Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

以下实验的总体目标是赋予细菌粘附特性，以便于它们与液体介质分离。这是通过首先设计合成卷发来绕过复杂的遗传调控并能够轻松大规模地生产粘性聚合物来实现的。作为第二步，在聚苯乙烯上可视化和量化贴壁细菌，从而可以快速估计合成装置的效率。

接下来，通过共聚焦显微镜在玻璃上观察粘附的细菌。为了直接观察生物膜并获得有关其结构的信息，获得的结果显示，根据粘附性、百分比测量和显微镜观察，合成装置的菌株的粘附性显着增加。与常规克隆等现有方法相比，合成生物学方法的主要优点是，可以非常快速地获得仅包含具有适当信号的绝对明确所需基因的构建体。

这种方法可以帮助回答生物修复领域的一个关键问题，例如解决从放射性废物中去除载有金属的细菌的挑战。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要有关遗传调控信号和数据库处理的基本知识。视觉演示将侧重于生物膜的量化和可视化，因为由于生物框架的脆弱性，这两个步骤非常难以学习。

设计合成 carron 的第一步是确定 curly 基因的遗传组织并定位它们的内源性、转录和翻译信号。这是使用 REON DB 或 eco gene 等专用数据库完成的。下一步是选择卷曲合成绝对需要的五个基因，CSGB 和 CSGA 并编码纤维单体和 C-S-G-E-C-S-G-F 和 CSGG 编码卷曲分泌复合物，以更快的格式数据管理从数据库中提取所选序列，并且将使用克隆管理器软件进行计算机预分析，因为 C-S-G-G-F-E 簇在大肠杆菌基因组中是反义的。

这个序列需要转换为它的反向补码对应物。使用克隆管理工具作过程 molecule invert molecule，使用函数 ligate 将 C-S-G-E-F-G 序列粘贴到 C-S-G-B-A 后面。接下来，在 C-S-G-B-A-E-F-G iCal 序列前面添加适当的启动子 PRCN。

RCN 基因座编码一个 FLX 泵 RCNA，负责镍和钴的解毒，以及它的同源金属调节因子 RCNR。在不存在钴或镍的情况下，阻遏蛋白 RCNR 与 DNA 上的 RCNR 盒结合，并阻止下游基因的完全转录激活。如果钴或镍的细胞内浓度升高，钴或镍与 RCNR 蛋白的结合会阻止阻遏蛋白固定在启动子上，并且通过将五个选定的卷曲基因置于启动子的控制下，P-R-C-N-A 的转录活性增加。

预计 PRCN 卷曲在钴和镍存在下会过量生产。随后通过在 CS gba、DNA 序列的第一个 A TG 前面添加完美的核糖体结合位点或 RBS，在 C-S-G-E-F-G 序列前面添加第二个完美的 RBS 来优化转录信号。为符合 I GM 标准，设备两侧必须有一个标准 bio 模块前缀（包含 ECO R 1 和 X-bar 1 的限制位点），以及一个包含 SPE 1 和 PST 1 限制性位点的后缀，以便于进一步组装。

生物模块部件本身可能不包含任何 ECO R 1、PST 1 SPE 和 X-bar R 1 识别位点。因此，这些位点被静默突变消除，设备的计算机限制性分析显示 1 个 PST、CSGA 序列中的 1 个位点、RCNR 序列中 1 个 PST 和 CSGE 基因中的 1 个 ECO R 1 位点。这些位点被沉默突变修饰。

合成 opor 的设计完成后，使用克隆管理器软件运行翻译模拟。使用序列比对程序 blast 验证野生型卷曲蛋白和合成编码蛋白之间的完美同源性，以开始此过程，用于 24 孔聚苯乙烯板的每个孔，用 2 毫升 M 63，含 0.2% 葡萄糖的最小培养基接种每个孔，接种 10 至 6 个细胞过夜细菌培养物。在 30 摄氏度下培养细菌 18 至 48 小时而不摇晃 24 孔板的每一列代表一种模式。

需要时添加适量的钴和抗生素。前三行用于通过平均三次重复来量化 A 贴壁细菌。剩下的最后一行用于在 18 至 48 小时后通过结晶紫染色使生物膜可视化，从 24 孔板的前三行的每个孔中回收含有浮游细胞的旋囊，并将旋囊转移到溶血管中。

用 1 毫升 M 63 培养基仔细冲洗每个孔，然后将洗涤液拉入溶血管中，初始旋腹液。这个池被称为名为 S 的游泳细胞，微孔板中孔的底部覆盖着贴壁细胞。要回收生物膜，请在每个生物膜中加入 1 毫升 M 63。

用移液器吸头刮擦，然后上下移液，将生物膜组分转移到新的溶血管中。涡旋试管 15 秒。在溶血管中收集生物膜组分。

该池代表名为 B 的表面附着细胞将 200 微升的旋后和生物膜部分从溶血管转移到 96 孔板中。根据 600 纳米的光密度估计表面附着和游动的细菌的数量。通过使用公式 B 乘以 100 除以 S 的三倍来计算每种模式的依从性百分比 B.To 仅可视化 24 孔板中的最后一行的生物膜，丢弃这些孔中的浮游生物细胞。

向每个孔中加入 1 毫升 M 63 以冲洗板底部形成的生物膜。1 小时后，将未覆盖的板在 80 摄氏度下干燥 1 小时，向每个孔中加入 100 微升 20% 结晶紫 2 次，然后用水充分洗涤。该协议需要一个荧光底盘。

带有合成卷曲的质粒的合适宿主是大肠杆菌 SCC one 菌株，其组成型表达绿色荧光蛋白，与亲本菌株 MG 1 16 55 没有明显的差异。用带有合成 curli 的 puck 57 质粒转化宿主菌株，以获得 S 23 菌株。用对照质粒 puck 18 转化宿主菌株以获得对照菌株。

S 24 在 S 23 和 S 24 菌株的培养前在 30 摄氏度下过夜生长。在第二天补充有葡萄糖和氨苄青霉素的 M 63 培养基中，将 20 毫升 M 63 培养基加入培养皿中，然后将 15 毫升 M 63 接种到培养皿中，加入 100 微升预培养物。加入适当浓度的钴，不要忘记不含钴的阴性对照。

将三个矩形玻璃盖玻片放入每个培养皿中。将培养皿在 30 摄氏度下孵育过夜，不要摇晃。在接下来的几天里，细菌可以直接在荧光显微镜下观察。

避免样品干燥很重要，因此必须小心但快速地执行以下步骤。从培养皿中取出每个盖玻片并小心地沥干。用蘸有 70% 乙醇的小棉签仔细清洁下表面，以擦去所有细菌残留物以进行共聚焦观察。

将盖玻片放在载玻片上，上表面被面朝上的生物膜覆盖。然后用更大的盖玻片覆盖生物膜，该盖玻片固定在玻璃上。带清漆的幻灯片。

反转设置，使生物膜现在位于下表面。在本实验中，将设置放在共聚焦激光显微镜下。蔡司 LSM 5 10 元共聚焦激光显微镜用于 CT 微平台。

选择 40 倍油浸物镜。使用以下设置，在 4 88 纳米处激发 GFP 并收集 500 至 600 纳米范围内的细菌荧光。使用 40 倍油浸物镜采集图像。

在激光扫描共聚焦模式下。扫描生物膜的整体三维结构，从固体表面到与生长培养基的界面。使用一微米的步长。

使用 maus 软件执行三维投影，通过分析沿统计纵向截面的平均 C 值来确定生物膜厚度。生物膜的定量，可以从共聚焦 Z 堆栈中提取生物体积。可以通过简单的方法评估经工程改造为响应金属而过度产生卷曲的大肠杆菌的粘附能力。

例如，在 24 孔抛光的 Irene 板上进行结晶紫染色可以快速观察每个孔底部生物膜的形成，如紫色强度的差异所示。野生型菌株似乎比工程菌株更不贴壁。一种定量方法是测量野生型聚苯乙烯和工程菌株与不同浓度钴的粘附百分比。

该图中显示的结果表明，在没有钴的情况下，工程菌株的粘附百分比比野生型菌株高 1.5 倍。此外，在钴浓度增加的情况下，在钴浓度增加的情况下，在粘附工程细胞的粘附率分别为 30% 和 50% 的培养基中观察到粘附性显着增强。也可以使用显微镜与在载玻片上生长的 GFP 标记细菌的粘附能力进行比较，黑色背景上绿色细菌的落射荧光显微镜观察显示，工程菌株形成生物膜，而野生 trippe 菌株仅形成箭头指示的微菌落。

共聚焦显微镜分析提供了生物膜三维结构的整体视图。俯视图重建显示在面板 A 中，侧视图重建显示在面板 B 中，结果证实，工程菌株更贴壁，并形成比野生型更致密、更厚的生物膜。在尝试此程序时，仔细检查作设计非常重要，例如，在放射性废水的背景下探索改性大肠杆菌或居住蚁的生物介导潜力。

看完这个视频，你应该对如何使用克隆管理器软件设计合成开放以及如何快速量化细菌菌株的话语有很好的了解。不要忘记，使用合成基因和转基因生物可能非常危险。根据现行法律，他们必须遵守，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如高压灭菌转化的细菌。