Name: 定量，实时分析，利用分子信标病变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学习利用分子信标实时定量检测细胞核裂解液中的DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性。该方法适用于动力学分析，可量化多种生物样本中的碱基切除修复活性，为癌症生物学研究提供可靠工具。

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本研究获得了匹兹堡基金会和美国国立卫生研究院（NIH）[GM087798；CA148629；ES019498] 向 RWS 提供的资助。美国国立卫生研究院的癌症中心支持拨款 [P30 CA047904] 为 UPCI 慢病毒设施向 RWS 提供了支持。匹兹堡大学药理学与化学生物学系向 DS 提供了资助。ESTRO 向 CV 提供了支持。

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS 是Trevigen, Inc.的科学顾问。其余作者声明不存在利益冲突。

已有超过600篇文献引用“分子信标”这一术语，用于检测和定量多种分子及酶活性，包括解旋酶活性6、DNA聚合酶活性7,8、DNA连接酶活性9、端粒酶活性10、DNA光解酶活性11以及DNA/RNA杂交体12等。除了将分子信标用于上述DNA修复活性的检测外，我们及其他研究者已证明这些探针在分析碱基切除修复（BER）活性方面的有效性1,2,13-15。
本文所述的实时碱基切除修复（BER）活性检测方法包含一个单一修饰碱基，可对不同损伤或损伤对侧碱基的改变进行BER速率的定量评估。该方法的应用范围可从分子机制研究扩展至抑制剂筛选。我们通过比较MPG表达细胞与非表达细胞的裂解液以及对照分子信标的无活性状态，验证了BER的特异性。该检测方法具有高灵敏度，能够检测BER蛋白MPG2或XRCC11表达缺陷，并足以检测DNA修复动力学参数的微小变化以及DNA修复抑制剂的效果[论文在准备中]。在主动修复过程...

<table><tbody><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>分子级</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>分子级</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-盐</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma</td><td>17-8</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;M 滤膜</td><td>Nalgene</td><td>167-0020</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析产品</td><td>Pierce</td><td>66373</td><td>分子量截留值 7000</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Fisher</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>黑色</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>NucBuster 蛋白提取试剂盒</td><td>Calbiochem</td><td>71183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>分子信标</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad 蛋白检测试剂染料浓缩液</td><td>BioRad</td><td>Cat# 500-0006</td><td></td></tr></tbody></table>

利用损伤特异性分子信标对细胞裂解液中碱基切除修复活性进行定量实时分析

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

本文介绍一种利用碱基切除修复（BER）分子信标，在细胞核裂解液中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时测量的方法。该方法的底物（信标）由一条脱氧寡核苷酸构成，其中包含一个单一碱基损伤，寡核苷酸5'端连接6-羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。BER分子信标全长43个碱基，其序列设计可促进形成茎环结构，其中环部含13个核苷酸，茎部含15个碱基对1,2。当该信标折叠成此构象时，6-FAM基团通过荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）被Dabcyl有效淬灭，不产生荧光3,4。碱基损伤的位置设计使得在损伤碱基被切除并发生链断裂后，残留的含6-FAM的5碱基寡核苷酸从茎结构中释放。该片段脱离淬灭剂（Dabcyl）后，荧光信号增强，其强度与DNA修复水平成正比。通过连续采集荧光值，可实现对BER活性的实时评估。利用常规的定量实时PCR仪器，可同时分析多个样品。此类含单一碱基损伤的BER分子信标设计适用于动力学分析、BER活性定量及抑制剂验证，并可适用于组织和肿瘤细胞裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量检测。使用这些分子信标检测肿瘤裂解液或组织抽吸物中的BER活性，可能适用于功能生物标志物的测定。此外，利用该定量检测方法对纯化蛋白的BER活性进行分析，可为BER抑制剂的发现与验证提供一种快速、高通量的技术手段。

我们描述了一种用于定量、实时测量细胞核裂解液中DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性的方法。该检测方法可获得适用于动力学分析的DNA修复活性速率，并可适用于组织和肿瘤裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量分析。

我们描述了一种利用碱基……在细胞核裂解物中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时测量的方法。

以下实验的总体目标是利用分子信标实时测量DNA修复速率和细胞核提取物的活性，这些分子信标在被修复后会发出荧光。碱基切除修复分子信标由脱氧寡核苷酸组成，呈茎环结构，包含一个单碱基损伤，其5'端连接六个羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。当分子信标折叠时，6-FAM的荧光通过Dabcyl以荧光共振能量转移（FRET）的方式被淬灭，从而不产生荧光。为了评估DNA修复活性，将信标探针与含有修复酶的细胞核提取物共同孵育。DNA糖基化酶识别并切除信标探针中的DNA损伤位点。所产生的无碱基位点（ABA）可作为AP内切酶1（APE1）的底物。APE1识别后在ABA位点处切割DNA骨架，使携带六羧基荧光素（FAM）的DNA片段从发夹结构中游离解离。脱离淬灭剂后，荧光信号增强，其增强程度与DNA修复水平成正比，可通过定量实时PCR仪进行实时检测。修复DNA损伤的能力对每个细胞和每个生物体都至关重要。在众多细胞DNA修复通路中，碱基切除修复主要针对因氧化或化学损伤而产生的受损碱基。阐明可能影响碱基切除修复的各个细胞组分的作用，是我们实验室研究的主要目标之一。因此，准确而灵敏地测量DNA修复活性已成为我们实验室关注的重点。该检测方法能够提供此类数据。与现有的32PN标记结合凝胶电泳分析等方法相比，本技术的主要优势在于：无需使用放射性标记底物，可实时测量初级修复速率，且具有非常宽的动态范围。此外，该方法可利用多种不同的荧光团和/或碱基损伤来确定底物特异性。我们已证明，该检测方法在不同条件下均具有高度的定量性和灵敏性。这种碱基切除修复分子信标检测适用于动力学分析。该检测方法具有高灵敏度和高特异性，可实现准确的碱基切除修复定量，因此适用于修复抑制剂的筛选或验证。此外，该方法还可用于检测暗修复活性，并适用于组织及肿瘤细胞裂解液的功能性生物标志物测定。在设计用于本检测的分子信标时，可参考如下所示的长度为43个碱基的DNA寡核苷酸序列。效果良好。该DNA序列并非唯一，但必须能够形成发夹结构。如图所示，通过插入特定的碱基损伤（如尿嘧啶或四氢呋喃）可实现特异性。在距离5'端第六个位置，GC含量应至少为32%，且5'端不应放置GB碱基。5'端应连接六羧基荧光素（6-FAM），3'端应修饰以DABCYL。该序列将作为DNA修复蛋白的底物，以确保糖基化酶的结合与活性。选择损伤位置时，应确保其距离发夹结构和 DNA 末端有足够的空间。茎部或发夹双链区的长度应至少为 15 个碱基对。推荐的环长为 13 个碱基。对照分子信标应与实验用分子信标完全相同，唯一的区别是不含DNA损伤。因此，它不应被DNA修复酶识别。获得分子信标后，应进行质量评估，以确保这些信标在加热前不产生荧光。为了确定最佳的熔解温度，提取过程中的所有步骤都应在冰上或4摄氏度条件下进行。为确保蛋白质稳定性，实验前应预先冷却。每个样品需准备两个1升烧杯、透析缓冲液、透析装置、微量离心机、离心管、注射器和针头。标记15毫升锥形管并将其置于冰上。吸去细胞中的培养基，然后用7.5毫升预冷的PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，在每个培养皿中加入5毫升预冷的PBS，用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。将细胞转移至预冷的15毫升锥形管中，然后在4°C下以500 × g离心5分钟。离心后，吸去上清液，并通过与相同管中已知液体体积进行比较，估算细胞压积。再次离心管体1分钟，然后用移液器吸除残留的PBS。每50微升压紧细胞体积，用150微升核裂解提取试剂一重悬细胞沉淀。然后将重悬的细胞转移至预冷的1.5毫升离心管中，高速涡旋振荡15秒。涡旋后，将离心管置于冰上孵育5分钟，再涡旋振荡15秒，随后在4°C下以13,000 × g离心5分钟。离心后，移除并弃去含有胞质组分的上清液。将沉淀重悬于重悬液中，每50微升压紧细胞体积加入75微升Nuke Buster裂解试剂，并加入1微升100倍浓缩的蛋白酶抑制剂混合液和1微升100毫摩尔的DTT。高速涡旋振荡细胞15秒。冰上孵育5分钟，再高速涡旋振荡15秒，随后在4°C下以13,000 × g离心5分钟。离心后，用注射器将含有核蛋白的上清液转移至截留分子量为7,000的透析夹中。接着，将 500 微升 1 摩尔的 DTT 加入 500 毫升预冷的透析缓冲液中，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌透析裂解液 90 分钟。90 分钟后，将透析盒转移至含有 0.5 升预冷透析缓冲液（含 DTT）的第二个烧杯中，继续在 4 摄氏度下轻轻搅拌透析 90 分钟。透析完成后，由于蛋白浓度较高，提取物可能出现结晶。接下来，将新的注射器插入与注入样品时所用不同的端口，从透析盒中收集透析后的核蛋白溶液。在取出透析后的核蛋白溶液时，尽量包含外观浑浊的晶体物质。将样品分装至微量离心管中，每管20 µL，迅速在干冰上速冻，然后于-80°C保存，直至后续使用。按照随附文件所述方法测定蛋白质浓度并进行质量控制。进行分子信标实验时，将细胞裂解液解冻，并用含有1毫摩尔DTT的基础切除修复反应缓冲液稀释至每微升含2微克蛋白质；同时，用基础切除修复反应缓冲液将分子信标稀释至200微摩尔。由于定量实时PCR仪通常不作为荧光计使用，需更改定量实时PCR仪的运行程序，设置为在37摄氏度下每20秒采集一次数据，至少运行180个循环。然后在分子信标的最大荧光强度下，每20秒进行一次，共15个循环，以获取用于归一化的数据。将反应体系设为25 µL。接着使用应用生物系统软件在仪器上设置板型设计，选择标准曲线作为实验类型，并完成板布局。本表中展示了一个示例，该示例也可在随附文档中找到。不要向选作标准曲线的孔中添加任何物质。将基础切除修复反应缓冲液、DTT、细胞裂解液（浓度为每微升含2微克）以及本实验中使用的所有分子信标置于冰上。然后将DTT加入基础切口修复反应缓冲液中，使其终浓度为1毫摩尔。将含有DTT的15微升基础切口修复反应缓冲液移液至冰上预冷的适配光学Q-R-T-P-C-R板的每个孔中。接下来，根据板式布局，将信标探针移液至相应的孔中。每种裂解液与分子信标或对照的组合均应设置三个重复孔。最后，将稀释后的核裂解液每孔5 µL加入相应的孔中。需要注意的是，所有分子信标试剂应始终保持低温，且裂解液应在最后一步加入到孔板中。请注意，裂解液中含有具有活性的蛋白质，一旦将其移入反应混合物中，便会立即开始修复分子信标。因此，为尽量减少测量开始前发生的信标修复，保持所有试剂处于低温状态至关重要。待所有组分添加完毕后，用光学粘性封膜密封板板，并通过轻轻敲击板板进行混匀。然后使用离心机进行短暂的10秒快速离心，使离心后的溶液聚集在试管或孔板底部。将孔板放入定量实时PCR仪中，开始检测。检测完成后，最好以Excel格式导出原始数据，并按照随附文档中的说明进行数据分析。在完成必要的计算后，以散点图形式绘制归一化的荧光数据，横轴为时间（单位：秒），纵轴为FAM游离百分比，并标出相应的误差范围，以评估LN 4 28细胞及指定为LN 4 28 MPG的MPG过表达细胞系的核提取物的DNA修复活性和质量。本视频中描述的实验采用含有APE1底物四氢呋喃的分子信标作为阳性对照。如图所示，两种细胞系均表现出较强的APE1活性，表现为斜率陡峭，即针对MPG底物去除的DNA糖苷酶活性。在两种细胞系的核裂解液中均检测了次黄嘌呤（以HX表示）。每种裂解液分别使用碱基切除修复对照分子信标或碱基切除修复HX分子信标进行分析；对照信标中，LN 4 28显示为绿色，LN 4 28 MPG显示为紫色；对于次黄嘌呤信标亦同。LN 4 28 显示为蓝色，LN 4 28 MPG 显示为橙色。结果以 A：平均荧光单位和 B：归一化荧光表示。在每种细胞中均观察到荧光随时间增加，提示发生了 HX 修复。按照预期，裂解液与HX分子信标共同孵育。由橙色迹线指示的LN 4 28 MPG细胞系显示出更高的修复速率，表现为荧光信号积累更快，而亲本LN 4 28细胞系（MPG蛋白极低）则修复速率较低。因此，可通过细胞提取物实时测量特定修复蛋白对特定DNA损伤的修复速率，且非特异性DNA切割的背景信号极低。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计分子信标，并利用纯化的蛋白质或细胞裂解液来实时测量DNA修复速率。在分析过程中，必须评估动态范围和背景值，为此应设置对照反应，例如包含或不包含阳性与阴性对照信标的反应。考虑到孔与孔之间的变异性，建议将各孔的数据相对于输入值进行归一化处理。这些由熔解温度的更精细步骤决定。此外，加入其他染料（如ROX染料）可校正由移液误差或检测器差异所引起的变异。该技术使我们能够阐明个体介导的切除修复组分对整体修复活性与修复能力的影响。其灵敏度足以揭示微小的变化，而这些变化是传统方法无法检测到的。

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Biology

生物学

定量，实时分析，利用分子信标病​​变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动

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