Name: 通过创建一个的合成Curli的操纵子工程粘附的细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 了解如何通过合成Curli操纵子工程化大肠杆菌以增强其粘附特性。本研究利用共聚焦显微镜和结晶紫染色技术可视化生物膜形成，为生物修复和合成生物学应用提供了一种简化的基因工程替代方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢里昂INSA-ENS iGEM团队的其他成员（Viviane Chansavang、Mathilde Dumond、Alexandre Duprey、Mélanie Geffroy、Clémence Gonthier、Margaux Jaulin、Aurélie Haag、Goki Ly、Thomas Poinsot、Béryl Royer-Bertrand、Julie Soula、Michael Vonzy、Pierre Yves Zundel、Soufiane Bouhmadi、Olivier Brette、Gaël Chambonnier、Laura Izard、Aurianne Kroiss、Philippe Lejeune、Agnès Rodrigue、Arnaud Rondelet、Sylvie Reverchon 和 Valérie Desjardin），感谢我们的赞助方提供的资金支持（bioMérieux、Assystem、EDF、Fondation INSA、ENS-Lyon 以及 INSA-Lyon 生物科学系），感谢 F. Wisniewski-Dyé 对本文稿的审阅，以及感谢 Sze C.C. 博士提供菌株。B. Drogue 获得了罗讷-阿尔卑斯大区提供的博士奖学金。

1. 纤维状菌毛操纵子的生物砖设计与合成
<ol>
	<li>确定纤维素基因的遗传结构，并定位其内源性转录和翻译信号。这些信息收录于RegulonDB等专业数据库中a 或 EcoGeneb 并通过仔细阅读相关出版物完成。数据管理和 计算机模拟 使用Clone Manager软件进行预分析c.</li>
	<li>选择相关的编码序列。一组五个合成curli所必需的基因（csgB 和 csgA 编码纤维单体）和输出（csgE csgF 和 csgG 编码卷曲素分泌复合体的基因被选中用于构建合成操纵子。从数据库中以FASTA格式提取所选序列。 
	随着 csgGFE 簇为反义链 E. coli 基因组，使用 Clone Manager 工具中的操作功能将该序列转换为其反向互补序列&gt; 处理分子&gt;翻转分子。粘贴 csgEFG 序列之后 csgBA 通过使用“Ligate”功能（Clone&gt; 连接）</li>
	<li>添加合适的启动子。通过将五个选定的鞭毛素基因置于启动子P的调控之下rcn，预计在钴和镍存在的情况下，菌毛将过量产生。 rcn 基因座编码一种外排泵，负责镍和钴的解毒作用（rcnA）及其同源的金属调控蛋白（rcnRRcnR 调控基因的表达 rcnA 及其在镍和钴作用下的自身基因响应 19。该 rcn 序列包含 rcnR CDS，完整序列 rcn 基因间区域加上前41个核苷酸 rcnA 放置在前方 csgBAEFG 嵌合序列（图1，整个构建体的序列作为补充数据提供。</li>
	<li>优化转录信号。在第一个ATG上游添加了完美的核糖体结合位点（或称完美RBS = AAGGAGGTATATA） csgBA DNA序列。在……前方添加了第二个完美的RBS csgEFG 序列。内源性 RBS 用于 csgB 和 csgF 和 csgG 基因具有保守性。</li>
	<li>为了符合iGEM标准，该装置必须两侧分别带有标准BioBrick前缀和后缀，其中包含用于限制性酶切的酶切位点 生态RI, PstI（前缀）和 光谱我与 XbaI（后缀）。在装置的每一端粘贴相应的序列d.</li>
	<li>消除任何 生态RI, Pst我， Spe我与 XbaI识别位点。为了便于后续的组装过程，BioBrick元件本身不应包含任何这些限制性酶切位点。对器件进行计算机限制性酶切分析发现其中一个 PstI 位点 csgA 序列，一个 PstI 位点 rcnR 序列和一个 生态RI 酶切位点在 csgE 基因。这些位点分别位于装置序列的第80位（Mut1）、第1340位（Mut2）和第1830位（Mut3）（补充数据），并通过同义突变进行如下修饰。 
	Mut1 PstI 位点 CTGCAG 变为 CGTCTG 
	Mut2 PstI 位点 CTGCAG 变为 CAGCAG 
	Mut3 生态RI位点GAATTC变为GAATT</li>
	<li>使用 Clone Manager 软件运行翻译模拟（操作&gt;处理分子&gt;使用序列比对程序 BLAST 验证野生型卷曲菌毛蛋白与合成操纵子编码的蛋白质之间是否存在完全同源性。</li>
	<li>订购合成操纵子。全球有多家公司提供商业基因合成服务，我们的合作伙伴是 Genecust（卢森堡）。4 &mu;几周后收到了人工操纵子（3165 bp）的片段，并将其插入至pUC57中（pIG2）。</li>
</ol>
2. 在聚苯乙烯表面可视化并定量粘附细菌
<ol>
	<li>向24孔聚苯乙烯板的每孔中加入2 ml M63最低培养基（含0.2%葡萄糖），并向每孔接种106个过夜培养的菌体细胞。在30℃下培养细菌 &deg;C下孵育18至48小时，期间不振荡。每列（4个孔）代表一种处理方式。加入适量的钴（25至100 mM）和抗生素（氨苄青霉素100） &mu;g.L-1必要时使用。24孔板的前3行孔位用于实验 定量 通过取3次重复的平均值来计算贴壁细菌，最后一行左侧的数据被使用 可视化 生物膜</li>
	<li>对于前3行 24孔板：每个孔中收集含有浮游细胞的上清液。</li>
	<li>用 1 ml M63 轻柔地冲洗每个孔，并将 1 ml 洗液与步骤 2.2 中获得的初始上清液合并。此合并液称为游动细胞（=S）。</li>
	<li>用移液器刮取并反复吹打，将生物膜重悬于1 ml M63培养基中（=B）。涡旋振荡15秒。通过测定600 nm处的光密度（OD600）估算附着于表面的细菌和游动细菌的数量，计算每种条件下的黏附百分率。</li>
	<li>黏附率的计算公式为：B×100/(3×S+B)。</li>
	<li>仅适用于最后一行 弃去24孔板中的浮游细胞。</li>
	<li>用1 ml M63缓冲液冲洗培养皿底部形成的生物膜。</li>
	<li>将敞口培养皿在80℃下干燥1小时 &deg;C.</li>
	<li>加入100 &mu;每孔加入20%结晶紫溶液1毫升，染色2分钟，随后用大量水充分洗涤，以观察表面附着的细菌。 
	必须进行三次独立的实验（培养板），以确保可重复性。</li>
</ol>
3. 通过显微镜观察玻璃表面黏附的细菌
<ol>
	<li>获取一个荧光底盘。 E. coli SCC1e 表达绿色荧光蛋白（GFP）的稳定菌株，与亲本菌株MG1655相比无可见差异 20 是携带合成卷曲菌毛操纵子质粒的合适宿主。</li>
	<li>将 pIG2 质粒（=插入合成卷曲菌毛操纵子）转化入 SCC1 中 生态RI/Pst将 SCC1 转化至 pUC57 质粒的 I 位点以获得 S23 菌株。将 SCC1 转化至对照质粒（pUC18）以获得对照菌株 S24 21.</li>
	<li>在30℃下过夜培养S23菌株及对照菌株（S24）的预培养物 &deg;C 在添加了葡萄糖（0.2%）和氨苄青霉素（100）的 M63 培养基中 &mu;g.L-1).</li>
	<li>在培养皿中接种15 ml相同培养基，并加入100 &mu;l 的预培养物。加入适当浓度的钴（即 25 &mu;M），并设置不含钴的阴性对照。每个培养皿中放入3块矩形玻璃盖玻片，于30℃过夜培养。 &deg;C，不振荡。</li>
	<li>从培养皿中取出盖玻片并小心沥干。用浸有70%乙醇的小棉签轻轻擦拭其底面。 &deg; 用乙醇擦拭去除所有细菌残留物。进行共聚焦观察时，将两端上方几毫米处擦拭干净，以便后续固定盖玻片。</li>
	<li>可在荧光显微镜下直接快速观察贴壁细菌，但需小心避免样品干燥。</li>
	<li>进行共聚焦观察时，将盖玻片放置在载玻片上，使覆盖有生物膜的一面朝上。然后用更大的盖玻片覆盖生物膜，并用清漆将盖玻片固定在载玻片上。将整个装置倒置，使生物膜位于下方。</li>
	<li>将装置置于共聚焦激光显微镜下。Platim 平台使用的是 Axioplan2 LSM510（Zeiss）共聚焦激光显微镜。f.</li>
	<li>设置。在488 nm处激发GFP，收集500至600 nm范围内的细菌荧光。使用40倍油浸物镜以激光扫描共聚焦模式采集图像。以1 μm为步长，从固体表面至培养基界面扫描生物膜的整体三维结构。 &mu;m</li>
	<li>使用 IMARIS 软件（Bitplane，Zürich，瑞士）进行三维投影。通过分析统计学纵向切面的平均 z 值来确定生物膜厚度。生物膜生物体积的定量可从共聚焦 z 层扫描图像中提取，具体方法见其他文献。 22.</li>
</ol>
aRegulonDB 提供关于操纵子结构及其分解为转录单位、启动子及其σ因子类型、基因及其核糖体结合位点、终止子、特定转录调控因子的结合位点，以及这些元件如何组织成调控短语的机制信息。<a href="http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp" target="_blank">http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp</a>
bEcoGene 数据库包含有关大肠杆菌（E. coli）K-12 基因组和蛋白质组序列的最新信息，包括广泛的基因文献资料。EcoGene 的一个主要研究重点是对翻译起始位点的重新评估。<a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a>
c<a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a>
d<a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=帮助:BioBrick前缀和后缀</a>
e由新加坡南洋理工大学司春朝赠送。
fPlatim 显微成像平台 UMS3444 生命科学格兰德 - 里昂南。

<ol><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+sensor+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li>
<li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li>
<li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li>
<li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains%3A+role+of+flagella%2C+curli+and+colanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li>
<li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Zn%28II%29%2C+Cu%28II%29%2C+and+Fe%28II%29+ions+to+Alzheimer%27s+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li>
<li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li>
<li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li>
<li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li>
<li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpxR%2FOmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li>
<li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li>
<li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li>
<li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li>
<li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site%3A+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li>
<li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li>
<li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere%3A+new+perspectives+for+studying+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li>
<li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandini%2C+P+%22Biological+Adhesives%22">Biological Adhesives</a>. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).</li>
<li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li>
<li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li>
<li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JE+%22Experiments+in+molecular+genetics%22">Experiments in molecular genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

关键步骤
在这一合成生物学方法中，最关键的步骤是基因设计。合成基因的设计必须细致严谨，以确保系统能够高效生产。本研究将编码纤维单体的两个基因以及编码其分泌系统相关蛋白的三个基因，与一个强效且金属诱导型启动子组装在一起，构建出一个用于新应用的功能单元：核废液的生物净化。正如预先设计和预测的那样，该装置可显著增强curli的高产量表达，且随着培养基中钴浓度的增加，表达效果进一步增强。这一成功得益于所选启动子（PrcnA）中存在合适的转录信号，以及在每组curli基因（csgBA 和 csgEFG）前方添加的高效翻译信号（见图3）。此外，在使用多拷贝质粒时，必须注意参与启动子调控的调节因子的拷贝数。本实验中，所用启动子（PrcnA）的主要调节蛋白RcnR也由同一质粒提供多个拷贝（图3）。
局限性及可能的改进方案
为确保实验结果具有完全的可重复性，黏附实...

细菌对非生物载体的黏附在生物修复、生物催化或微生物燃料电池中起着重要作用。生物修复过程利用微生物降解有机物，或改变金属的分布（固定化、挥发）或形态。这些有益的微生物活动不仅存在于水生和陆地生态系统中，也出现在为处理工业和生活污水而开发的人工系统中。微生物活动的强度和质量取决于理化因素，同时也受微生物生活方式（自由漂浮或形成生物膜）的影响。生物膜的形成伴随着代谢变化，可通过多种机制增强对杀菌剂的抗性。因此，在大多数生物修复过程中，应促进生物膜的形成。此外，通过基因工程改造大肠杆菌（Escherichia coli）以调控其生物膜形成，已成功应用于将全细胞传感器固定在生物芯片上2-3。
微生物对高浓度金属的适应通过多种机制实现，例如吸附到胞外基质组分、激活外排泵或能够将金属富集到细胞内的特异性载体。通过基因工程增强这些细菌活性，可在实验室规模实现对金属污染的高效且低成本处理，尤其适用于如Raghu所述的微量高毒性金属。 等 2008 4细菌修复在此情况下是一种相较于使用离子交换树脂的传统化学工艺更具竞争力且成本更低的方法。作者描述了一种 大肠杆菌 通过敲除编码外排泵的基因，对底盘细胞进行基因工程改造以实现钴的吸收与滞留 rcnA，然后通过转化一种多拷贝质粒，该质粒可过表达一种优先摄取钴的转运蛋白. 这种菌株作为处理放射性废水的离子交换树脂的有效替代方案具有潜力，但该工艺结束时受污染细菌的回收仍是尚未解决的关键问题 4因此，我们工作的目标是构建一种能够黏附于玻璃或塑料等非生物载体的定制化菌株。
在已鉴定的革兰氏阴性菌的全部黏附素和黏附菌毛中，我们选择设计一个能够表达卷曲纤维的系统。卷曲纤维是直径为2-5 nm、高度聚集的淀粉样纤维，从细菌表面突出 E. coli 和 沙门氏菌 非晶态且不溶性的基质表面 5-7纤维菌毛还参与非生物表面的定植以及生物膜的形成 8最近研究表明，卷曲菌毛可结合汞离子 9淀粉样蛋白确实已知对金属离子（如Cu）具有高亲和力。2+，Zn2+ 和 Fe3+ 10这一特性可能进一步提高对金属污染废水的净化效果。 csg 簇负责产生纤维素样纤维，由两个转录方向相反的操作子组成（图1）。该 csgB, csgA 和 csgC 基因构成编码菌毛两个亚基CsgA和CsgB的正向操纵子。CsgC似乎参与菌毛生物合成系统中的氧化还原反应，并影响CsgG孔道的行为。 11然而，大多数产纤毛菌中缺乏 csgC，表明其对应的蛋白质仅对纤毛生物合成提供次要水平的调控。为了简化系统，我们选择仅使用最少数量的基因进行研究。
的 csgDEFG 操纵子编码对CsgA和CsgB调控及转运至细胞表面至关重要的蛋白质。CsgD是该操纵子的转录激活因子。 csgBAC 操纵子，在通过调控纤连蛋白（curli fimbriae）及纤维素等生物膜组分的生成来控制生物膜形成过程中发挥关键作用 12 并通过抑制鞭毛的产生 13CsgE、CsgF 和 CsgG 构成外膜中一种纤维素特异性的分泌装置，主要纤维素亚基蛋白 CsgA 以可溶性蛋白形式通过该装置分泌。CsgA 的聚合依赖于 体内 膜结合的成核蛋白 CsgB（综述见于 14). 已发现涉及多个双组分系统的复杂调控通路可控制curli基因的表达 15-16这些复杂的调控机制使细菌能够响应环境信号，通过产生纤维素形成致密的生物膜，但在工业应用中难以控制。为了在工业过程中便于回收富集金属的细菌，确实需要通过明确定义的参数来调控细菌在固体载体上的固定。纤维素的黏附特性与其淀粉样性质相关 17 并可用于改进生物修复过程，但需要开发一种更简单且易于控制的装置。
在这7个基因中 18，一组合成纤维素所必需的5个核心基因（csgB 和 csgA 编码纤维单体）并输出（csgE csgF 和 csgG 编码卷曲菌毛分泌复合物）被选中用于构建合成操纵子。为了摆脱卷曲菌毛的“天然”调控，构建了一个包含这5个 csg 由强效且可被钴过量诱导的启动子控制的基因（图2设计并合成了编码卷曲纤维的基因区域，并描述了功能性合成操纵子的逐步分析与设计流程。同时介绍了两种用于可视化和定量分析细菌在聚苯乙烯和玻璃表面黏附的方法。

<table><tbody><tr><td>pIG2</td><td></td><td></td><td>含有一个3165 bp EcoRI/PstI片段的pUC57（pMB1 ori，2710 bp），该片段包含合成的P&lt;em&gt;rcn&lt;/em&gt;-&lt;em&gt;csgBAEFG&lt;/em&gt;操纵子；Amp&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>pUC18</td><td></td><td></td><td>多拷贝质粒（pMB1 ori，2686 bp），Amp&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>S23</td><td></td><td></td><td>SSC1（= GFP标记的MG1655，C.C. Sze惠赠）/pIG2</td></tr><tr><td>S24</td><td></td><td></td><td>SSC1/pUC18</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td><td>0.1 M 储存液，室温保存</td></tr><tr><td>M63</td><td></td><td></td><td>29</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Nunc</td><td>55429</td><td>聚苯乙烯24孔板</td></tr></tbody></table>

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

本文所述方法通过将最少数量的卷曲纤维基因置于强效且可被金属过量诱导的启动子控制下，重新设计大肠杆菌（E. coli）的黏附特性，并对细菌黏附能力的提升效果进行可视化与定量分析。该方法应用了合成生物学中抽象化与标准化的适当工程学原理，最终构建出生物砖（Biobrick）元件BBa_K540000（iGEM 2011年度最佳新工程化生物砖器件）。
第一步是设计合成操纵子，使其响应金属离子并促进纤维素的过量表达，从而增强野生型菌株的黏附能力。原始的纤维素操纵子经过了改造 计算机模拟 为了优化转录和翻译信号并逃逸纤维素的“天然”调控。该方法使我们能够成功验证当前对纤维素生成机制的理解。此外，通过将内源性复杂启动子（已鉴定出十余种转录调控因子）替换为简单的金属调控启动子，简化了纤维素的调控，从而使黏附过程更易于控制。
第二步包括通过实施简单方法对黏附能力进行定性和定量评估。这些方法适用于多种黏附性细菌，而不论其生物膜形成过程中涉及的生物结构如何。在24孔聚苯乙烯板中进行的黏附试验，可在结晶紫染色后快速初步观察细菌生物膜。该定性试验可通过量化黏附百分比进一步优化。此方法极为简便，且比此前所述仅使用结晶紫染色的方法更为准确1，具有良好的重复性和可重复性。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察载玻片上GFP标记的细菌，可直接观察黏附现象，从而进一步验证24孔板试验所得结果。

in silico 对与转录和翻译信号优化相关的 E. coli K12 野生型 csg 序列进行注释，从而设计出如图3所示的单一合成卷曲纤维操纵子 Prcn-csg（完整序列见补充数据）。采用方案2和方案3来观察和量化与卷曲纤维产生相关的黏附能力。通过在24孔聚苯乙烯板上进行结晶紫染色（方案2），可快速观察到每个孔底部的生物膜形成情况，结果显示野生型菌株的黏附能力弱于工程菌株，表现为紫色染色强度的差异（图4A）。该定性结果通过定量测定得到进一步支持，定量数据显示工程菌株的黏附率高出1.5倍（图4B）。此外，定量方法的精确性使得能够在钴离子浓度递增条件下检测到黏附能力的显著增强。事实上，在钴离子浓度分别为0 μM、25 μM和50 μM的培养基中，黏附细胞的比例分别达到25%、30%和40%（图4B）。还可通过在载玻片上培养表达GFP标记的细菌并结合显微镜观察来比较黏附能力。落射荧光显微镜观察结果（黑色背景上的绿色细菌）显示，工程菌...

本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E. coli底盘细胞过量表达这些淀粉样蛋白和黏附性聚合物后，其黏附能力显著增强1。文中还介绍了简便的黏附性可视化与定量方法。

此处所述方法通过在特定调控元件控制下组装最少数量的卷曲纤维基因，以重新设计大肠杆菌的黏附特性。

以下实验的总体目标是赋予细菌黏附特性，以促进其从液体培养基中的分离。首先通过设计一种合成的卷曲纤维，绕过复杂的基因调控，从而实现黏性多聚体的简易且大量生产。第二步是在聚苯乙烯表面可视化并定量具有黏附性的细菌，以便快速评估该合成装置的效率。接下来，通过共聚焦显微镜在玻璃表面观察黏附的细菌。为了直接观察生物膜并获取其结构信息，实验结果表明，携带合成装置的菌株在黏附程度和黏附百分比测量以及显微观察方面均显示出显著增强的黏附能力。相较于传统克隆等现有方法，合成生物学方法的主要优势在于，能够快速获得仅包含绝对必需基因及适当调控信号的构建体。该方法有助于回答生物修复领域中的一个关键问题，例如解决从放射性废物中去除负载金属的细菌的难题。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为需要具备基因调控信号和数据库操作方面的基础知识。可视化演示将重点展示生物膜的定量分析与可视化，因为这两个步骤由于生物膜结构的脆弱性而极难掌握。设计合成卷曲菌毛的第一步是确定卷曲基因的遗传结构，并定位其内源性的转录和翻译信号。这一步可通过使用专门的数据库（如 REON DB 或 eco gene）来完成。下一步是选择合成卷曲菌毛所必需的五个基因：CSGB 和 CSGA 负责编码纤维单体，而 C-S-G-E-C-S-G-F 和 CSGG 则编码卷曲分泌复合物。从数据库中提取所选序列后，将以 FASTA 格式进行数据管理，并使用 Clone Manager 软件进行计算机预分析，因为 C-S-G-G-F-E 基因簇在大肠杆菌基因组中为反义链。该序列需要转换为其反向互补序列。使用克隆管理工具中的操作流程“分子反转”，通过连接功能将C-S-G-E-F-G序列粘贴至C-S-G-B-A之后。接下来，在C-S-G-B-A-E-F-G iCal序列前端添加适当的启动子PRCN。RCN 基因座编码一种 FLX 泵 RCNA，负责镍和钴的解毒，以及其对应的金属调节蛋白 RCNR。在没有钴或镍的情况下，阻遏蛋白 RCNR 会结合到 DNA 上的 RCNR 结合位点，阻止下游基因的完全转录激活。当细胞内钴或镍浓度升高时，钴或镍与 RCNR 蛋白结合，阻止阻遏蛋白与启动子结合，从而使 P-R-C-N-A 的转录活性增强，将五个选定的卷曲基因置于该启动子的调控之下。预测在钴和镍存在的情况下，PRCN 卷曲蛋白的产量会过高。随后通过在 CS gba DNA 序列的第一个 ATG 前添加一个完美的核糖体结合位点（RBS），以及在 C-S-G-E-F-G 序列前添加第二个完美的核糖体结合位点（RBS），来优化转录信号。为了符合 IGMs 标准，该装置必须在两侧分别带有标准生物砖前缀和后缀：前缀包含 ECO R one 和 X-bar one 的限制性酶切位点，后缀包含 SPE one 和 PST one 的限制性酶切位点，以方便后续组装。生物砖部件本身不应包含任何EcoR I、Pst I、Spe I和XbaR I的识别位点。因此，通过计算机中的限制性分析发现，CSGA序列中存在一个Pst I位点，RCNR序列中存在一个Pst I位点，CSGE基因中存在一个EcoR I位点。这些位点已通过同义突变进行修饰。合成基因序列设计完成后，使用克隆管理软件进行翻译模拟。利用序列比对程序 blast 验证野生型卷曲蛋白与合成基因所编码蛋白之间是否完全同源。对 24 孔聚苯乙烯板的每个孔进行如下操作：加入 2 毫升含 0.2% 葡萄糖的 M63 最小培养基，并接种 10⁶ 个过夜培养的细菌细胞。将细菌在 30°C 条件下静置培养 18 至 48 小时。24 孔板的每一列代表一种处理方式。根据需要加入适量的钴和抗生素。前3行用于通过3次重复实验的平均值来定量A类黏附细菌。24孔板前3行每孔中的上清液含有浮游细胞，需将其收集并转移至溶血管中，剩余的最后一行则用于在18至48小时后通过结晶紫染色观察生物膜。用一毫升 M 63 培养基小心冲洗每个孔，并用初始上清液将洗涤液收集至溶血管中。此收集液称为游动细胞，记为 S。微孔板各孔底部附着有黏附细胞。为回收生物膜，向每个孔中加入一毫升 M 63 培养基。用移液器枪头刮取细胞，反复吹打混匀，然后将生物膜组分转移至新的溶血管中。涡旋振荡管子15秒。将生物膜组分收集至溶血管中。该菌池代表贴壁生长的细胞，称为B。从溶血管中转移200微升上清液及生物膜组分至96孔板中。通过在600纳米处测定光密度，估算贴壁细菌和游动细菌的数量。每种处理方式的黏附率按以下公式计算：B乘以100除以（3倍S加B）。为了仅对24孔板最后一行的生物膜进行可视化观察，需弃去这些孔中的浮游细胞。向每个孔中加入一毫升 M 63，以冲洗在孔底形成的生物膜。将未加盖的板在 80 摄氏度下干燥一小时。一小时后，向每个孔中加入 100 微升 20% 结晶紫溶液，作用两分钟，随后用大量水充分洗涤。本方案需要使用荧光底盘菌株。携带合成卷曲菌毛基因的质粒的合适宿主是大肠杆菌（E. coli）SCC1 菌株，该菌株组成型表达绿色荧光蛋白，且与亲本菌株 MG1655 无明显差异。将携带合成卷曲菌毛的 pUCK57 质粒转化至宿主菌株中，以获得 S23 菌株。将对照质粒 pUCK18 转化至宿主菌株中，以获得对照菌株。将 S 23 和 S 24 菌株的预培养物在 30 摄氏度下于添加了葡萄糖和氨苄青霉素的 M 63 培养基中过夜培养。次日，在培养皿中加入 20 毫升 M 63 培养基，然后取 100 微升预培养物接种至含 15 毫升 M 63 培养基的培养皿中。加入适当浓度的钴，并设置不含钴的阴性对照。向每个培养皿中放入三块矩形玻璃盖玻片。在30摄氏度下静置培养过夜。随后几天可直接在荧光显微镜下观察细菌。避免样品干燥非常重要，因此以下步骤必须小心且迅速地进行。将每个盖玻片从培养皿中取出并小心沥干。用浸有70%乙醇的小棉签仔细擦拭其底面，以清除所有细菌残留物，便于共聚焦观察。将盖玻片放置在载玻片上，使覆盖有生物膜的一面朝上。然后用更大的盖玻片覆盖生物膜，并用清漆将盖玻片固定在载玻片上。将装置倒置，使生物膜位于下表面。在此实验中，将装置置于共聚焦激光显微镜下。本实验采用CT微平台内的Zeiss LSM 510 meta共聚焦激光显微镜。选择40倍油镜物镜。使用以下设置：在488纳米波长下激发GFP，并在500至600纳米范围内收集细菌荧光信号。使用40倍油镜物镜进行图像采集。在激光扫描共聚焦模式下，从固体表面到培养基界面，以1微米为步长，扫描生物膜的整体三维结构。使用maus软件进行三维投影，通过分析统计学纵向切面的平均C值来确定生物膜厚度。生物膜的定量分析以及生物体积可从共聚焦Z层扫描图像中提取。可通过简单方法评估大肠杆菌在响应金属刺激而过表达卷曲菌毛后的黏附能力。例如，在24孔抛光Irene板上进行结晶紫染色，可快速观察到每个孔底部生物膜形成的程度，表现为紫色深浅的差异。结果显示，野生型菌株的黏附能力弱于工程菌株。一种定量方法是测量野生型和工程菌株在不同浓度钴存在下对聚苯乙烯表面的黏附百分比。该图所示结果表明，在无钴条件下，工程菌株的黏附率比野生型菌株高1.5倍。此外，在含钴培养基中，随着钴浓度增加，黏附能力显著增强；当钴浓度为25 µM或50 µM时，工程菌细胞的黏附率分别达到30%和40%。还可通过显微镜比较黏附能力：将表达GFP标记的细菌在玻片上培养后，利用落射荧光显微镜在黑色背景下观察绿色细菌，结果显示工程菌株形成生物膜，而野生型菌株仅形成微菌落，如箭头所示。共聚焦显微镜分析可提供生物膜三维结构的整体视图。A图显示顶视图重建结果，B图显示侧视图重建结果。结果证实，工程菌株比野生型具有更强的黏附性，并形成更致密且更厚的生物膜。在进行该实验操作时，务必仔细检查实验设计，例如，在放射性废水处理背景下，探究经修饰的大肠杆菌或蚁生菌的生物介导潜力。观看本视频后，您应能够充分了解如何使用 Clone Manager 软件设计合成引物，以及如何快速定量细菌菌株的表达水平。请务必注意，操作合成基因和转基因生物可能具有极高危险性。实验必须遵守现行法律法规，操作过程中应始终采取必要的预防措施，例如对转化后的细菌进行高压灭菌处理。

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过创建一个的合成Curli的操纵子工程粘附的细菌

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

细菌会产生分泌性化合物，这些化合物可能影响其邻近微生物的生理活动。本文介绍了一种共培养筛选方法，通过在固体培养基上将土壤微生物与荧光转录报告菌株 Bacillus subtilis...

利用共培养检测化学介导的种间相互作用

本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX...

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

本文介绍了一系列用于开发工程化细胞和功能化表面的实验方案，这些方案能够使合成工程化的大肠杆菌（E.

利用合成生物学构建可与可编程材料相互作用的活细胞

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

本文介绍了一种将低成本商用3D打印机改造为细菌3D打印机的方法，该设备可用于打印具有特定图案的生物膜。文中详细描述了生物打印机和生物墨水制备所需的所有关键步骤，以及用于评估生物膜形成效果的验证方法。...

使用自制生物打印机对工程化生物膜进行三维图案化

我们描述了一种利用基于mini-Tn7的表达系统，在已构建的外排泵缺陷型鲍曼不动杆菌（Acinetobacter...

表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统&#45;缺陷型细菌菌株与单拷贝&#45;单拷贝基因表达系统

本文介绍了一种设计、构建和递送基于四环素调控的可诱导合成回路的实验方案。通过利用本方案所提供的技术流程，可研究合成回路对寄生虫清除及细胞因子表达的影响。该方案适用于从事感染性疾病中基于合成回路治疗研究的科研人员。...

感染中的免疫代谢回路推动宿主导向治疗的发展

本文介绍了一种逐步操作方案，演示如何将模块化克隆（MoClo）技术应用于多顺反子操纵子的克隆。...

使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

了解如何通过合成Curli操纵子工程化大肠杆菌以增强其粘附特性。本研究利用共聚焦显微镜和结晶紫染色技术可视化生物膜形成，为生物修复和合成生物学应用提供了一种简化的基因工程替代方案。

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

探索更多视频