Name: 片上内皮炎症表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-21T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学习利用微流控芯片技术表征人主动脉内皮细胞的炎症状态，通过TNF-α诱导和差异剪切应力处理，实时观察单核细胞THP-1的黏附动态。该方法为研究血管炎症和动脉粥样硬化机制提供了精确的体外实验平台。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）资助，资助号为 R01 HL082689，授予 Scott I. Simon 和 Anthony G. Passerini。

1. 细胞培养与基质制备
 <ol>
 <li>使用车床从100 × 20 mm组织培养皿（BD Falcon）上切割出3英寸的圆形基底。将基底浸入70%乙醇中进行灭菌。置于培养皿中，加入4 ml I型胶原蛋白（100 μg/ml），室温孵育1小时，然后用4 ml 1 × PBS冲洗。</li>
 <li>将人主动脉内皮细胞（HAEC，第4-6代）重悬于6.5×105 个细胞/ml，取1 ml直接接种至基底上。置于37 °C、5% CO2培养箱中，使细胞贴附基底1小时。</li>
 <li>向细胞中加入9 ml内皮细胞生长培养基-2（EGM-2），并添加1×抗生素-抗真菌溶液。每2天更换一次培养基，直至细胞达到90%融合度。</li>
 <li>将THP-1细胞维持在添加10%胎牛血清和1×抗生素-抗真菌溶液的RPMI 1640培养基中。当细胞密度达到106 个细胞/ml时进行传代。</li>
</ol>
2. 细胞剪切实验方案
细胞在定制的锥板式细胞剪切装置（CSD）中进行处理。该装置的详细信息和设计参数见表1和图4。
<ol>
 <li>准备CSD。用乙醇对腔室外壳进行灭菌，并用无菌PBS冲洗。将外壳加热至37 °C并调平，以确保锥体垂直于细胞单层。从外壳底部组装带有细胞的基底，并将锥体调节至所需高度。</li>
 <li>使用添加了内皮细胞BulletKit的Leibovitz-15（L-15）培养基作为剪切介质，以在无CO2条件下维持适当的pH值。为诱导炎症反应，在剪切介质中加入肿瘤坏死因子-α（TNF-α，0.5 ng/ml），并通过连接至进样口的注射器向装置中注入6 ml液体，注意避免将气泡引入腔室。</li>
 <li>对细胞施加高幅稳态剪切应力（HSS，15 dyne/cm2）或振荡剪切应力（OSS，0 ± 5 dyne/cm2，1 Hz），持续4小时。通过旋转细胞上方的锥体实现目标剪切应力（SS），该过程由微步进电机精确控制，具体方法如前所述6。表面壁面剪切应力（τw）可近似表示为：
 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="流体动力学公式：τw = μω/α，表示流体流动系统中剪切应力的方程" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式1">
 
其中μ为培养基的黏度，ω为锥体的角速度，α为锥体角度（0.5°）。通过精密调平将锥体与基底的对准误差控制在0.05°以内，并使用深度规将间隙高度设定为20 ± 10 μm，以最小化τw的周向和径向变化。该装置已通过验证，确保具备层流流动特性。实验结束后从装置中取出细胞，准备进行单核细胞黏附分析。</li>
</ol>
3. PDMS 微流控腔室的制备
<ol>
 <li>根据应用需求获取所需微流控通道数量和通道高度的主模具。本方案所用特定设计的参数详见表1。此类模具的制备方法在文献中已有详尽记载1。简而言之，使用CAD软件（Autodesk Inventor）设计通道网络，并以5000 dpi的分辨率打印至透明胶片上。将负性光刻胶（SU8）以100 μm的厚度旋涂于硅片表面，再将透明胶片覆盖其上并进行紫外光曝光。去除未聚合的光刻胶后，即可获得正型复制主模具。</li>
 <li>将硅胶基体与硅胶固化剂按10:1的质量比在称量皿中混合，用5 ml移液管搅拌均匀。搅拌时注意避免刮擦称量皿内壁，以防将塑料碎屑混入溶液中。</li>
 <li>将主模具硅片置于100×15 mm的培养皿中，随后将PDMS溶液倒入培养皿内。</li>
 <li>盖上培养皿，放入真空容器中抽气15分钟以去除气泡。15分钟后取出培养皿，轻轻向表面吹气以除去残留的多余气泡。</li>
 <li>将培养皿放入70 °C烘箱中加热1小时进行固化。取出后用锋利刀片切割出微流控腔室。</li>
</ol>
4. 在显微镜上组装装置
<ol>
 <li>打开倒置显微镜的光源，并将加热器设置为 37 °C。将管路连接至 10 ml 注射器，并用蒸馏水充满注射器，确保无气泡。将注射器放入注射泵中，并设定流速以产生 1 dyne/cm2 的管壁剪切应力。通道中心线处产生的管壁剪切应力（τw）可通过平行板流动腔的标准公式近似计算： 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="剪切应力公式 τw=6μQ/h²w；流体动力学公式；用于教学。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"> 
其中 μ 为培养基的黏度，Q 为体积流速，h 为通道高度，w 为通道宽度。注意：由于通道具有有限宽度，实际的 τw 会随 w 变化，具体取决于通道的宽高比，因此应避免在靠近侧壁 25% 的区域内进行测量。1,7</li>
 <li>将 PDMS 腔室浸入水中，并使用 100 μl 微量移液器从各个通道中去除空气。将真空接头连接至腔室，并确保阀门处于关闭状态。</li>
 <li>将含有 HAEC 单层细胞的培养皿置于物镜上方。将 PDMS 腔室放置在培养皿上，并小心地将其置于 HAEC 单层细胞上，确保装置与单层细胞之间不产生气泡。旋转阀门，使真空开启，从而牢固固定腔室。</li>
 <li>将 19 号针头磨钝，使其仅保留 5 mm 的金属部分。用缓冲液填充塑料储液器，并插入 PDMS 腔室的入口。根据所需使用的通道数量重复此操作。将注射泵的管路连接至 PDMS 腔室的出口。</li>
</ol>
5. 剪切应力条件下的单核细胞黏附实验
<ol>
 <li>将THP-1细胞以2×106个细胞/ml的浓度悬浮于含Ca2+/Mg2+和0.1% HSA的HBSS中。通过在室温下用基质细胞衍生因子-1（SDF-1，50 μg/ml）孵育15分钟来激活THP-1细胞。</li>
 <li>启动注射泵以建立流动，然后将50 μl细胞悬液加入储液池中，避免引入气泡。待流动完全稳定后，开始数据采集。</li>
 <li>以适当的流速运行5分钟，若储液池中液体量减少，可补充缓冲液。持续向通道中流入缓冲液，以冲洗流路中未结合的细胞。</li>
</ol>
6. 数据采集与分析
<ol>
 <li>以每秒3帧的速率，在通道内沿轴向流动完全发展后的3个位置，各采集2分钟的数字图像序列，注意避免在入口或出口端口附近，以及侧壁最近25%的区域内进行记录。 </li>
 <li>通过在与单层细胞相同的焦平面上识别其相位明亮的外观，计数每个视野中停滞的细胞数量。 </li>
 <li>牢固的细胞停滞由运动状态定义 &lt; 10 秒内移动半个细胞直径。使用 ImageJ 软件对每个通道的 3 个随机视野进行平均数据测量与定量分析。</li>
</ol>
7. 代表性结果
尽管血管内皮普遍暴露于可导致全身性炎症的激动剂，动脉粥样硬化却是一种局灶性疾病，优先在动脉血流紊乱的部位发生，提示内皮功能存在空间异质性。8 在代谢应激状态下，人血清中循环的炎症介质（如 TNF-α）水平升高，并与内皮功能受损相关。9, 10 TNF-α 可诱导内皮细胞产生特征明确的反应，包括上调细胞黏附分子（CAMs；如 VCAM-1、ICAM-1、E-选择素）和趋化因子，从而募集循环中的单核细胞，这是早期动脉粥样硬化病变的典型特征。11 血流动力学是内皮细胞炎症表型的重要调控因素。12 高幅度剪切应力（HSS；例如 15 dynes/cm2）或脉动剪切应力（PSS；例如 15 ± 5 dynes/cm2）与动脉中抗动脉粥样硬化位点相关，可下调TNF-α诱导的反应。相反，低幅剪切应力（LSS；例如 2 dynes/cm²）2）或振荡剪切（OSS；例如 0 ± 5 dynes/cm2），易感位点的特征 体内，加剧细胞因子诱导的炎症。13, 14 我们的微流控PDMS装置为开展机制性研究提供了平台，可用于检验代谢应激与流体动力学因素叠加在调控内皮功能及病理过程中的相关假说。以下代表性结果充分展示了该方法的实用性与多功能性。 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="THP-1 细胞黏附分析、细胞培养图像、比较 HSS 和 OSS 的柱状图，p 值为 0.023。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 剪切应力差异性调控 THP-1 细胞对 TNF-α 炎症刺激的内皮单层细胞的黏附。 这些数据是使用上述详细方案并在视频中记录的方法获得的。人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在自制的 CSD 装置中，同时暴露于低剂量炎症细胞因子 TNF-α（0.5 ng/ml，约为 VCAM-1 上调的 ~EC50）以及高剪切应力（HSS，15 dynes/cm2）或振荡剪切应力（OSS，0 ± 5 dynes/cm2，1 Hz）条件下，持续 4 小时，具体操作如详细方案所述。THP-1 细胞在剪切流条件下于 PDMS 流动腔室中进行黏附定量分析。该细胞系可模拟人单核细胞表型，因其可重复性好且易于操作而被选用。与 OSS 相比，HSS 减弱了炎症反应，导致 THP-1 细胞黏附减少。数据采用 Student t 检验进行分析，表示为 3 次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）。经 DeVerse 等人许可改编。5
以下数据通过我们已发表工作的实例，展示了本方法的多功能性。适用时已注明对上述方案的偏离之处。
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="剪切应力对微通道装置中VCAM-1表达的影响；图表显示应力-反应数据。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 在剪切应力梯度下细胞因子诱导的VCAM-1表达及单核细胞募集的调控。A） 人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在VMMC装置中受到TNF-α（0.3 ng/mL）刺激4小时，该装置基于Hele-Shaw流动理论设计15。通过将腔室侧壁设计为与二维驻点流的流线重合，并将通道末端形状设计为与等势线匹配，从而在通道中心线上实现剪切应力（SS）大小的线性递减。在距入口轴向距离（x）处，该通道中心线上的壁面剪切应力（τw）由以下公式给出：
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="流体动力学方程；壁面剪切应力公式；科学分析；τw=6μQ/h²w₁(1-x/L)；方程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 3"> 

其中 μ is 培养基的黏度， Q 是体积流量， h 是通道高度， w1 是通道入口的宽度，以及 L 为总通道长度。 Q 被选用来产生从16 dynes/cm的SS强度梯度2 从入口处到出口近端的驻点“a”，压力由入口处的0逐渐变化。 B)-C) VCAM-1 表达水平被测定 原位 通过使用与量子点偶联的抗体进行免疫荧光显微镜检测，并以未刺激静态对照的百分比中位荧光强度（MFI）表示。SS 对 VCAM-1 的基础水平无调节作用，在未刺激的 HAEC 中该水平较低（灰色三角形）。然而，在 LSS 幅度下，VCAM-1 表达相对于 TNF-α 增加，并在约 2 dynes/cm² 时达到峰值2 并回到 TNF-α 基线水平或低于该水平的剪切力大小 &gt; 5 dynes/cm2 （黑色方块） D) 单核细胞（106/ml）以 2 dynes/cm 的速率灌注2 在经预处理的单层细胞上，于平行流通道中持续5分钟 A)单核细胞向内皮的募集数量与特定剪切应力水平下VCAM-1的表达呈定量相关。值得注意的是，在单层细胞中以高空间分辨率检测VCAM-1表达和单核细胞募集的能力，揭示了剪切应力（SS）幅度在较窄范围内变化时所引起的显著差异，而若仅在独立实验中施加少数离散的剪切应力值，则难以察觉此类变化。数据采用重复测量方差分析（ANOVA）进行分析，并通过Newman-Keuls事后检验评估差异，*P &lt; 在静态条件下，TNF-α 的值为 0.05。数据来自 3–6 次独立实验，表示为均值 ± 标准误。 经 Tsou 等人许可改编2
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="单核细胞黏附与VCAM-1表达关系图及柱状图；TNFα作用分析，统计学数据。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）对细胞因子诱导的炎症反应的调节作用与供体血清甘油三酯水平及VCAM-1表达呈正相关。 人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在静态培养条件下，同时用TNF-α（0.3 ng/mL）刺激4小时，并加入来自高脂餐后人体受试者的TGRL（10 mg/dL ApoB）。A) 采用流式细胞术分别测定悬浮内皮细胞中的VCAM-1表达水平，并按照详细实验方案所述使用VMMC定量单核细胞黏附。数据以相对于TNF-α处理组的百分比变化表示。单核细胞黏附程度与内皮细胞VCAM-1表达呈正比，且随供体血清甘油三酯水平升高而增加。B) 在存在VCAM-1阻断抗体的情况下，部分促炎性供体的单核细胞黏附被显著抑制。统计学显著性通过配对Student t检验确定，数据表示为3–5次独立实验的均值±标准误。经Wang等人许可改编。4

<ol><li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

我们描述了使用微流控PDMS装置，通过实时成像细胞黏附分子（CAM）表达和单核细胞黏附，来在芯片上评估内皮细胞炎症表型的方法。本方法的主要优势在于能够在模拟动脉粥样硬化血管中剪切应力的明确流体动力学条件下，定量分析内皮细胞在暴露于饮食性脂质和细胞因子等炎症介质后所出现的功能障碍相关结果。血管微流控芯片（VMMC）可显著减少试剂或材料的使用量，适用于样品有限的情况，同时具有成本低、可定制化以及适合高通量分析的额外优势。
使用微流控装置代表了一种替代传统宏观尺度方法的新途径，后者数十年来一直被用于研究培养的内皮细胞（EC）对剪切力的响应。这些传统方法包括平行板流动室、圆柱形管和锥板黏度计，每种方法均能施加稳定的层流泊肃叶流条件（综述见16）。对这些装置进行改进后，可产生随时间或空间变化的管壁剪切应力，甚至可重现动脉血流波形6。然而，总体而言，这些装置通常需要大量培养基，制造成本高，适应性较差，且通量相对较低。
使用VMMCs也存在一些局限性。这些装置的设计基于平行板流动理论，该理论假设通...

<table><tbody><tr><td>100 x 20 mm 培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>EMD Chemicals</td><td>EX0290-1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>I型大鼠尾部来源胶原蛋白</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>人主动脉内皮细胞</td><td>Genlantis</td><td>PH30405A</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞专用试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞基础培养基-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD Falcon</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯管</td><td>Tygon</td><td>ABW0001</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>11415-069</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体基础液</td><td>道康宁</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体固化剂</td><td>道康宁</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>SU8 光刻胶母片</td><td>加州大学戴维斯分校 Pan 实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE200 倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse TE200</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>PHD2000</td><td></td></tr><tr><td>19号皮下注射针头</td><td>Kendall</td><td>8881</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 单核细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>含钙汉克斯平衡盐溶液（HBSS, Hanks Buffered Saline Solution）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; </td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>肿瘤坏死因子α（TNF-α）&amp;alpha;)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA-010</td><td></td></tr><tr><td>基质细胞衍生因子-1（SDF-1）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白（HSA）</td><td>ZLB Behring</td><td>NDC 0053-7680-32</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表2. &lt;/strong&gt; 特定试剂与设备。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

芯片上内皮炎症表型分析

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

动脉粥样硬化形成因代谢异常而加剧，这些代谢异常可促进全身性炎症状态增强，进而导致内皮功能障碍。然而，临床上尚未直接评估内皮早期功能改变以反映个体风险水平，从而指导治疗策略。此外，局部血流动力学对炎症的调控作用导致动脉粥样硬化呈非随机的空间分布，但其机制尚不明确。 体内我们描述了一种 芯片实验室 基于定量分析人内皮细胞（EC）和单核细胞在精确流动条件下炎症事件的代谢扰动。采用软光刻常规方法进行微加工 血管模拟微流控腔室（VMMC），这些物质直接与培养的内皮细胞单层结合。1 这些装置具有使用试剂量少的优点，同时为直接成像暴露于明确定义剪切力场下的内皮细胞膜上的炎症事件提供了平台。我们已成功应用这些装置研究细胞因子诱导的2 脂质-3, 4 和RAGE诱导的5 人主动脉内皮细胞（HAEC）中的炎症反应。本文记录了使用VMMC检测单核细胞（THP-1）在不同剪切力条件下培养并经炎症细胞因子TNF-α激活的HAEC单层上的滚动与黏附。此类研究为代谢危险因素下动脉粥样硬化易感性的机制提供了深入见解。

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。

动脉粥样硬化因代谢异常而加剧，这些代谢异常可促进全身性炎症状态的增强，从而导致内皮功能障碍……

本视频的目的是演示一种用于表征内皮细胞炎症状态的芯片实验室技术。首先，将人主动脉内皮细胞在组织培养基质上培养至融合，然后将其插入锥板剪切装置（Conan板剪切装置）中。细胞用促炎性细胞因子TNF alpha处理，同时通过精确控制基质上方锥体的旋转，在四小时内施加不同的剪切应力条件。剪切应力可调节细胞对细胞因子的特征明确的炎症反应。这包括黏附分子（如 VCA 1 和 ICAM 1）的上调。将基底转移至显微镜载物台上，其中 A-P-D-M-S 微流控装置通过真空直接密封到单层细胞上，形成流动通道。将活化的单核样 THP-1 细胞流经预处理的 hs，其结合量与细胞黏附分子表达水平成正比。通过定量牢固黏附的 THP-1 细胞总数来确定内皮细胞的炎症状态。大家好，我是 She D Diverse，我是 Greg Foster，我是 Keith Bailey。我们位于加利福尼亚大学戴维斯分校生物医学工程系的教授、Pastor 和 Simon 的实验室。今天我们将介绍一种基于芯片实验室技术的方法，用于定量研究内皮功能障碍和炎症反应。这些工具为我们提供了研究代谢应激与流体动力学因素叠加作用的平台，可用于探讨内皮炎症表型的调控机制及其对动脉粥样硬化的易感性。因此，我们将我们的设备称为血管模拟微流控腔室，或 VMMC。这些设备使我们能够在模拟动脉粥样硬化血管环境的条件下，定量分析内皮细胞和单核细胞的炎症反应。VMMC 能够减少试剂或材料的使用量，适用于供应有限的情况。它们还可以以多种可定制的布局和几何结构构建，使其非常适用于广泛的应用场景。今天我们将演示一个采用芯片实验室方法的代表性实验。在明确定义的剪切应力条件下，对人血管内皮单层细胞进行细胞因子激活。我们将演示如何利用VMC实时定量人单核细胞向单层内皮细胞的募集，以此作为内皮细胞活化的功能性读数，所用的三英寸圆形基底由100毫米细胞培养皿经车床加工而成。将三英寸基底用蒸馏水清洗后，通过浸泡于70%乙醇中进行灭菌。无菌基底置于100毫米培养皿中晾干。然后在室温下用浓度为100微克/毫升的I型胶原孵育一小时，并用PBS洗涤。人主动脉内皮细胞（HAEC）或HA以每毫升65万个细胞的浓度悬浮。取1毫升细胞悬液以滴加方式置于干燥的胶原包被基质上，并铺展成均匀的悬液。将已固定的基底置于37°C、5% CO₂的培养箱中，使其附着于基底表面。一小时后，加入9 mL EGM-2生长培养基，细胞继续培养至形成单层，融合度约为90%。此时单层细胞可用于后续的剪切力实验。通过将A-P-D-M-S模具浇注在包含目标微通道几何结构的主模上，制备血管模拟微流控腔室。将硅胶基础剂倒入塑料模具船中，再按10:1的重量比加入硅胶固化剂。随后充分混合PDMS凝胶，注意不要刮擦模具船的内壁，以免将塑料碎屑混入混合物中。光刻胶母模使用己烷清洗，并准备用于VMMC的 molding。然后将PDMS混合物倒入模具上，再放入真空室中。在真空室内，PDMS混合物中的空气在15分钟后被去除并上升至表面。将模具从腔室中取出，并轻轻向PDMS表面吹气，以清除模具中残留的气泡。然后将模具盖好，放入37°C的烘箱中反应一小时，使PDMS固化。将固化的PDMS凝胶从烘箱中取出，使用小型解剖刀在腔室周围进行环形切口。必须逐步进行此操作，以避免接触光刻胶材料，否则会损坏母模。使用19号鲁尔锁针从模具中切下每个通道的微流控腔室的入口和出口。此外，在远离通道的位置为真空管打孔。男性包皮环切术（VMMC）的准备工作现已完成。将促炎性细胞因子TNF alpha用移液器加入6毫升L 15培养基中，以达到0.5纳克/毫升的终浓度。此处使用L 15培养基作为剪切液，因其在无5% CO2条件下具有pH缓冲能力。然后将培养基吸入一支无菌的10毫升注射器中，用于加载剪切装置。接着将融合的单层细胞转移至细胞剪切装置中，该装置已用乙醇灭菌并调平，且锥形间隙高度已设定。将基质从培养皿中取出，置于玻璃量块上居中，并小心地插入腔室底部，使锥形部分正对细胞上方。通过均匀拧紧围绕量块分布的不锈钢螺丝来固定基底。然后将剪切介质装入腔室，注意避免引入任何气泡。接下来，使用计算机输入所需的剪切应力程序，并启动微型分离电机。此处我们采用0 ± 5 达因/平方厘米的振荡剪切力。四小时后，停止剪切程序。移除量规块，并将基质小心地放回培养皿中。细胞现已准备好用于单核细胞黏附实验。剪切处理后的人脐静脉内皮细胞单层立即被转移至显微镜工作站，以组装血管壁流动腔室（VMMC）。将VMMC连接至真空泵软管，并浸入去离子水中，以去除通道内可能滞留的任何气泡。首先关闭真空阀，将腔室小心地压在单层细胞上，然后打开真空阀。此时必须确保腔室通道内没有困住气泡。接着，用剪去尖端的19号鲁尔锁针制作一个储液槽，向其中加入80 µL含钙和镁的HBSS溶液。通过用力按压储液槽顶部将液体从尖端推出，然后将其插入VMMC的进样口。将整个装置放置在显微镜载物台上，并打开显微镜相机和视频监视器。将一个10毫升玻璃注射器安装到注射泵上。接着，将注射器的管路连接至VMMC的出口端口。设定流速以在通道内产生每平方厘米一达因的剪切应力，然后以补充模式运行，使注射器通过通道从储液池中抽取液体。经SDF-1刺激的T淋巴细胞悬液浓度为每毫升200万个细胞。在启动流动后的两分钟内，向储液池中加入50微升细胞悬液。再次注意，在完全形成流动时避免引入气泡。视频以每秒三帧的速度采集，数据使用 Image J 软件进行量化。黏附的 THP-1 细胞定义为在 10 秒内移动不超过半个细胞直径。在此，我们展示了一组数据，描述了在肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激下，THP-1细胞黏附于人主动脉内皮（HA）单层细胞的情况，这些单层细胞分别在15 dynes/cm²的稳定高壁面剪切应力或±5 dynes/cm²的振荡剪切应力条件下进行培养。与经历高剪切应力的单层细胞相比，经历振荡剪切应力的HA单层细胞对THP-1细胞的募集增加了三倍。今天，我们演示了可定制的体外技术的应用，这些技术可结合使用，以深入揭示动脉粥样硬化早期炎症事件的机制。具体而言，我们在明确定义的流体动力学条件下，量化了内皮功能障碍以及细胞在炎症刺激下所表现出的相关生物学效应。使用VMM CS可使我们研究内皮细胞与白细胞黏附相互作用背后的特定机制。这些装置还具有灵活、成本低廉的优势，并有助于使用供应有限的材料，例如来源于人类受试者的血清成分。我们应用这些装置开展的研究包括对内皮细胞中由细胞因子、脂质和RAGE诱导的炎症反应的探究。我们还开发了芯片上的检测方法，用于研究多种白细胞类型以及全血中的黏附机制。最终，我们设想该技术将推动针对个体炎症介导的心血管疾病风险的体外评估方法的发展。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

片上内皮炎症表型

在本视频中，我们展示了经腹腔注射脂多糖的小鼠模型肠系膜静脉中血细胞与内皮细胞相互作用的实时可视化过程。...

利用活体显微镜分析炎症小鼠模型中血细胞与内皮细胞的相互作用

血管内皮细胞严格调控白细胞的募集过程。白细胞渗出异常可导致人类炎症性疾病的发生。因此，寻找内皮细胞活化的新调控因子，对于开发更有效的炎症性疾病治疗策略至关重要。本文介绍了一种系统性的方法学，用于鉴定能够调节炎症过程中白细胞迁移的新型内皮调控因子。...

用于表征炎症反应中新型内皮调节因子的筛选实验

本逐步实验方案详细描述了用于评估hiPSC-ECs中炎症反应以及在生理流动条件下分析白细胞黏附的实验设置和数据分析方法。...

用于评估白细胞黏附至人诱导多能干细胞来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）的微流控检测方法

主要不良心血管事件的发生会影响冠状动脉成形术后的心血管预后，其发生受冠状动脉损伤程度和血管修复情况的影响。检测对血管损伤和修复具有反应性的新型冠状动脉细胞和可溶性生物标志物，有助于预测主要不良心血管事件的发生及患者预后。...

冠状动脉祖细胞与可溶性生物标志物在冠状动脉血管成形术后心血管预后中的作用

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。...

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

等速电泳（ITP）是一种强大的电动力学分离和预富集技术，其应用范围从毒素检测到样品制备。本文综述了ITP的物理原理，并介绍了该技术在两个具体示例应用中的方法：小分子的分离与检测，以及从细胞培养裂解液中纯化核酸。...

芯片上等速电泳用于离子分离与核酸纯化

无透镜光学断层成像是一个三维显微技术，在x、y和z方向上的空间分辨率分别达到&lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm，成像体积可达15–100...

无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

通过使用原子力显微镜悬臂上的微米级小球进行压痕实验，测量了内皮糖萼的力学特性。内皮细胞在定制腔室中于生理流动条件下培养，以诱导糖萼表达。采用薄膜模型分析数据，以确定糖萼的厚度和模量。...

利用原子力显微镜量化内皮糖萼的机械特性

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

学习利用微流控芯片技术表征人主动脉内皮细胞的炎症状态，通过TNF-α诱导和差异剪切应力处理，实时观察单核细胞THP-1的黏附动态。该方法为研究血管炎症和动脉粥样硬化机制提供了精确的体外实验平台。

芯片上内皮炎症表型分析

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