片上内皮炎症表型
2012年7月21日
应用光刻和蚀刻的PDMS制作的微流室探测与欧共体功能障碍和炎症相关的功能性结果。在有代表性的实验，能力差剪应力调节单核细胞粘附因子激活欧共体单层证明。
本视频的目的是演示用于表征内皮细胞炎症状态的芯片实验室技术。首先，将人主动脉内皮细胞生长至在组织培养基质上汇合，然后插入 Conan 板剪切装置中。用促炎细胞因子 TNF α 处理细胞，并通过精确控制视锥细胞在基质剪切应力上方的旋转，同时暴露于不同的剪切应力条件下 4 小时，从而调节对细胞因子的明确表征的炎症反应。
这包括 VCA one 和 ICAM one 等粘附分子的上调。基板被转移到显微镜载物台上，在那里 A-P-D-M-S 微流体装置被直接真空密封到单层上，形成流道。活化的单核细胞 THP one 细胞飞越预处理的 hs，在那里它们与细胞粘附分子表达水平成比例结合。
内皮的炎症状态是通过量化被牢牢停滞的 THP one 细胞的总数来确定的。嗨，我叫她 D Diverse，我是 Greg Foster。我是 Keith Bailey。
我们在加州大学戴维斯分校生物医学工程系教授、牧师和 Simon 的实验室里。今天，我们将介绍使用基于芯片的实验室方法来定量检查内皮功能障碍和炎症。这些工具为我们提供了一个平台，可以进行与代谢应激与流体动力学因子的叠加以及内皮炎症表型和动脉粥样硬化易感性的调节相关的研究。
因此，我们将我们的设备称为血管模拟、微流体室或 vmmc。这些设备使我们能够在模拟致动脉粥样硬化血管的条件下量化内皮细胞和单核细胞的炎症结果。VMMC 有助于使用可能供应有限的少量试剂或材料。
它们还可以构建成许多可定制的布局和几何形状，使其非常适合广泛的应用。今天，我们将使用我们的芯片实验室方法演示一个具有代表性的实验。人内皮单层将在明确定义的剪切应力下暴露于细胞因子激活。
我们将演示使用 VMC 实时量化人单核细胞向单层募集，因为使用车床从 100 毫米组织培养皿中铣削 3 英寸圆形基质的内皮活化的功能读数。用蒸馏水洗涤 3 英寸的底物，然后用 70% 乙醇浸泡消毒。将无菌基质置于 100 毫米培养皿中并晾干。
然后将它们与浓度为 100 μg/mL 的 1 型胶原蛋白在室温下孵育 1 小时，并用 PBS 洗涤。人主动脉内皮细胞或 HA 以每毫升 650， 000 个细胞的浓度悬浮。将 1 毫升细胞悬液以液滴形式放置在干燥的胶原蛋白包被基质上，并铺展成均匀的悬液。
然后将固定的底物放入 37 度 5%CO2 培养箱中，并使其附着在底物表面。在 E GM 2 生长 1 小时后，加入培养基，让细胞以大约 90% Co 流畅度生长成单层，单层准备用于后续的纯粹实验。血管模拟微流体室是通过将 A-P-D-M-S 模具倒在包含所需通道的母模上来构建的。几何学。
将硅胶基质倒入塑料船中，然后以 10 比 1 的重量比例倒入硅胶固化剂。然后将 PDMS 凝胶充分混合，注意不要刮擦船的侧面，从而将塑料碎屑引入混合物中。用己烷清洁光刻胶母版并准备成型 VMMC。
然后将 PDMS 混合物倒在母模上，然后放入真空室中。在房间里。从 PDMS 混合物中去除空气，并在 15 分钟后上升到表面。
将模具从腔室中取出，并将空气轻轻吹到 PDMS 表面，以清除模具中剩余的气泡。然后将霉菌盖上并放入 37 度的烤箱中 1 小时，让 PMS 固化。从烤箱中取出固化的 PDMS 凝胶，并使用小手术刀在腔室周围做圆切口。
逐渐执行此作以避免接触光刻胶材料至关重要，因为这会损坏母模。使用 19 号诱饵锁针从每个通道的模具冲头入口和出口处切除微流体室。此外，真空管的冲孔远离通道。
VMMC 的准备工作现已完成。将促炎细胞因子 TNF α 移液到 6 毫升 L 15 培养基中，以达到 0.5 ng/mL 的最终浓度。L 15 介质在这里用作剪切液，因为它在不存在 5% CO2 的情况下具有 pH 缓冲能力。
然后将培养基吸入无菌 10 毫升注射器中，用于加载剪切装置。然后将 Confluent 单层转移到细胞剪切装置中，该装置已用乙醇整平消毒并设置锥隙高度。从培养皿中取出底物，放在玻璃量规块上，以玻璃量计块为中心，小心地插入外壳室的底部，使锥体位于细胞的正上方。
通过在量块周围均匀拧紧不锈钢螺钉来固定基材。然后将剪切介质装入腔室，注意不要引入任何气泡。接下来，使用计算机输入所需的剪切应力程序并打开微型分离电机。
在这里，我们使用每平方厘米 0 加或负 5 丁的振荡剪切。4 小时后，剪切程序停止。取出量规块，小心地将底物放回培养皿中。
细胞现在已准备好进行单核细胞粘附测定。剪切后，HA 单层立即被运送到显微镜站进行 VMMC 的组装。VMMC 连接到真空软管上，并浸没在去离子水中，以去除通道内滞留的任何气泡。
最初关闭真空阀后，小心地将腔室压在单层顶部，并打开真空阀。在这里，确保没有气泡被困在腔室的通道内至关重要。现在，将 80 微升含有钙和镁的 HBSS 移液到一个储液器中，该储液器是通过切掉 19 号诱饵锁针的尖端制成的，通过用力按压储液器的顶部将其从尖端推出，然后将其插入 VMMC 的入口
。将整个组件放置在显微镜载物台上，并打开显微镜相机和视频监视器。将 10 毫升玻璃注射器装入注射泵。接下来，将注射器管连接到 VMMC 的出口。
流速设置为在通道内产生每平方厘米 1 dine 的绝对应力，然后在再填充模式下运行，以便注射器通过通道从储液罐中拉出液体。用 SDF one 刺激的 P one 细胞以每毫升 200 万个细胞的浓度悬浮。在流式细胞流激活后 2 分钟内，向储液槽中加入 50 μL 细胞悬液。
同样，注意不要在完全发展流动时引入气泡。以每秒 3 帧的速度捕获视频，并使用 Image J 软件枚举数据。粘 附。THP 1 细胞定义为在 10 秒内移动不超过一半细胞直径。
在这里，我们展示了描述 THP 对 ha 单层的粘附的数据，该单层用 TNF α 刺激，并在每平方厘米 15 丁的稳定高壁剪切应力或每平方厘米 15 丁的稳定高壁剪切应力或每平方厘米零正负 5 丁的振荡剪切应力下，用振荡剪切应力调节的 ha 单层表现出三倍的 TP 单细胞募集与经历高剪切应力的单层相比。今天，我们展示了可定制的体外技术的使用，这些技术可以结合起来，为动脉粥样硬化的早期炎症事件提供重要的见解。具体来说，我们量化了在明确定义的流体动力学条件下与内皮功能障碍和暴露于炎症刺激的细胞相关的结果。
VMM CS 的使用使我们能够检查内皮细胞和白细胞粘附相互作用的特定机制。这些设备还具有灵活且价格低廉的优点，并且有助于使用可能供应有限的材料，例如来自人类受试者的血清衍生成分。我们应用这些设备的研究包括对细胞因子、脂质和 rage 诱导的内皮细胞炎症的研究。
我们还开发了芯片检测方法，用于检查多种白细胞类型以及全血中的粘附机制。最终，我们设想这项技术将导致体外方法来评估个体患炎症介导的心血管疾病的风险。
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概述
本文展示了一种芯片上实验室技术，利用微流控流动室来表征内皮细胞（ECs）的炎症状态。该研究探讨了差异剪切应力如何影响单核细胞对细胞因子激活的EC单层的粘附。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微流控
背景
- 内皮细胞在炎症和血管健康中起着关键作用。
- 已知剪切应力会影响血管系统中的细胞反应。
- 了解EC功能障碍可以提供对各种心血管疾病的见解。
- 微流控设备允许对实验条件进行精确控制。
研究目的
- 表征人主动脉内皮细胞的炎症反应。
- 检查剪切应力对单核细胞粘附的影响。
- 利用微流控方法进行增强的实验控制。
使用的方法
- 人主动脉内皮细胞被培养至融合。
- 细胞被用TNF alpha处理以诱导炎症。
- 使用锥板剪切装置应用差异剪切应力。
- 引入单核THP-1细胞以评估粘附水平。
主要结果
- 剪切应力调节了粘附分子如VCAM-1和ICAM-1的表达。
- 单核细胞粘附与粘附分子表达水平成正比。
- 微流控设置允许对细胞相互作用进行实时观察。
- 结果突出了机械力和炎症反应之间的相互作用。
结论
- 该研究提供了剪切应力在EC炎症中作用的见解。
- 微流控设备是研究细胞粘附动力学的有效工具。
- 研究结果可能对理解心血管疾病机制有影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This lab-on-a-chip approach enables quantitative assessment of endothelial inflammatory phenotypes under controlled hemodynamic conditions, addressing a critical gap in early cardiovascular risk stratification. By linking metabolic perturbations to leukocyte adhesion dynamics in a reproducible in vitro system, the method supports mechanistic de-risking of atherogenic pathways and informs target validation strategies in cardiovascular drug discovery. The platform’s ability to model physiologically relevant shear stress and cytokine interactions provides predictive value for evaluating therapeutic candidates targeting endothelial dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hemodynamic regulation of inflammatory pathways in human endothelial cells under defined shear stress conditions.
- Operational Value: Provides a quantitative readout of monocyte adhesion as a functional biomarker of endothelial activation state.
- Predictive Value: Supports target validation by linking shear-modulated adhesion molecule expression (e.g., VCAM-1, ICAM-1) to leukocyte recruitment under inflammatory stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a standardized microfluidic assay for measuring real-time leukocyte-endothelial interactions under physiological flow.
- Operational Value: Permits high-resolution imaging and automated quantification of adherent cells using image analysis tools.
- Assay Readiness: Delivers reproducible, shear-dependent inflammatory phenotypes suitable for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models early atherogenic events by coupling metabolic risk factors (e.g., TNF-α activation) with hemodynamic shear profiles relevant to arterial geometries.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo atherosclerotic susceptibility by quantifying functional endothelial responses under clinically relevant flow conditions.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of targets based on their modulation of shear-sensitive inflammatory phenotypes in human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, supporting hypothesis testing in early target validation, enabling assay development for leukocyte recruitment, and providing quantitative analytics for mechanistic de-risking before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of how hemodynamic forces modulate cytokine-induced endothelial activation and leukocyte adhesion.
- Screening: Delivers a shear-dependent, quantitative assay for evaluating compound effects on endothelial inflammatory phenotypes under controlled flow.
- Analytics: Generates real-time, image-based quantification of firmly arrested monocytes as a functional readout of endothelial activation state.
- Translational Research: Connects endothelial dysfunction metrics to atherosclerotic risk by modeling physiologic shear stress and inflammatory priming in human aortic endothelial cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reconfigurable microfluidic platform adaptable to various leukocyte types, stimuli, and shear profiles across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in endothelial inflammation by decoupling hemodynamic and biochemical variables in a controlled system.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized microfluidic fabrication and precise shear stress application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant data on target modulation of endothelial-leukocyte interactions under flow.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying candidates that attenuate shear-amplified inflammatory phenotypes in pathophysiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, cell culture under shear, and leukocyte isolation or handling.
- Depends on access to soft lithography equipment, vacuum sealing systems, and inverted microscopes with environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of shear protocols, cytokine dosing, and cell preparation for reproducible results across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to different endothelial sources (e.g., coronary, microvascular) or leukocyte subtypes beyond THP-1.
- Practical limitations include device assembly complexity and the need for bubble-free microfluidic channel formation to ensure consistent shear profiles.
