定量，实时分析，利用分子信标病变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动
2012年8月6日
我们描述了DNA糖基化酶和AP内切酶的活动，在核细胞裂解定量，实时测量的方法。该法产生服从动力学分析DNA修复活动率，是适应组织和肿瘤裂解物或纯化蛋白质的DNA修复能力的量化。
以下实验的总体目标是使用修复后发出荧光的分子信标实时测量 DNA 修复和细胞核提取物的速率。基本切除修复分子信标由茎环结构中的脱氧寡核苷酸组成，包含一个碱基损伤，其中六个弯曲的氧荧光素部分与五个主要末端偶联，dil moti 在折叠时与三个主要末端偶联。六家族 moty 通过 forester 共振能量转移以非荧光方式被 dab sil 淬灭。
为了评估 DNA 修复活性，将信标与含有修复酶的细胞核提取物一起孵育。DNA 糖基化物被识别并去除信标中的 DNA 损伤。所得的 ABA 位点是 AP 核酸内切酶 1 或 APE 1 的底物 识别后，APE one 会在 ABA 位点切割 DNA 骨架，使含有 6 个家族的 DNA 能够自由地从发夹上解离。
从淬灭基团分离会导致荧光增加，这与 DNA 修复水平成正比，并且可以使用定量实时 PCR 仪实时评估。修复 DNA 损伤的能力对每个细胞和每个生物体都至关重要。在众多的细胞 DNA 修复途径中，碱基切除修复靶标、可能由氧化或化学损伤引起的受损碱基阐明可能影响碱基切除修复的单个细胞元素的作用是我们实验室研究的主要目标之一。
因此，准确、灵敏地测量 DNA 修复活性已成为我们实验室的兴趣所在。该检测可以提供此类数据。与现有方法（如 32 PN 标记和凝胶电泳分析）相比，该技术的主要优点是我们的技术不使用放射性标记底物，可以实时测量修复率，并且具有非常大的动态范围。
此外，这种方法可以利用几种不同的荧光 4 和/或基底病变来确定底物特异性。我们已经表明，该测定在不同环境中具有高度定量且非常敏感。这种碱基切除修复分子信标测定适用于动力学分析。
该检测试剂盒的高灵敏度和特异性可实现准确的碱基切除修复定量，因此可用于修复抑制剂筛选或验证。此外，它还适用于测量 dary 修复活性以及组织和肿瘤细胞裂解物，用于功能性生物标志物测量。在设计用于该检测的分子信标时，请考虑以下长度为 43 个碱基的 DNA 寡核苷酸，如下所示。
好使。DNA 序列不是唯一的，但必须允许形成发夹结构。当跪着时，如图所示，通过插入特定的基底病变（如尿嘧啶或四氢弗林蛋白酶）来实现特异性。
在位置 X 距离 5 个主要端的 6 个碱基处，GC 含量应至少为 32%，并且不应将 GB 个碱基放置在 5 个主要端。六个羧基荧光素或 6 个 fam 应与 5 个主要端偶联，并且三个主要端应用 dab sil 修饰。这将是 DNA 修复蛋白的底物，以确保糖基释放的结合和活性。
选择病变的位置是为了从发夹结构和 DNA 末端提供足够的空间。茎或发夹双链的长度应至少为 15 个碱基对。推荐的环长为 13 个碱基。
对照分子信标应与实验分子信标相同，只是它不包含 DNA 损伤。因此，它不应被 DNA 修复酶识别。一旦拿到分子信标，就应该进行质量评估，以确保信标在加热之前不会发出荧光。
为了确定最佳融化温度，提取过程中的所有步骤都应在冰上或 4 摄氏度下进行。为确保蛋白质稳定性，请通过预冷却来准备实验。每个样品两个 1 L 烧杯、透析缓冲液透析室、微量离心机、试管、注射器和针头。
标记 15 毫升锥形管并将它们放在冰上。从细胞中吸出生长培养基，然后在第二次洗涤后用 7.5 毫升冷 PBS 洗涤两次。向每个培养皿中加入 5 毫升冷 PBS，并使用细胞提升器从板中刮下细胞。
将细胞转移至冷冻的 15 mL 锥形管中，然后在 4 摄氏度下以 500 倍 G 离心 5 分钟。旋转后，去除上清液，并通过将其与类似试管中已知体积的液体进行比较来估计填充细胞体积。将试管再离心一分钟，然后用移液管呼吸机去除剩余的 PBS。
将细胞沉淀悬浮在 150 μL 的 nuke buster 提取试剂中，每 50 μL 的填充细胞体积 1 个。然后将重悬的细胞转移到预冷的 1.5 mL 试管中，并高速涡旋 15 秒。涡旋后，将试管在冰上孵育 5 分钟，然后再涡旋 15 秒，并在 4 摄氏度下以 13， 000 倍 G 离心 5 分钟。
旋转后，去除并丢弃含有细胞质组分的上清液。Resus 将沉淀悬浮在 1 微升 resus 悬浮 100 x 蛋白酶抑制剂混合物、1 微升 100 毫摩尔 DTT 和 75 微升 nuke buster 提取的混合物中。每 50 μL 填充细胞体积使用试剂 2。
涡旋的细胞高速 15 秒。在冰上孵育 5 分钟，然后在 4 摄氏度下以 13， 000 倍 G 的高速离心机再次涡旋 15 秒 5 分钟。离心后，使用注射器将含有核蛋白的上清液转移到截留分子量为 7， 000 的载玻片透析盒中。
接下来，将 500 微升一摩尔 DTT 添加到 500 毫升预冷透析缓冲液中，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌裂解液透析 90 分钟。90 分钟后，将透析盒转移到第二个烧杯中，该烧杯中装有 0.5 升预冷透析缓冲液和 DTT 并进行透析。透析后，在 4 摄氏度下轻轻搅拌裂解液 90 分钟，提取物可能由于蛋白质浓度高而结晶。
接下来，将新注射器插入与注射盒不同的端口，并从透析盒中收集透析的核蛋白溶液。去除透析的核蛋白溶液时，尝试加入看起来浑浊的晶体。将样品分装到微量离心管中，每管 20 微升，在干冰上快速冷冻，然后储存在零下 80 摄氏度下，直到需要。
确定蛋白质浓度并按照随附文件中所述进行质量控制。为了进行分子信标测定，用含有 1 毫摩尔 DTT 的碱性顺式修复反应缓冲液将细胞裂解物稀释至每微升蛋白质 2 微克，用碱性切除修复反应缓冲液将分子信标稀释至 200 微摩尔。由于定量实时 PCR 机通常不用作荧光计，因此请更改定量实时 PCR 机的运行方法，以在 37 摄氏度下每 20 秒收集一次数据，持续至少 180 个循环。
然后每 20 秒在分子信标的最大荧光下进行 15 个循环，以获得归一化数据。将反应体积设置为 25 微升。然后使用 Applied Biosystem 软件在仪器上设置板设计，选择标准曲线作为实验类型，完成板布局。
此表中显示了一个示例，该示例也可以在随附的文档中找到。不要向选择为标准曲线的井中添加任何内容。将碱性切除修复反应缓冲液、DTT 细胞裂解物的浓度为每微升 2 微克，并将实验中使用的所有分子信标置于冰上。
然后将 DTT 添加到碱性切除修复反应缓冲液中，至终浓度为一根毫摩尔移液管。将 15 微升含 DTT 的基本切除修复反应缓冲液加入冰上兼容光学 Q-R-T-P-C-R 板的每个孔中。接下来，按照板布局，将信标移液到适当的孔中。
裂解物和分子信标或对照的每种组合应一式三份进行检测。最后，将每孔 5 微升稀释的细胞核裂解物移液到适当的孔中。请务必记住，将所有 molecular beacon 试剂保持低温，并在最后一步将裂解物移液到板中。
请记住，裂解物含有活性蛋白，一旦将它们移液到反应混合物中，它们就会开始修复分子信标。因此，在开始测量之前，将所有试剂保持低温以尽量减少信标修复量非常重要。添加完所有内容后，用光学胶膜密封板，然后轻轻敲击板进行混合。
然后用离心机快速旋转 10 秒，在旋转后在试管或板的底部收集溶液，将板插入定量实时 PCR 机，完成后开始检测，最好以 Excel 格式导出原始数据，并在进行必要的计算后按照随附文件中的说明分析数据。在散点图中将归一化荧光数据绘制为自由系数随时间的百分比（以秒为单位），并带有相应的误差，以评估来自 LN 4 28 细胞和指定为 LN 4 28 MPG 的 MPG 过表达细胞系的 DNA 修复活性和质量。本视频中描述的分析是使用含有 APE 单底物四弗林蛋白酶作为阳性对照的分子信标进行的。
如图所示，两种细胞系都具有强大的 APE one 活性，如陡峭的斜率所示，DNA 糖苷活性对去除 MPG 底物具有特异性。在两种细胞系的细胞核裂解物中测量表示为 HX 的次黄嘌呤。使用基本切除修复对照分子信标或碱基切除修复 HX 分子信标分析每种裂解物，对照信标 LN 4 28 以绿色显示，LN 4 28 MPG 为次脑信标以紫色显示。
LN 4 28 以蓝色显示，LN 4 28 MPG 以橙色显示。结果报告为 A 为平均荧光单位和 B 为归一化荧光。指示 HX 修复的荧光时间依赖性增加发生在每个细胞中。
裂解物按预期与 HX 分子信标一起孵育。橙色迹线指示的 LN 4 28 MPG 细胞系比 MPG 蛋白最少的亲本 LN 4 28 细胞系具有更快的荧光积累，这表明修复率要高得多。因此，可以从细胞提取物中实时测量特异性修复蛋白对特定 DNA 损伤的修复率，同时非特异性 DNA 切割的背景水平最低。
观看本视频后，您应该对如何使用纯化蛋白或细胞裂解物设计分子信标和测量实时 DNA 修复率有很好的了解。在分析方面，必须评估动态范围和背景值，通过包含对照反应（例如有或没有阳性和阴性对照信标）来实现。考虑到井间的可变性，将各个井中的数据归一化为输入值非常有用。
这些是由熔化温度下的更精细步骤决定的。这以及包含其他染料（如岩石模具）将解释检测器中移液错误或差异所固有的可变性。这项技术使我们能够阐明基于个体的切除修复成分对整体修复活性和能力的影响。
它足够灵敏，可以揭示传统方法无法检测到的微小变化。
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概述
本研究提出了一种在细胞核裂解物中实时测量DNA糖基化酶和AP内切酶活性的方法。该测定法旨在进行动力学分析，可以适用于定量分析各种生物样品中的DNA修复活性。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA修复机制
- 细胞生物化学
- 分子生物学技术
背景
- DNA修复对于维护基因组完整性至关重要。
- 糖基化酶和AP内切酶在碱基切除修复中扮演关键角色。
- 使用分子信标可以实时监测修复过程。
- 理解这些机制可以帮助癌症研究和治疗开发。
研究目的
- 开发一个定量测定法来测量DNA修复活性。
- 利用分子信标进行修复酶活性的实时检测。
- 提供一个适用于各种生物样品的方法。
使用的方法
- 设计具有特定荧光特性的分子信标。
- 将信标与含有修复酶的细胞核提取物孵育。
- 通过实时荧光测量来评估DNA修复活性。
- 基于荧光变化对修复过程进行动力学分析。
主要结果
- 该测定法成功测量了DNA糖基化酶和AP内切酶活性。
- 实时数据提供了对DNA修复动力学的洞察。
- 该方法可适用于组织和肿瘤裂解物。
- 修复活性的定量可以增强对DNA损伤反应的理解。
结论
- 该方法为研究DNA修复机制提供了一种可靠的方法。
- 实时分析可以促进癌症生物学和治疗研究。
- 未来的应用可能包括修复抑制剂的高通量筛选。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables real-time, quantitative assessment of base excision repair (BER) activity in cell lysates, providing a functional readout of DNA repair capacity. By measuring glycosylase and AP endonuclease kinetics without radioactive labels, it supports target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. The assay’s adaptability to tumor lysates and purified proteins facilitates biomarker development and inhibitor screening, aligning with preclinical de-risking strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures lesion-specific DNA glycosylase and AP endonuclease activities to validate functional target engagement in BER pathways.
- Operational Value: Enables real-time kinetic analysis of repair enzyme activity in nuclear lysates, supporting hypothesis-driven target interrogation.
- Predictive Value: Quantifies repair capacity to de-risk mechanistic assumptions about DNA damage response in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses lesion-specific molecular beacons to determine substrate specificity and enzyme selectivity for BER targets.
- Operational Value: Compatible with quantitative real-time PCR instruments for high-throughput, multiplexed analysis of repair activity across samples.
- Assay Readiness: Generates proportional fluorescence signals upon lesion excision and strand scission, enabling quantitative, real-time monitoring of BER kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Adaptable for measuring BER activity in tumor lysates and tissue aspirates to support functional biomarker measurements.
- Preclinical Continuity: Supports inhibitor validation screens using purified proteins or cell extracts to assess compound effects on DNA repair.
- Risk Mitigation: Provides sensitivity to detect small changes in repair activity undetectable by conventional methods, enhancing predictive confidence in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy, particularly for compounds modulating DNA damage response or genomic stability.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying BER pathway activity and isolating contributions of specific repair enzymes like glycosylases and AP endonucleases.
- Screening: Enables high-throughput screening of BER inhibitors using purified proteins or cell lysates with real-time fluorescence readouts.
- Analytics: Generates kinetic data and normalized fluorescence outputs (percent free FAM over time) to compare repair rates across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling functional assessment of BER capacity in tumor lysates as a potential pharmacodynamic biomarker.
- Enterprise Reuse: Standardized beacon design and qPCR-compatible format allow reuse across projects targeting DNA repair mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, real-time measurement of lesion-specific DNA repair.
- Operational Value: Eliminates need for radioactive labeling, reduces assay time, and offers a large dynamic range for detecting repair activity across diverse samples.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on DNA repair capacity and genomic stability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of BER-modulating compounds through mechanistic biomarker data from disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular beacon design, including stem-loop structure optimization and lesion placement for specific glycosylase or AP endonuclease targeting.
- Dependent on access to quantitative real-time PCR instruments capable of fluorescence detection at 37°C over 180+ cycles.
- Necessitates standardized nuclear lysate preparation protocols to preserve repair enzyme activity and minimize proteolytic degradation.
- Requires inclusion of control beacons (lesion-free) to distinguish specific repair from background signal and normalize for well-to-well variability.
- Adaptation across model systems depends on maintaining beacon stability and quenching efficiency in varying lysate compositions.
