Name: 一个工具包，使水环境中的烃类转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 28 s
Description: 了解利用合成生物学技术构建的工程化大肠杆菌系统，通过BioBricks模块化设计增强烷烃降解能力，用于水环境油污染修复。该方法为环境微生物治理提供了可持续的解决方案。

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本视频文章中描述的实验是为国际基因工程机器大赛 9 设计的。作者谨此感谢 iGEM 团队成员 Luke Bergwerff、Pieter T.M. van Boheemen、Jelmer Cnossen、Hugo F. Cueto Rojas 和 Ramon van der Valk 在研究过程中提供的协助。感谢 Han de Winde、Stefan de Kok 和 Esengül Yıldırım 提供的有益讨论及对本研究的支持。本工作得到了代尔夫特理工大学生物技术系、代尔夫特生物信息学实验室、代尔夫特理工大学生物纳米科学系、油砂领导力倡议（OSLI）、StuD 学生派遣局、荷兰基因组学倡议、Kluyver 中心、荷兰生物技术协会（荷兰生物技术基金会）、DSM、Geneart、Greiner bio-one 和 Genencor 的资助与支持。

1. BioBrick 组装
<ol>
 <li>来自标准生物部件注册库（Registry of Standard Biological Parts）的 BioBrick 由 iGEM 总部提供。要利用已有 BioBrick 构建新的 BioBrick，可使用 EcoRI 和 SpeI 酶切供体 BioBrick（最多 1.0 μg），以将供体部件定位在受体部件的下游；若要将供体部件定位在受体部件的上游，则使用 XbaI 和 PstI 进行酶切。同时添加第三种合适的限制性内切酶，用于切割供体的质粒骨架。根据供应商说明，在适当的缓冲液中进行酶切反应，总体积为 20–25 μL（终浓度为 1×）。限制性内切酶的用量为 5 单位/μg DNA。</li>
 <li>使用 EcoRI 和 XbaI 或 SpeI 和 PstI 酶切受体 BioBrick。</li>
 <li>在 37 °C 下孵育酶切反应体系至少 1 小时。通过 80 °C 加热 10 分钟使限制性内切酶失活，并短暂离心。</li>
 <li>将酶切后的 BioBrick 部件（供体与受体）连接在一起。由于 XbaI 和 SpeI 产生兼容性 DNA 末端，因此会形成一个无法被任何限制性内切酶切割的杂合位点，从而生成一个新的“组合型” BioBrick，其两侧由 4 个标准限制性酶切位点所包围。连接反应体系中 DNA 的终浓度建议约为 100 ng/μL。在 T4 连接缓冲液（终浓度 1×）和 T4 DNA 连接酶（1 单位/μg DNA）存在下，总体积为 10–15 μL 中进行连接反应。</li>
 <li>将连接反应体系在 16 °C 下孵育至少 3 小时。</li>
 <li>使用约一半的连接产物进行转化反应。</li>
 <li>通过测序验证所构建的 BioBrick 是否正确。</li>
 <li>若要从合成 DNA 构建新的 BioBrick，可使用 JCat 网站工具（<a href="http://www.jcat.de/" target="_blank">http://www.jcat.de/</a>）对基因序列进行优化，以实现其在 E. coli 中的最佳表达。还需根据 BioBrick 标准的要求进行进一步修饰。该标准化意味着每个 BioBrick 均由一段目标 DNA 序列组成，其上游为前缀（prefix），下游为后缀（suffix）。前缀和后缀是包含预定义限制性酶切位点的序列，这些位点在质粒其余部分中不存在。这些标准酶切位点使得 BioBrick 插入片段能够灵活地互换和扩展9。前缀和后缀的序列如下：</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>序列</td>
 <td>备注</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>前缀</td>
 <td>5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'</td>
 <td>如果后续部分为编码序列或任何以“ATG”起始的片段</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>后缀</td>
 <td>5' TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
2. 烷烃转化静息细胞实验，体内
本实验根据藤井等人（Fujii et al.，2004）所述方法进行。
<ol>
 <li>在5 ml含有适当抗生素的LB培养基中过夜培养表达烷烃羟化酶系统（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a>）的大肠杆菌（E. coli）细胞，以及携带空载体（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a>）的细胞。</li>
 <li>将过夜培养物500 μl转接到50 ml新鲜LB培养基（含抗生素）中，培养至菌液在600 nm处的光密度（OD）达到0.3。</li>
 <li>以4,000 rpm离心10分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于5 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。</li>
 <li>再次以4,000 rpm离心10分钟，将菌体沉淀重悬于5 ml含有E2盐和0.66% v/v甘油（缺氮培养基）的0.1 M磷酸盐缓冲液中。</li>
 <li>测定细胞浊度（OD600）。</li>
 <li>在25 ml带密封盖的玻璃瓶中，分别准备6 ml的菌液混合物，同时设置无菌对照组（E2盐 + 0.66% v/v甘油）。</li>
 <li>向每个瓶中加入100 nmol烷烃。</li>
 <li>在37 °C下孵育24小时（若反应速率较高，可适当缩短时间）。</li>
 <li>孵育结束后测定OD600。</li>
 <li>用乙酸乙酯萃取培养基中的烃类物质，并通过气相色谱法测定细胞培养物中的烃类浓度（参见方案3）。</li>
 <li>通过将每个瓶中转化的烷烃总量除以该瓶中的总生物量（将OD600换算为干重），计算单位生物量的降解量。再将该结果除以实验持续时间，得到单位生物量单位时间的降解活性。最终结果取三次独立实验的平均值。</li>
</ol>
3. 烷烃转化酶活性测定，体外
该实验基本按照 Li et al.（2008）所述方法进行。
<ol>
 <li>在50 ml含有适当抗生素的LB培养基中，过夜培养表达ladA基因（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a>）的大肠杆菌E. coli细胞，以及携带空载体（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a>）的细胞。</li>
 <li>将过夜培养物500 μl转移至50 ml新鲜LB培养基（含抗生素）中，于37°C振荡培养，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.6。</li>
 <li>在4 °C条件下以4,000 rpm离心10分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于5 ml 50 mM Tris缓冲液中。</li>
 <li>使用超声破碎仪（Cell disrupter, LA Biosystems）对细胞进行超声处理，工作周期设为40%，输出功率控制为4，全程将样品置于冰上。</li>
 <li>将超声后的混合液在4 °C、4,000 rpm条件下离心5分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的洁净离心管中。</li>
 <li>采用Bradford法测定细胞裂解液的总蛋白浓度。注意：应使用玻璃离心管，以避免背景值升高或蛋白损失。</li>
 <li>配制100 ml含0.1% v/v烷烃和50 mM Tris-HCl缓冲液的混合液。</li>
 <li>将混合液于100 °C加热5分钟。注意：此步骤仅适用于高沸点的中长链烷烃（例如 C16：287 °C）。</li>
 <li>为获得最佳烷烃溶解度，在温热状态下继续超声处理1分钟，直至形成均匀且黏稠的混合液。</li>
 <li>加入1 mM NADH、1 mM FMN、1 mM MgSO4和0.01% v/v Triton X-100。</li>
 <li>将上述混合液分装为每份6 ml，置于25 ml带密封盖的锥形瓶中。</li>
 <li>根据Bradford测定结果，向各瓶中加入适量的细胞提取物（终浓度为每升含5 mg蛋白），并设置不含蛋白的对照组。</li>
 <li>在60 °C（酶活性最适温度）下孵育24小时。</li>
 <li>用乙酸乙酯萃取培养液中的烃类物质，并通过气相色谱法测定细胞培养物中烃类的浓度（参见方案3）。</li>
 <li>通过将每瓶中转化的烷烃总量除以加入的总蛋白量（根据Bradford标准曲线确定），计算单位生物量的降解量。进一步除以实验持续时间，可得单位细胞蛋白单位时间内的降解活性。最终结果取三次独立实验的平均值。</li>
</ol>
4. 乙酸乙酯烃类提取与浓度测定
<ol>
 <li>将2.5 ml乙酸乙酯（非极性溶剂）加入6 ml实验溶液中，从水溶液中萃取烷烃。向该溶剂中加入浓度为0.1%（v/v）的内标物。该标准品（例如 环癸烷) 的参数根据目标峰的预期范围而变化。</li>
 <li>可选：向水相混合物中加入 Triton X-100，并以 4,000 rpm 离心 10 分钟，以获得理想的两相体系。</li>
 <li>涡旋混合物5秒（1,500 rpm），室温孵育至两相分离。</li>
 <li>移除尽可能多的有机层（上层），并使用无水硫酸镁干燥溶剂。</li>
 <li>去除 MgSO₄4 通过过滤（0.2 μm）将滤液转移至气相色谱样品瓶中用于检测，或于 -20 °C 保存。</li>
 <li>使用CP-SIL 5CB色谱柱（长度 = 5 m）通过气相色谱法测定浓度。以分流模式（1:10，230 °C）进样10 μl样品。设置载气流速为1 ml/min（氦气）。采用以下程序升温：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>速率</td>
 <td>温度 [°C]</td>
 <td>时间 [min]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0</td>
 <td>50</td>
 <td>7.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>90</td>
 <td>1.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>110</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>130</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>145</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>160</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>170</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>185</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>210</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>250</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50</td>
 <td>320</td>
 <td>2.0</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>使用内标对峰面积进行积分并校正浓度。</li>
</ol>
5. 醇/醛脱氢酶活性测定
该实验基本按照加藤等人（Kato et al.，2010）所述方法进行。
<ol>
 <li>在50 ml含有适当抗生素的LB培养基中，过夜培养表达ADH基因（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018" target="_blank">BBa_K398018</a>）或ALDH基因（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" target="_blank">BBa_K398030</a>）的大肠杆菌（E. coli）细胞，以及携带空载体（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a>）的细胞。</li>
 <li>将过夜培养物500 μl转移至50 ml新鲜LB培养基（含抗生素）中，于37 °C振荡培养，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.6。</li>
 <li>在4 °C条件下，以4,000 rpm离心10分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于5 ml 50 mM Tris缓冲液中。</li>
 <li>将细胞悬液置于冰上，以40%占空比、输出控制为4的条件进行超声破碎。</li>
 <li>将超声处理后的混合液在4 °C、4,000 rpm离心5分钟，以去除细胞碎片。</li>
 <li>采用Bradford法测定细胞裂解液的总蛋白浓度（注意：使用玻璃比色皿以防止蛋白质吸附）。</li>
 <li>在96孔板的每孔中加入180 μl含NAD的57 mM甘氨酸缓冲液（终浓度NAD为1 mM，pH 9.5）。</li>
 <li>向各孔中加入5 μl待测的醇（或醛）。注意：长链醇在实验开始前需加热使其液化。每种醇（或醛）均应设置无底物的对照孔（阴性对照）。此外，还需准备仅含缓冲液和底物但不含细胞裂解液的空白对照孔。</li>
 <li>将酶标仪（Tecan Magellan v7.0）中的96孔板在37 °C预热15分钟，以使系统达到平衡。</li>
 <li>根据Bradford测定结果，加入适量的细胞裂解液（终浓度为5 mg蛋白/L）。同时设置无蛋白对照组。</li>
 <li>在37 °C条件下，每隔2–3分钟于340 nm波长下用分光光度计测定NADH的生成量，持续1小时。</li>
 <li>根据OD340 nm值变化的斜率计算NADH的生成速率。计算时需考虑光程长度及NADH的摩尔消光系数（6220 M-1cm-1）。将NADH生成速率除以所加总蛋白量，以表示细胞裂解液中脱氢酶反应的活性（单位：U/mg全细胞蛋白）。对三次独立实验的结果取平均值并计算标准差。</li>
</ol>
6. pCaiF 表征
<ol>
 <li>培养 E. coli 表达该基因的细胞 pCaiF-GFP 构建体<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331" target="_blank">BBa_K398331</a>）以及仅携带启动子的细胞（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" target="_blank">BBa_K398326</a>在5 ml LB培养基中加入适当的抗生素，过夜培养。</li>
 <li>接种50 μl过夜培养物于5 ml含有10 g/L葡萄糖和抗生素的M9培养基中，过夜培养。</li>
 <li>将50 μl过夜培养物转接至5 ml含10 g/l葡萄糖的新鲜M9培养基中，于37℃振荡培养，直至菌液在600 nm处的光密度值达到0.2。</li>
 <li>在96孔板的每个孔中加入含有预定浓度待测碳源的100 μl新鲜M9培养基。每组实验设置三个重复孔以进行统计学分析，并加入相应的阴性对照（野生型） E. coli K12)</li>
 <li>向含有培养基的孔中加入5 μl过夜培养物。</li>
 <li>测量生长曲线（OD600使用酶标仪每10分钟检测一次荧光值，持续18小时，检测条件为37 °C并持续振荡，分别检测GFP荧光（激发波长485 nm，发射波长520 nm）。</li>
 <li>根据相应测量结果计算生长速率和特异性GFP含量，并与对照组进行比较。计算至少三次独立实验的平均值和标准差。</li>
</ol>
7. 耐受性实验
<ol>
 <li>培养 E. coli 表达 PhPFDα 和 β 基因（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" target="_blank">BBa_K398406</a>在5 ml LB培养基和适当的抗生素中过夜培养。 E. coli 表达 ladA 基因<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a>) 用作阴性对照。</li>
 <li>将10 μl过夜培养物转接至5 ml新鲜LB培养基（含抗生素）中，于37℃振荡培养，直至菌液在600 nm处的光密度值达到0.3至0.4。</li>
 <li>用新鲜培养基稀释菌液，直至 OD600 达到0.1。</li>
 <li>在96孔板中加入含有适当抗生素和正确终浓度毒性化合物的180 μl M9培养基（例如 0、4、8、10% n-己烷）中进行三份平行实验。由于烷烃-水混合物可能形成两相体系，因此在平板中设置适当的对照至关重要（例如 不同菌株及相应的空白实验）。</li>
 <li>向孔中加入20 μl培养物（对照）。</li>
 <li>测量生物量浓度（OD600使用酶标仪在37 °C、持续振荡条件下，每10分钟检测一次，持续24小时。</li>
 <li>根据不同浓度处理组的相应测量值计算生长速率，并与阴性对照组进行比较。计算至少三次独立实验的均值及标准差。</li>
</ol>
8. 同源相互作用图谱绘制
<ol>
 <li>开发了HIM应用程序，用于在运行STRING数据库的PostgreSQL服务器上执行蛋白质查询（学术用途免费）20。该同源相互作用映射应用程序利用STRING数据库识别原始宿主生物体中相互作用的蛋白质。相应相互作用基因的序列被用于BLAST搜索，以在目标生物体中寻找同源基因。使用Cytoscape 4 对映射结果进行可视化。HIM软件工具可在以下地址下载：<a href="https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping" target="_blank">https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping</a>。</li>
 <li>要执行映射操作，(1) 输入BioBrick编号，应用程序将自动从标准生物部件注册库中下载该部件的序列数据9，或 (2) 在应用程序中输入（粘贴）序列数据。</li>
 <li>使用STRING数据库网站查找所输入氨基酸序列对应的STRING蛋白质ID。</li>
 <li>通过BLAST确定具有高度同源性的蛋白质。随后，应用程序列出源生物体中每个已知的相互作用蛋白，并在宿主生物体（例如 E. coli）中搜索其同源蛋白。</li>
 <li>将得到的潜在相互作用列表导出为文本文件或导入Cytoscape。</li>
</ol>

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<li>Center, O. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCenter%2C+OP+%22Understanding+Oil+Spills+and+Oil+Spill+Response%22">Understanding Oil Spills and Oil Spill Response</a>. , (1999).</li>
<li>Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: 
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<li>Rehm, H. J., Reiff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+occurrence+of+microbial+oxidation+of+long-chain+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+%2F+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes.</a> Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).</li>
<li>Rojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+alkanes+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Degradation of alkanes by bacteria.</a> Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).</li>
<li>STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl">http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl</a> (2012).</li>
<li>Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+putida+alkane-degradation+gene+clusters+and+flanking+insertion+sequences%3A+evolution+and+regulation+of+the+alk+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes.</a> Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).</li>
<li>Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+novel+thermophilic+Bacillus+strain+degrading+long-chain+n-alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes.</a> Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

BioBrick 原则被用于构建降解烷烃的底盘系统，并对工具包中各单一组分进行了原理验证。提出了多种检测方法以测量 体内 和 体外 烷烃降解途径酶的活性。本研究所展示的方法成功地证明了可用于测定宿主生物中酶活性与表达水平的多种技术 E. coli 在引入合适的生物砖（BioBricks）后，进一步证明了生物砖原理可用于设计一种表达降解烷烃所需蛋白的生物体，该生物体具备仅在需要时才产生这些酶的调控系统，并能在烃类存在条件下增强宿主生物的耐受性。经过进一步优化后，该底盘系统可应用于残余石油的生物降解。 例如 在油砂尾矿水中，或用于石油工业废水的处理。
关于烷烃降解，通过实验对参与烷烃降解第一步反应的酶（AH系统和ladA）进行了表征。结果表明，一种 E. coli 携带AH系统的菌株 戈登氏菌属 sp. TF6 能够转化辛烷 体内 这一发现与藤井的结果一致 等 8，其中发生生物转化 n-烷烃的使用 <em...

石油污染是造成环境污染最严重的原因之一，对生态系统、企业和社区产生重大影响3。例如，加拿大阿尔伯塔省油砂尾矿废水持续产生的石油污染亟需解决方案。在从油砂中提取原油的过程中，采用热回收技术去除沥青（一种半固态的氧化石油形式），每提取一桶原油约消耗3.1桶水1。含油的工艺废水主要来自当地河流，在沥青提取后被储存在尾矿池中。为了减少对淡水的取用需求，亟需更高效地回收利用工艺废水。为了促进沥青的提取，并确保下游水体达到保护水生生态系统的水质标准，工艺废水处理技术正在迅速发展3。
为了治理有机化合物污染，目前鼓励采用利用微生物的生物修复技术1。烷烃是原油中最丰富的烃类家族，每分子含有5至40个碳原子7, 21。已知许多细菌可通过逐步氧化末端甲基，将不同链长的烷烃依次转化为醇、醛，最终生成脂肪酸，从而实现降解8。在本iGEM项目中，来自不同生物体的多种酶被表达并进行了表征，并通过BioBrick标准及标准生物元件注册库提供使用。
对 Gordonia sp. TF6 中研究较为深入的烷烃羟化酶系统，可在最少四个组分的参与下催化 C5-C13 烷烃以及 C5-C8 环烷烃的初始氧化步骤，这四个组分包括：alkB2（烷烃1-单加氧酶）、rubA3、rubA4（两种红氧还蛋白）和 RubB（红氧还蛋白还原酶）8, 21。据报道，长链烷烃（碳链长度从 C15 至 C36）的氧化由 ladA 催化完成，ladA 是一种来自 Geobacillus thermodenitrificans NG-80-2 的黄素蛋白烷烃单加氧酶 7, 15, 18, 22。ladA 与黄素单核苷酸（FMN）形成催化复合物，并利用原子氧进行氧化反应，从而将烷烃转化为相应的伯醇。这些醇类进一步由醇脱氢酶和醛脱氢酶氧化为脂肪酸，后者可直接进入 β-氧化途径 7, 21。来自嗜热菌 Geobacillus thermoleovorans B23 的一种锌非依赖性醇脱氢酶可利用 NAD+ 作为辅因子，将中链烷醇氧化为其相应的烷醛 10。该菌中的醛脱氢酶能够催化中链烷烃氧化过程中的 NAD+ 依赖性最终步骤 11。
为了降低诱导成本并维持细菌系统的最佳增殖，对来自大肠杆菌（E.coli）的 pCaiF 启动子进行了表征。该启动子可调控烃类降解途径组分的表达，并受 cAMP-Crp 水平的调控，而 cAMP-Crp 水平又取决于葡萄糖浓度6。当环境中胞外葡萄糖浓度较高时，由于 PTS 介导的葡萄糖转运间接抑制了腺苷酸环化酶的活性，细胞内 cAMP（环磷酸腺苷）水平较低。相反，在葡萄糖受限（低浓度）条件下，cAMP 水平升高，Crp 与 cAMP 结合并形成 cAMP-Crp 复合物，该复合物结合至 pCaiF 启动子，从而激活下游组分的转录6, 14。
野生型 E. coli 仅能耐受中等浓度的碳氢化合物。为完善该工具包，必须解决对碳氢化合物的耐受性问题。已知多种有机溶剂耐受性细菌能够在水-溶剂两相体系中存活12。已发现可提高耐受性的分子组分包括能够促进蛋白质正确折叠的分子伴侣。来自Pyrococcus horikoshii OT3 的 prefoldin 系统，由蛋白 phPFDα 和 phPFDβ 组成，已被证明可提高对碳氢化合物的耐受性17。
烷烃转化工具包的构建遵循生物砖（BioBrick）原则，该原则在标准生物部件注册库中有详细记录9。生物砖是包含特定功能插入片段的质粒，其两侧由4个预先定义的限制性酶切位点所包围。生物砖插入片段可灵活扩展，从而实现具有新功能的生物系统的构建。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; K12</td><td>New England Biolabs</td><td>C2523H</td><td></td></tr><tr><td>辛烷</td><td>Fluka</td><td>74822</td><td></td></tr><tr><td>十六烷</td><td>Fluka</td><td>52209</td><td></td></tr><tr><td>1-辛醇</td><td>Fluka</td><td>95446</td><td></td></tr><tr><td>1-十二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126799</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>FMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2253</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker 货号</td><td>7487 889</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞破碎仪</td><td>LA Biosystems</td><td>CD-019</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Amersham pharmacia</td><td>spec 2000</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Magellan v7.0</td><td></td></tr><tr><td>培养箱 </td><td>Innova, 44</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBrickTM K398014：BBa_J23100-BBa_J61100-&lt;em&gt;alkB2&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA3&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA4&lt;/em&gt;- BBa_J61100-&lt;em&gt;rubB&lt;/em&gt;</td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398014&lt;/a&gt;</td><td>烷烃羟化酶系统&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398027：BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ladA&lt;/em&gt; </td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398027&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398027&lt;/a&gt;</td><td>ladA 蛋白生成器&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398018：BBa_J23100-BBa_J61101-&lt;em&gt;ADH&lt;/em&gt; </td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398018&lt;/a&gt;</td><td>ADH 基因片段生成器&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398030：BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ALDH&lt;/em&gt; </td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398030&lt;/a&gt;</td><td>醛脱氢酶（ALDH）生成器&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398326：&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt; </td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398326&lt;/a&gt;</td><td>pCaiF 启动子&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398331：&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt;- BBa_B0032 - BBa_I13401</td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398331&lt;/a&gt;</td><td>pCaiF 测量装置&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398406：BBa_J23002-BBa_J61107-&lt;em&gt;PhPFD&lt;/em&gt;&lt;em&gt;&amp;alpha;&lt;/em&gt;BBa_J61107- </td><td>代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;BBa_K398406&lt;/a&gt;</td><td>溶剂耐受基因簇&lt;br/&gt; 抗性：氯霉素 </td></tr></tbody></table>

一种可在水环境中实现碳氢化合物转化的工具包

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

本研究提出了一种可实现大肠杆菌（Escherichia coli）转化烷烃的工具箱，并验证了其应用的可行性。该工具箱由多个标准化且可互换的元件（BioBricks）9组成，分别用于烷烃的转化、基因表达的调控以及在富含毒性烃类环境中的生存。
一种用于烷烃降解的三步途径被构建于 E. coli 以实现中长链烷烃向相应的烷醇、烷醛以及最终的烷酸的转化。后者通过宿主固有的β-氧化途径进行代谢。为促进中链烷烃（C5-C13）和环烷烃（C5-C8）的氧化，引入了四个基因（alkB2, rubA3, rubA4和 rubB烷烃羟化酶系统 戈登氏菌属 sp. TF68,21 被转化到 E. coli对于长链烷烃（C15-C36）的转化，ladA 基因来自 Geobacillus thermodenitrificans 已实施。对于降解过程所需的后续步骤， ADH 和 ALDH（源自 G. thermodenitrificans被引入10,11通过静息细胞实验测定活性。每个氧化步骤均观察到酶活性。
为了优化过程效率，仅在低葡萄糖条件下诱导表达：使用了一种底物调控型启动子 pCaiF。pCaiF 存在于 E. coli K12 中，可调控参与非葡萄糖碳源降解相关基因的表达。
工具包的最后部分——靶向生存能力——通过溶剂耐受基因 PhPFDα 和 β 实现，二者均来自 Pyrococcus horikoshii OT3. 有机溶剂可通过对蛋白质折叠产生负面影响，诱导细胞应激并降低细胞存活率。作为分子伴侣，PhPFDα 和 β 能够改善蛋白质折叠过程 例如 在烷烃存在条件下。这些基因的表达提高了菌株对碳氢化合物的耐受性，表现为在10%烷烃存在下生长速率提高（最高达50%） n在培养基中观察到正己烷。
综上所述，实验结果表明该工具包能够使大肠杆菌（E. coli）在水相环境中转化并耐受烃类物质。因此，这代表了利用合成生物学方法实现石油污染治理可持续解决方案的初步进展。

烷烃转化
通过静息细胞实验和酶活性测定，评估了从烷烃到相应脂肪酸的三个氧化步骤的活性。结果按照代谢途径的反应顺序呈现：（1）烷烃羟化酶，（2）醇脱氢酶，以及（3）醛脱氢酶。 
对于第一步，分别构建了用于中链和长链烷烃的质粒。<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a> 质粒包含中链烷烃氧化所需的烷烃羟化酶（AH）系统的四个基因：alkB2、rubA3、rubA4 和 rubB，这些基因由一个单一的组成型启动子（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J23100" target="_blank">BBa_J23100</a>）调控。以携带质粒 <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J23100">BBa_J13002</a> 的 E. coli K12 作为阴性对照。通过酶活性测...

利用标准的可互换DNA元件（BioBricks），设计了一种用于修复石油污染的可持续自调控细菌系统。通过β-氧化途径，构建的大肠杆菌（E. coli）菌株可在有毒水环境中降解烷烃。来自不同物种的相应酶均表现出烷烃降解活性。此外，通过引入来自烷烃耐受性细菌的基因，实现了对正己烷（n-hexane）耐受性的提高。

本研究提出了一种可实现大肠杆菌转化烷烃的工具包，并对其应用可行性进行了原理验证。

a-toolkit-to-enable-hydrocarbon-conversion-in-aqueous-environments

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一个工具包，使水环境中的烃类转化

我们描述了一种光催化生成过氧化氢的方案——过氧化氢是氧化转化反应的辅因子。...

光驱动酶促脱羧反应

本文描述了一种采用二维气相色谱-飞行时间质谱法对藻类水热液化所生成生物原油中水相组分进行表征的方法。该方案也可用于分析快速热解、催化快速热解、催化脱氧及加氢处理所得液态产物中水相组分的化学组成。...

利用飞行时间质谱联用二维气相色谱对藻类水热液化水相组分进行定性表征

本文介绍了通过快速热解木质纤维素生物质制备生物油，以及通过催化加氢处理生物油制备燃料级烃类的实验方法。同时评估了快速热解过程中采用热蒸气过滤技术从生物油中去除细小焦炭颗粒和无机污染物的效果。...

通过热蒸气过滤快速热解和催化加氢处理将生物质转化为碳氢液体燃料

This paper presents an experimental method to produce biofuels and biochemicals from canola oil mixed with a fossil-based feed in the presence of a catalyst at mild temperatures. Gaseous, liquid, and solid products from a reaction unit are quantified and characterized. Conversion and individual product yields are calculated and reported.

Laboratory Production of Biofuels and Biochemicals from a Rapeseed Oil through Catalytic Cracking Conversion

本文介绍了一种利用停止-流动微管（SFMT）反应器进行有机反应筛选的实验方案，该方案适用于使用气态反应物和/或可见光介导的反应。...

利用停流微管反应器开发有机转化反应

本文介绍了一种用于合成 HNbWO6、HNbMoO6、HTaWO6 固体酸纳米片修饰的 Pt/CNTs...

调控Pt/CNTs催化剂的酸性以实现二苯醚加氢脱氧

我们介绍了从水生环境中分离、扩增和表征降解烃类细菌的过程。该方案概述了细菌的分离方法、基于16S...

从水生环境分离、扩增与鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌物种

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

利用水相双相系统同时对多种细胞群体进行图案化。这种快速且简便的细胞图案化方法利用了葡聚糖和聚乙二醇水溶液之间的相分离特性以及两种聚合物溶液之间的界面张力。...

使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

了解利用合成生物学技术构建的工程化大肠杆菌系统，通过BioBricks模块化设计增强烷烃降解能力，用于水环境油污染修复。该方法为环境微生物治理提供了可持续的解决方案。

一种可在水环境中实现碳氢化合物转化的工具包

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