Name: 定量，实时分析，利用分子信标病变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学习利用分子信标实时定量检测细胞核裂解液中的DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性。该方法适用于动力学分析，可量化多种生物样本中的碱基切除修复活性，为癌症生物学研究提供可靠工具。

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本研究获得了匹兹堡基金会和美国国立卫生研究院（NIH）[GM087798；CA148629；ES019498] 向 RWS 提供的资助。美国国立卫生研究院的癌症中心支持拨款 [P30 CA047904] 为 UPCI 慢病毒设施向 RWS 提供了支持。匹兹堡大学药理学与化学生物学系向 DS 提供了资助。ESTRO 向 CV 提供了支持。

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<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS 是Trevigen, Inc.的科学顾问。其余作者声明不存在利益冲突。

已有超过600篇文献引用“分子信标”这一术语，用于检测和定量多种分子及酶活性，包括解旋酶活性6、DNA聚合酶活性7,8、DNA连接酶活性9、端粒酶活性10、DNA光解酶活性11以及DNA/RNA杂交体12等。除了将分子信标用于上述DNA修复活性的检测外，我们及其他研究者已证明这些探针在分析碱基切除修复（BER）活性方面的有效性1,2,13-15。
本文所述的实时碱基切除修复（BER）活性检测方法包含一个单一修饰碱基，可对不同损伤或损伤对侧碱基的改变进行BER速率的定量评估。该方法的应用范围可从分子机制研究扩展至抑制剂筛选。我们通过比较MPG表达细胞与非表达细胞的裂解液以及对照分子信标的无活性状态，验证了BER的特异性。该检测方法具有高灵敏度，能够检测BER蛋白MPG2或XRCC11表达缺陷，并足以检测DNA修复动力学参数的微小变化以及DNA修复抑制剂的效果[论文在准备中]。在主动修复过程...

<table><tbody><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>分子级</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>分子级</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-盐</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma</td><td>17-8</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;M 滤膜</td><td>Nalgene</td><td>167-0020</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析产品</td><td>Pierce</td><td>66373</td><td>分子量截留值 7000</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Fisher</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>黑色</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>NucBuster 蛋白提取试剂盒</td><td>Calbiochem</td><td>71183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>分子信标</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad 蛋白检测试剂染料浓缩液</td><td>BioRad</td><td>Cat# 500-0006</td><td></td></tr></tbody></table>

利用损伤特异性分子信标对细胞裂解液中碱基切除修复活性进行定量实时分析

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

本文介绍一种利用碱基切除修复（BER）分子信标，在细胞核裂解液中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时测量的方法。该方法的底物（信标）由一条脱氧寡核苷酸构成，其中包含一个单一碱基损伤，寡核苷酸5'端连接6-羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。BER分子信标全长43个碱基，其序列设计可促进形成茎环结构，其中环部含13个核苷酸，茎部含15个碱基对1,2。当该信标折叠成此构象时，6-FAM基团通过荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）被Dabcyl有效淬灭，不产生荧光3,4。碱基损伤的位置设计使得在损伤碱基被切除并发生链断裂后，残留的含6-FAM的5碱基寡核苷酸从茎结构中释放。该片段脱离淬灭剂（Dabcyl）后，荧光信号增强，其强度与DNA修复水平成正比。通过连续采集荧光值，可实现对BER活性的实时评估。利用常规的定量实时PCR仪器，可同时分析多个样品。此类含单一碱基损伤的BER分子信标设计适用于动力学分析、BER活性定量及抑制剂验证，并可适用于组织和肿瘤细胞裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量检测。使用这些分子信标检测肿瘤裂解液或组织抽吸物中的BER活性，可能适用于功能生物标志物的测定。此外，利用该定量检测方法对纯化蛋白的BER活性进行分析，可为BER抑制剂的发现与验证提供一种快速、高通量的技术手段。

我们描述了一种用于定量、实时测量细胞核裂解液中DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性的方法。该检测方法可获得适用于动力学分析的DNA修复活性速率，并可适用于组织和肿瘤裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量分析。

我们描述了一种利用碱基……在细胞核裂解物中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时测量的方法。

以下实验的总体目标是利用分子信标实时测量DNA修复速率和细胞核提取物的活性，这些分子信标在被修复后会发出荧光。碱基切除修复分子信标由脱氧寡核苷酸组成，呈茎环结构，包含一个单碱基损伤，其5'端连接六个羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。当分子信标折叠时，6-FAM的荧光通过Dabcyl以荧光共振能量转移（FRET）的方式被淬灭，从而不产生荧光。为了评估DNA修复活性，将信标探针与含有修复酶的细胞核提取物共同孵育。DNA糖基化酶识别并切除信标探针中的DNA损伤位点。所产生的无碱基位点（ABA）可作为AP内切酶1（APE1）的底物。APE1识别后在ABA位点处切割DNA骨架，使携带六羧基荧光素（FAM）的DNA片段从发夹结构中游离解离。脱离淬灭剂后，荧光信号增强，其增强程度与DNA修复水平成正比，可通过定量实时PCR仪进行实时检测。修复DNA损伤的能力对每个细胞和每个生物体都至关重要。在众多细胞DNA修复通路中，碱基切除修复主要针对因氧化或化学损伤而产生的受损碱基。阐明可能影响碱基切除修复的各个细胞组分的作用，是我们实验室研究的主要目标之一。因此，准确而灵敏地测量DNA修复活性已成为我们实验室关注的重点。该检测方法能够提供此类数据。与现有的32PN标记结合凝胶电泳分析等方法相比，本技术的主要优势在于：无需使用放射性标记底物，可实时测量初级修复速率，且具有非常宽的动态范围。此外，该方法可利用多种不同的荧光团和/或碱基损伤来确定底物特异性。我们已证明，该检测方法在不同条件下均具有高度的定量性和灵敏性。这种碱基切除修复分子信标检测适用于动力学分析。该检测方法具有高灵敏度和高特异性，可实现准确的碱基切除修复定量，因此适用于修复抑制剂的筛选或验证。此外，该方法还可用于检测暗修复活性，并适用于组织及肿瘤细胞裂解液的功能性生物标志物测定。在设计用于本检测的分子信标时，可参考如下所示的长度为43个碱基的DNA寡核苷酸序列。效果良好。该DNA序列并非唯一，但必须能够形成发夹结构。如图所示，通过插入特定的碱基损伤（如尿嘧啶或四氢呋喃）可实现特异性。在距离5'端第六个位置，GC含量应至少为32%，且5'端不应放置GB碱基。5'端应连接六羧基荧光素（6-FAM），3'端应修饰以DABCYL。该序列将作为DNA修复蛋白的底物，以确保糖基化酶的结合与活性。选择损伤位置时，应确保其距离发夹结构和 DNA 末端有足够的空间。茎部或发夹双链区的长度应至少为 15 个碱基对。推荐的环长为 13 个碱基。对照分子信标应与实验用分子信标完全相同，唯一的区别是不含DNA损伤。因此，它不应被DNA修复酶识别。获得分子信标后，应进行质量评估，以确保这些信标在加热前不产生荧光。为了确定最佳的熔解温度，提取过程中的所有步骤都应在冰上或4摄氏度条件下进行。为确保蛋白质稳定性，实验前应预先冷却。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

定量，实时分析，利用分子信标病​​变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过...

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

本实验方案的目的是定量分析质粒DNA上特定DNA-蛋白质交联的修复情况。将含有损伤的质粒转染至受体哺乳动物细胞系中，并在转染后的多个时间点提取低分子量DNA。通过链特异性引物延伸结合qPCR方法，定量检测DNA修复动力学。...

一种简单、快速且可定量检测转染至哺乳动物细胞质粒上DNA-蛋白质交联修复的实验方法

采用高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合单核苷酸延伸策略，建立了一种无需标记和放射性同位素的DNA聚合酶校对及DNA修复检测方法。该检测方法在检测长度短于9个核苷酸的校对和修复片段时，表现出高度特异性、操作简便、快速且易于实施的特点。...

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文介绍了一种用于检测核酸代谢酶的实验方案，以连接酶、核酸酶和聚合酶为例进行了说明。该检测方法利用荧光标记和未标记的寡核苷酸，可组合形成模拟RNA和/或DNA损伤或通路中间体的双链结构，从而实现对酶活性特征的表征。...

利用修饰的合成寡核苷酸检测核酸代谢酶

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

学习利用分子信标实时定量检测细胞核裂解液中的DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性。该方法适用于动力学分析，可量化多种生物样本中的碱基切除修复活性，为癌症生物学研究提供可靠工具。

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