片上内皮炎症表型

本视频的目的是演示用于表征内皮细胞炎症状态的芯片实验室技术。首先，将人主动脉内皮细胞生长至在组织培养基质上汇合，然后插入 Conan 板剪切装置中。用促炎细胞因子 TNF α 处理细胞，并通过精确控制视锥细胞在基质剪切应力上方的旋转，同时暴露于不同的剪切应力条件下 4 小时，从而调节对细胞因子的明确表征的炎症反应。

这包括 VCA one 和 ICAM one 等粘附分子的上调。基板被转移到显微镜载物台上，在那里 A-P-D-M-S 微流体装置被直接真空密封到单层上，形成流道。活化的单核细胞 THP one 细胞飞越预处理的 hs，在那里它们与细胞粘附分子表达水平成比例结合。

内皮的炎症状态是通过量化被牢牢停滞的 THP one 细胞的总数来确定的。嗨，我叫她 D Diverse，我是 Greg Foster。我是 Keith Bailey。

我们在加州大学戴维斯分校生物医学工程系教授、牧师和 Simon 的实验室里。今天，我们将介绍使用基于芯片的实验室方法来定量检查内皮功能障碍和炎症。这些工具为我们提供了一个平台，可以进行与代谢应激与流体动力学因子的叠加以及内皮炎症表型和动脉粥样硬化易感性的调节相关的研究。

因此，我们将我们的设备称为血管模拟、微流体室或 vmmc。这些设备使我们能够在模拟致动脉粥样硬化血管的条件下量化内皮细胞和单核细胞的炎症结果。VMMC 有助于使用可能供应有限的少量试剂或材料。

它们还可以构建成许多可定制的布局和几何形状，使其非常适合广泛的应用。今天，我们将使用我们的芯片实验室方法演示一个具有代表性的实验。人内皮单层将在明确定义的剪切应力下暴露于细胞因子激活。

我们将演示使用 VMC 实时量化人单核细胞向单层募集，因为使用车床从 100 毫米组织培养皿中铣削 3 英寸圆形基质的内皮活化的功能读数。用蒸馏水洗涤 3 英寸的底物，然后用 70% 乙醇浸泡消毒。将无菌基质置于 100 毫米培养皿中并晾干。

然后将它们与浓度为 100 μg/mL 的 1 型胶原蛋白在室温下孵育 1 小时，并用 PBS 洗涤。人主动脉内皮细胞或 HA 以每毫升 650， 000 个细胞的浓度悬浮。将 1 毫升细胞悬液以液滴形式放置在干燥的胶原蛋白包被基质上，并铺展成均匀的悬液。

然后将固定的底物放入 37 度 5%CO2 培养箱中，并使其附着在底物表面。在 E GM 2 生长 1 小时后，加入培养基，让细胞以大约 90% Co 流畅度生长成单层，单层准备用于后续的纯粹实验。血管模拟微流体室是通过将 A-P-D-M-S 模具倒在包含所需通道的母模上来构建的。几何学。

硅胶基质倒入塑料船中，然后以 10 比 1 的重量比例倒入硅胶固化剂。然后将 PDMS 凝胶充分混合，注意不要刮擦船的侧面，从而将塑料碎屑引入混合物中。用己烷清洁光刻胶母版并准备成型 VMMC。

然后将 PDMS 混合物倒在母模上，然后放入真空室中。在房间里。从 PDMS 混合物中去除空气，并在 15 分钟后上升到表面。

将模具从腔室中取出，并将空气轻轻吹到 PDMS 表面，以清除模具中剩余的气泡。然后将霉菌盖上并放入 37 度的烤箱中 1 小时，让 PMS 固化。从烤箱中取出固化的 PDMS 凝胶，并使用小手术刀在腔室周围做圆切口。

逐渐执行此作以避免接触光刻胶材料至关重要，因为这会损坏母模。使用 19 号诱饵锁针从每个通道的模具冲头入口和出口处切除微流体室。此外，真空管的冲孔远离通道。

VMMC 的准备工作现已完成。将促炎细胞因子 TNF α 移液到 6 毫升 L 15 培养基中，以达到 0.5 ng/mL 的最终浓度。L 15 介质在这里用作剪切液，因为它在不存在 5% CO2 的情况下具有 pH 缓冲能力。

然后将培养基吸入无菌 10 毫升注射器中，用于加载剪切装置。然后将 Confluent 单层转移到细胞剪切装置中，该装置已用乙醇整平消毒并设置锥隙高度。从培养皿中取出底物，放在玻璃量规块上，以玻璃量计块为中心，小心地插入外壳室的底部，使锥体位于细胞的正上方。

通过在量块周围均匀拧紧不锈钢螺钉来固定基材。然后将剪切介质装入腔室，注意不要引入任何气泡。接下来，使用计算机输入所需的剪切应力程序并打开微型分离电机。

在这里，我们使用每平方厘米 0 加或负 5 丁的振荡剪切。4 小时后，剪切程序停止。取出量规块，小心地将底物放回培养皿中。

细胞现在已准备好进行单核细胞粘附测定。剪切后，HA 单层立即被运送到显微镜站进行 VMMC 的组装。VMMC 连接到真空软管上，并浸没在去离子水中，以去除通道内滞留的任何气泡。

最初关闭真空阀后，小心地将腔室压在单层顶部，并打开真空阀。在这里，确保没有气泡被困在腔室的通道内至关重要。现在，将 80 微升含有钙和镁的 HBSS 移液到一个储液器中，该储液器是通过切掉 19 号诱饵锁针的尖端制成的，通过用力按压储液器的顶部将其从尖端推出，然后将其插入 VMMC 的入口

将整个组件放置在显微镜载物台上，并打开显微镜相机和视频监视器。将 10 毫升玻璃注射器装入注射泵。接下来，将注射器管连接到 VMMC 的出口。

流速设置为在通道内产生每平方厘米 1 dine 的绝对应力，然后在再填充模式下运行，以便注射器通过通道从储液罐中拉出液体。用 SDF one 刺激的 P one 细胞以每毫升 200 万个细胞的浓度悬浮。在流式细胞流激活后 2 分钟内，向储液槽中加入 50 μL 细胞悬液。

同样，注意不要在完全发展流动时引入气泡。以每秒 3 帧的速度捕获视频，并使用 Image J 软件枚举数据。粘 附。THP 1 细胞定义为在 10 秒内移动不超过一半细胞直径。

在这里，我们展示了描述 THP 对 ha 单层的粘附的数据，该单层用 TNF α 刺激，并在每平方厘米 15 丁的稳定高壁剪切应力或每平方厘米 15 丁的稳定高壁剪切应力或每平方厘米零正负 5 丁的振荡剪切应力下，用振荡剪切应力调节的 ha 单层表现出三倍的 TP 单细胞募集与经历高剪切应力的单层相比。今天，我们展示了可定制的体外技术的使用，这些技术可以结合起来，为动脉粥样硬化的早期炎症事件提供重要的见解。具体来说，我们量化了在明确定义的流体动力学条件下与内皮功能障碍和暴露于炎症刺激的细胞相关的结果。

VMM CS 的使用使我们能够检查内皮细胞和白细胞粘附相互作用的特定机制。这些设备还具有灵活且价格低廉的优点，并且有助于使用可能供应有限的材料，例如来自人类受试者的血清衍生成分。我们应用这些设备的研究包括对细胞因子、脂质和 rage 诱导的内皮细胞炎症的研究。

我们还开发了芯片检测方法，用于检查多种白细胞类型以及全血中的粘附机制。最终，我们设想这项技术将导致体外方法来评估个体患炎症介导的心血管疾病的风险。