRBC:MDM）分别与未感染红细胞（uRBC）或感染红细胞（iRBC）共孵育 4 小时，随后进行充分洗涤。细胞接种 10 ng 的 NL4.3Bal 病毒进行感染环境 p24 孵育 2 小时. 通过ELISA检测不同时间点初始病毒感染后无细胞上清液中的HIV-1 p24，以监测病毒产生情况。图中显示为一个代表性实验结果。 B) 效应 疟原虫（Plasmodium falciparum） 在MDM中对HIV-1病毒转录的影响 MDM 以 75:1 的比例（uRBC/iRBC:MDM）感染未感染红细胞（uRBC）或感染红细胞（iRBC）。随后，细胞感染 10 ng p24 的单周期病毒（NL4.3）Luc+Env-R+, NL4.3Luc+Env-R+(JRFL环境或 NL4.3Luc+Env-R+(vsv-g)。在初次病毒感染后72小时，检测细胞裂解液中的荧光素酶表达。展示了一个代表性实验结果。

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , (2005).</li>
<li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li>
<li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-malaria+co-infection%3A+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li>
<li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4%2B+T+cells+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li>
<li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li>
<li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+malaria+parasites+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li>
<li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes%3A+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li>
<li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+CD34%2B+cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li>
<li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文展示了两种不同的方法来分析疟原虫对 HIV-1 病毒周期的影响，即通过分析单核细胞来源的巨噬细胞中病毒基因的表达或子代病毒的产生与复制。类似的方法已被用于其他 HIV-1 与寄生虫共感染的研究16。然而，这些新数据在疟疾与 HIV-1 共感染的研究中迈出了重要一步。事实上，Diou et al.8 研究了疟色素（hemozoin）而非活体寄生虫对 HIV-1 复制的影响；与我们的结果一致，他们发现疟色素本身足以抑制巨噬细胞（MDM）的病毒产生，而非抑制 MDMs 本身。
利用所述的实验设计，我们观察到P. falciparum对巨噬细胞中HIV-1的复制周期具有明显的不利影响：在预先暴露于寄生虫的巨噬细胞中，病毒的产生显著受到抑制（图2A），而寄生虫对病毒转录的特异性影响则在图2B中得到展示。然而，我们不能排除寄生虫对病毒进入或融合（脱壳）过程，以及整合后机制（如蛋白质合成或病毒颗粒的组装与出芽）可能存在的其他附加效应。此外，若寄生虫与病毒同时加入，或在MDM感染病毒之后加入，可能会对HIV-1复制产生不同的影响。
我们的 体外 共感染模型为深入研究HIV-1/P. falciparum 宿主细胞内的相互作用。例如，将本实验设计与其他技术相结合，如可靶向并定量病毒逆转录及病毒基因组整合至宿主细胞基因组特定步骤的定量实时PCR，是完全可行的，并有望进一步揭示共感染过程中涉及的机制。此外，还可将用于评估病毒生命周期早期阶段（如病毒融合、脱壳、进入定量）的特异性检测方法应用于本基础实验方案，以进一步分析其对病毒复制的影响。这些改进表明，本方案在HIV-1定量与检测方面具有高度灵活性：事实上，甚至可设想使用氚标记核苷酸的标准HIV-1逆转录酶定量检测来替代HIV-1 p24 ELISA检测。除MDM外，我们预计该系统还可适用于其他与HIV-1-疟疾相互作用相关的细胞类型，如单核细胞和树突状细胞。MDM为贴壁细胞，这一特性有利于其操作，可在不损失任何巨噬细胞的情况下，轻松洗去未被吞噬或仅与MDM接触的感染红细胞（iRBC）。这一优势不适用于悬浮培养的树突状细胞和单核细胞，因其难以有效分离未感染红细胞（uRBC）和游离的iRBC，我们目前正在解决这一问题。该系统还可用于研究更复杂的相互作用，例如 疟原虫-暴露的单核细胞来源细胞在共培养实验中对其他免疫细胞（如CD4阳性T细胞）中HIV-1病毒周期的影响。最后，本方案可能适用于研究以下方面的实验： P. falciparum iRBCs 对 HIV-1 感染者外周血单个核细胞中 HIV-1 再激活的影响
伦理声明
人外周血单个核细胞（PBMC）来自健康供血者的血液，采集过程遵循拉瓦尔大学医疗中心研究中心生物伦理委员会的指南。所有献血者均签署了书面知情同意书。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>MultiCell</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS（无内毒素）</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>56 &amp;deg;C 水浴 30 分钟灭活</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBiosciences</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td>溶于 RPMI 1640 培养基，过滤除菌</td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>MultiCell</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>白色发光检测板</td><td>Promega</td><td>Z3291</td><td></td></tr><tr><td>CS MACS 分离柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>VarioMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀（25 cm）</td><td>Sarstedt</td><td>83.1830</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>150 × 20 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.1803.003</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Genscript</td><td>Z02001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>人 AB+ 型血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-505-CL</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>人红细胞</td><td></td><td></td><td>从 CHUL 血库获得纯化样品。</td></tr></tbody></table>

一种用于研究人类原代单核细胞来源免疫细胞中plasmodium falciparum与hiv-1相互作用的体外共感染模型

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum 是最致命疟疾类型的致病原，而人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是全球最重要的健康问题之一，每年共导致约400万人死亡1。由于这两种病原体在发展中国家，尤其是撒哈拉以南非洲地区广泛重叠，疟疾与HIV-1的共感染十分常见，但两者之间的相互作用尚不明确。流行病学报告表明，疟疾感染会短暂增强HIV-1的复制，并提高共感染个体体内的HIV-1病毒载量2,3。由于这种病毒血症在使用抗疟药物治疗后仍会持续数周处于高水平，这一现象可能对疾病进展和传播产生影响。
这些观察结果背后的细胞免疫学机制迄今研究甚少。少数 体外 研究疟疾对HIV-1影响的实验表明，暴露于可溶性疟原虫抗原可增强免疫细胞中HIV-1的感染和再激活。然而，这些研究使用了全细胞提取物 P. falciparum 裂殖体阶段的疟原虫与外周血单个核细胞（PBMC），使得难以明确产生观察到的效应的具体疟原虫成分以及靶向的宿主细胞是哪些4,5最近的研究表明，将未成熟的单核细胞来源的树突状细胞暴露于疟疾色素疟色素（hemozoin）可增强其将 HIV-1 传递给 CD4+ T 细胞的能力6,7，但其降低了HIV-1对巨噬细胞的感染8为阐明这一复杂过程，迫切需要对疟原虫与HIV-1在不同相关的人类原代细胞群体中的相互作用进行系统性分析。
已有多种技术用于研究 HIV-1 对微生物吞噬作用的影响，以及此类病原体对 HIV-1 复制的影响。本文介绍一种方法，用于研究恶性疟原虫（P. falciparum）感染的红细胞对人原代单核细胞来源巨噬细胞中 HIV-1 复制的影响。通过使用单周期假型病毒来监测寄生虫暴露对 HIV-1 转录/翻译事件的影响，其中荧光素酶报告基因取代了 Env 基因；而通过 ELISA 检测细胞上清液中 HIV-1 衣壳蛋白 p24 的含量，来确定感染巨噬细胞释放病毒量的变化。

我们已经开发出一种 体外 疟疾-HIV-1 共感染模型用于研究其影响 恶性疟原虫 在人原代单核细胞来源的巨噬细胞中研究HIV-1复制周期。该多功能系统可轻松适用于其他易感HIV-1感染的原代细胞类型。

一种用于研究人类原代单核细胞来源免疫细胞中Plasmodium falciparum与HIV-1相互作用的体外共感染模型

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是导致最严重疟疾类型的病原体，与人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）同属最重要的……

本实验的总体目标是建立一种体外模型，用于研究恶性疟原虫感染的红细胞对人类原代单核细胞来源巨噬细胞中HIV-1复制的影响。该目标通过以下步骤实现：首先利用VEAC系统分离恶性疟原虫感染的红细胞，然后将人类单核细胞来源的巨噬细胞暴露于这些感染的红细胞中。随后，将经红细胞处理的单核细胞来源巨噬细胞感染具有完全复制能力的HIV或编码荧光素酶的单周期HIV。最后，在感染后第3、6、9和12天收集完全复制型病毒及编码荧光素酶病毒的培养上清。感染细胞在感染后72小时被裂解。最终，可通过ELISA定量上清液中的HIV-1 p24衣壳蛋白来监测病毒复制水平，同时通过检测细胞裂解物中荧光素酶的含量来监测病毒转录活性。该方法有助于解答疟疾与艾滋病病毒共感染领域的关键问题。例如，疟原虫感染如何影响艾滋病病毒的复制？尽管该方法最初是为了研究疟原虫与艾滋病病毒在巨噬细胞中的相互作用而开发，但也可应用于其他细胞类型。例如，展示该操作的树突状细胞、单核细胞或 CD4 T 细胞将由 Guadalupe Andreani 提供。实验室的一名博士后研究员。首先从培养板中收获红细胞，用 10 毫升单核细胞来源的巨噬细胞培养基洗涤回收的细胞，然后将细胞沉淀重悬于 12 毫升单核细胞来源的巨噬细胞培养基中。随后，缓慢将细胞悬液加入 Milton ECS 柱中，在用新鲜培养基洗涤柱子一次后，让悬液流过，然后将其从磁铁上取下，并用 12 毫升单核细胞来源的巨噬细胞培养基冲洗。让培养基流经层析柱，将感染的红细胞洗脱至无菌管中，以便使单核细胞来源的巨噬细胞接触感染或未感染的红细胞。将适当体积的红细胞悬液分别加入已预先准备好的24孔板各孔中，该24孔板内含有单核细胞来源的巨噬细胞。将共培养体系在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。4小时后，移除含有红细胞的培养基，然后每孔轻轻加入600微升无内毒素的PBS，洗涤3次，每次洗涤后立即吸除PBS。现在向每个孔加入 200 微升冰上预冷的无菌水，以裂解红细胞，20 秒后吸弃液体。随后向每个孔加入 600 微升单核细胞来源巨噬细胞培养基，将培养物在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。为评估疟原虫假配子体对人免疫缺陷病毒 1 型在单核细胞来源巨噬细胞中复制的影响，向相应的孔中加入含 NL4-3 HIV-1 病毒 P24 的 300 微升单核细胞来源巨噬细胞培养基，操作步骤如本图所示。共培养孵育2小时后，用600微升无内毒素PBS洗涤细胞3次。然后向每孔加入600微升新鲜的单核细胞来源巨噬细胞培养基，在初始病毒感染后的第3、6、9和12天继续孵育共培养体系，收集每孔200微升上清液，并用200微升新鲜单核细胞来源巨噬细胞培养基替换所回收的细胞悬液。此后将收集的上清液于-20摄氏度保存，用于后续ELISA分析。为了确定寄生虫对单核细胞来源的巨噬细胞中HIV一个基因表达的影响，向含有目标荧光素酶ENC包被病毒P24的300微升单核细胞来源巨噬细胞培养基中加入相应的孔中，操作步骤类似于此处所示方案。按照前述非荧光素酶ENC包被病毒的方法孵育并洗涤共培养物后，在感染后72小时移除培养基，加入200微升荧光素酶检测试剂。立即加入裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡使细胞裂解，随后将共培养物置于-20摄氏度保存。解冻后，将每个孔中的 40 微升裂解液转移至 96 孔化学发光仪板中对应的孔。然后向每个孔加入 100 微升荧光素酶检测试剂盒中的荧光素酶底物。最后在化学发光仪中测定萤火虫荧光素酶活性。根据本实验的制造商说明，将单核细胞来源的巨噬细胞暴露于感染或未感染的红细胞中，随后用NL4-3-luc病毒感染。如上所述，通过ELISA检测无细胞上清液中HIV-1 P24的病毒蛋白P24，在初始病毒感染后的不同时间点监测其产生情况。请注意，在第12天，经寄生虫预处理的单核细胞来源巨噬细胞上清液中，以HIV-1 P24衣壳蛋白为指标检测到的病毒颗粒释放量显著减少。在本实验中，将单核细胞来源的巨噬细胞暴露于感染和未感染的红细胞，随后用编码荧光素酶的病毒进行感染，操作如前所述。在初次病毒感染后72小时，检测细胞裂解液中的荧光素酶表达。结果显示，当单核细胞来源的巨噬细胞感染携带外源性VSV-G或HIV-1糖蛋白的病毒时，暴露于恶性疟原虫（P. falciparum）感染红细胞的细胞中荧光素酶的产生显著减少。值得注意的是，与JRFL假型病毒相比，VSV-G假型病毒产生的荧光素酶活性更高，这是由于VSV-G假型病毒颗粒具有更高的感染效率。该技术将使疟疾与HIV共感染领域的研究人员能够在一种适用于多种免疫细胞类型研究的体外模型中，探索这两种病原体之间的相互作用。

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一个<em&gt;在体外</em&gt;共感染模型研究<em&gt;恶性疟原虫</em人原发性单核细胞源性的免疫细胞-HIV-1相互作用

本文描述了一种用于脑型疟疾寄生虫滞留的体外模型1。恶性疟原虫感染的红细胞被筛选以结合永生化的人脑微血管内皮细胞。筛选获得的寄生虫表现出独特的表型。该筛选方法可应用于多种P.

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