组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

本实验的目的是制备可灭菌、足够厚且具有适当机械强度的电纺可生物降解支架，以用于临床组织工程。该目标通过以下步骤实现：首先将可生物降解聚合物电纺成初级结构，可以是随机取向或有序取向，也可采用逐层叠加的方式；第二步是通过将多层结构组合并进行灭菌处理，对支架进行纺丝后的修饰。

接下来将细胞接种于支架材料上，并评估其在培养期间及培养后的表现。最后一步是施加运动刺激，模拟细胞在体内所承受的生理应力，以使其为移植做好准备。最终，我们可通过检测细胞在动态张力作用下产生的细胞外基质，来评估其对运动刺激的响应。

该技术具有多功能性和灵活性，可制备多种支架材料，并能针对特定应用需求精确调控其性能。例如，可设计用于治疗组织修复困难病症的支架，如严重烧伤患者大面积皮肤缺损的替代，或癌症及创伤后受损口腔黏膜的修复。尽管本视频以细胞的持续生成作为动态应激的标志，您也可考虑选用多种细胞外基质蛋白，并利用运动或非运动状态的细胞评估细胞生物学的其他诸多方面。

通常，初次接触该方法的研究人员在制备可重复的支架时会遇到困难，因为静电纺丝过程受多种变量影响。纺丝后对静电纺丝支架进行处理的可视化演示非常重要，但这一环节却很少被讨论。

要成功将该技术应用于临床，必须了解该过程。首先，用铝箔包裹旋转芯轴收集器，铝箔的光面朝外。然后，将四个装有五毫升目标聚合物的五毫升注射器放置到位。

将聚乳酸装入注射泵中。设定流速为每分钟每支注射器40微升，工作距离为针尖到心轴17厘米。接下来，将注射器针头施加正17,000伏电压，并从适当距离向包覆铝箔的心轴进行电纺，以获得取向纤维。

将转鼓以 1000 RPM 的转速旋转以制备随机取向纤维。将转鼓以 200 RPM 的转速旋转。静电纺丝 PHBV 莲花二号聚合物后，所得电纺支架可在含有干燥剂的密封容器中，用铝箔包裹，于 4°C 条件下保存至少四个月。

再次说明，PLA 已显示出在 PHBV 之上形成分层结构，然后采用该聚合物旋涂的参数和常规条件。同样，这种添加剂工艺通过加热器构建出双层支架，从而形成多层支架。

将四层PLGA膜叠放在一起，置于60摄氏度下加热三小时，通过蒸气塑形法制备多层支架。取10毫升二氯甲烷（DCM），倒入适当大小的容器中。然后将四层PLGA膜叠放在一起，悬置于二氯甲烷上方两厘米处。

最后，在室温下密封容器一小时，通过静电纺丝实现无菌支架的制备；将经DCM孵育灭菌的医用级聚合物溶解，然后进行静电纺丝，将聚合物溶液纺至包裹在已灭菌芯轴上的无菌箔上。随后在无菌超净工作台中，将支架置于不含抗生素的培养基中孵育适当时间，以根据实验所需的乙醇消毒程序验证样品的无菌性。

将支架放入乙醇和蒸馏水溶液中浸泡15分钟，用于过氧乙酸灭菌。将支架浸入过氧乙酸和PBS溶液中三小时。

在室温下对支架进行伽马辐照灭菌，首先使用铯源以3 kGy剂量照射支架，然后将支架切割成5 mm × 20 mm的矩形。接着使用千分尺测量支架厚度。随后将矩形支架放入Bose ElectroForce 3100仪器中。

根据仪器绘制的载荷与位移关系曲线（即应力-应变曲线），计算杨氏模量和弹性。首先在接种细胞前，用荧光染料对细胞进行标记。然后将汇合的人类皮肤成纤维细胞在 37 摄氏度下用胰蛋白酶和 EDTA 孵育 5 分钟。

然后在室温下以150 × g离心10分钟，沉淀已脱落的细胞，并将沉淀重悬于5 mL DMEM中。计数后，调整细胞浓度进行接种，并将细胞接种到支架上。现在使用荧光显微镜对标记的支架表面成像，以观察细胞向支架内部的渗透情况；如需更深入地观察细胞在支架内的渗透，可使用多光子共聚焦显微镜。

这可以在含细胞或不含细胞的大多数支架中实现约200微米的渗透深度。接种支架培养后，将样品置于1毫升PBS中的甲醛溶液中，37摄氏度固定20分钟。固定后，用1毫升PBS洗涤样品三次，随后将每个样品与200微升弹性蛋白一抗溶液在37摄氏度孵育30分钟。

用一毫升 PBS 将样品再清洗三次，然后将样品在含有 DPI 的 PBS 溶液中与二抗孵育 30 分钟。最后，用 PBS 将样品再清洗一次，然后使用荧光显微镜对样品成像，DPI 采用 365 纳米激发光和 460 纳米发射光，二抗采用 480 纳米激发光和 533 纳米发射光。首先对流量调节装置和球囊进行高压灭菌，然后在洁净室内，在层流罩中的静电纺丝位置打开装置包装。

接下来，将一个装有 PBS 的 50 毫升注射器连接到三通阀的支管上，并用 PBS 充盈球囊，直至其膨胀饱满。现在将目标聚合物电纺到球囊表面。采用常规纺丝条件和 10 厘米的工作距离，湿纤维具有足够的黏性，能够牢固附着在球囊表面而不会随后脱落。

支架干燥后，将球囊放入无菌容器中，然后将容器转移至适合细胞培养的层流罩内。在扩张的球囊上利用支架进行细胞培养，使细胞接受生物力学刺激，是该实验步骤中最关键的部分。必须反复用细胞悬液灌注球囊，以尽可能多地将细胞黏附到支架上。

我们发现此过程大约需要20分钟。在生物安全柜中，将球囊从容器中取出，放置于无菌表面（例如本实验所用的培养皿），每20秒用移液器将细胞悬液滴加到包被的球囊表面一次，持续20分钟，以尝试使细胞在球囊表面均匀分布。随后将球囊放回培养容器中，并加入适合该细胞类型的预温培养基。

最后，将膨胀装置连接至注射泵，并根据需要对球囊进行充气和放气，以实现双轴拉伸。可使用计算机控制的注射泵来实现更复杂的拉伸程序。可采用静电纺丝技术制备具有随机和有序结构的支架。

该方法具有良好的重复性，且所得纤维均匀。例如，可通过将铝箔旋转90度，先在上面静电纺丝制备一层取向纤维，然后立即在其上再静电纺丝第二层取向纤维，从而制备出垂直排列的纤维结构。多种类型的聚合物均可用于静电纺丝，其特性可表现出显著差异，如图中所示的P-L-A-P-H-B-V-P-C-L和PLGA；需注意，P-L-A-P-C-L和PLGA均为微米级纤维的均匀支架。

PHBV 被纺成一条珍珠项链状结构，由纳米纤维连接着直径为5至20微米的珠状颗粒。此处的支架首先使用PHBV进行纺丝制备，随后将注射器更换为PLA溶液，并在PHBV支架之上再次纺丝。这些图像展示了典型的单层PHBV和PLA结构。

该图像展示了具有致密纳米纤维珠链结构的A-P-H-B-V-P-L-A双层支架的横截面示意图，其中PHBV层为致密的纳米纤维结构，而PLA层则为较疏松的微米级纤维结构。这三种支架类型均能促进细胞的黏附与增殖。若需要更厚的支架，可通过蒸汽加热压合的方法将多层支架融合在一起，如下几幅图像所示。经压合后的支架层之间不会发生分层，且层间边界往往难以分辨。

该图像显示了一个通过蒸汽处理的膝状PLA支架的截面，其中初始的纤维支架（直径约150微米）已被堆叠在一起。随后使用二氯甲烷（DCM）蒸汽处理，形成厚度达500微米的更厚支架。本图像展示了蒸汽处理后的双层支架在约两倍于先前放大倍数下的同一区域。在此图像中可观察到，支架由较粗纤维层与较细纤维层交替组成，较细纤维层由加热过程形成，通过将薄层与厚层纤维结合在一起，从而形成具有复杂力学性能的支架结构。

再次展示的是同一加热膝状支架，放大四倍。通过分层膜可实现之前的放大效果，并可使用不同类型的细胞，每种细胞分别在独立的膜上培养，互不混合，如图中用两种不同荧光细胞示踪染料标记的人类真皮成纤维细胞所示。第一张图像为电纺PLA上的成纤维细胞。

细胞经过固定并染色，此处经dappy染色的成纤维细胞被接种到电纺PHBV上。在本实验中，成纤维细胞预先用活细胞染料Cell Tracker Green进行染色。请注意，细胞位于双层结构的PLA一侧。

该图像显示了双层结构的代表性横截面，其中下层PHBV表面的成纤维细胞呈红色染色，上层PLA表面的成纤维细胞呈绿色染色。在此图像中，成纤维细胞在A-P-H-B-V表面生长时已预先用细胞追踪红染料标记。因此，在细胞仍在生长的过程中，利用活细胞荧光染料为观察细胞在支架上的分布提供了一种便捷的方法。

灭菌方法会影响支架材料及其后续的细胞培养。该折线图展示了过氧乙酸、γ射线辐照和乙醇处理对一种PLG支架材料的极限抗拉强度和杨氏模量的影响。

每种灭菌方法都会改变支架的极限抗拉强度和弹性。在这些支架上进行细胞培养会进一步降低其极限抗拉应力，但会增加弹性。该柱状图展示了灭菌方法对单个支架纤维直径的影响。

伽马辐照对纤维直径无显著影响，而过氧乙酸和乙醇可使纤维直径减少约50%。因此，获得无菌支架的最佳方法是在无菌条件下进行制备。最后这一系列图像表明，细胞在动态拉伸过程中仍保持活性，并且弹性蛋白的生成量有所增加。注意观察由代谢指示剂MTT检测到的细胞生长过程中产生的深蓝色颜色变化。

此处，在球囊上培养并经双向拉伸的蓝色细胞产生了弹性纤维，如绿色染色所示。相比之下，相同细胞在相同球囊支架上静态培养时则几乎不产生弹性纤维。通过该方法，还可进一步采用静态培养和灌注培养等其他方式，对细胞在不同培养条件下的反应进行研究。

在可扩张的球囊支架上培养细胞的技术发展已被证明非常有用，因为它为组织工程领域的研究人员探索动态条件对组织工程构建物中细胞的影响铺平了道路。请注意，在进行该实验操作时，使用高电压电源、溶剂、激光器和人类细胞可能存在危险，必须始终接受适当的培训并采取必要的安全防护措施。