一个的趋电含量为神经前体细胞迁移的动力学分析外部施加直流电场

该程序的总体目标是在直流电场存在下可视化成体衍生的神经前体细胞的迁移。这是通过首先从成年小鼠中分离和培养室管膜下神经前体细胞来实现的。下一步是准备 Galvan Axxis 腔室并将神经前体细胞转移到腔室中。

最后一步是在 Galvan Axxis 腔室上施加直流电场并进行延时成像以观察神经前体迁移。最终，延时成像显微镜捕捉了神经前体在分化和未分化状态下的 Galvan 策略特性。虽然这种方法可以提供对神经前体细胞电镀绿洲的洞察，但它也可以应用于其他系统，例如用于将神经前体募集到病变部位以增强神经修复的小鼠中风模型。

演示该程序的是我实验室的研究生 Rob Pilley Post。开始此程序时，NPC 必须在培养物中培养 7 天，以便自由漂浮的初级神经球准备好收获。需要时，通过放置三个方形玻璃开始准备三个 Galvan Axxis 腔室。

第一，盖上盖子，放入一瓶 6 个普通盐酸过夜。第二天一早，设置 matra 凝胶，使其在冰上缓慢解冻。四个小时后，它就可以用来建造腔室了。

首先，使用金刚石尖端玻璃切割机从新方块上切割出六条矩形玻璃条。第一，封面滑落。将酸洗的方形玻片和矩形玻片转移到层流罩中。

用 70% 乙醇清洗玻璃条，然后用组织培养级高压灭菌水清洗。让它们在无绒纸上风干或干燥。接下来，将真空润滑脂涂抹在每个方形载玻片的一个表面的周边，并将它们密封在 60 毫米塑料的底部。

培养皿。在矩形玻璃条的一侧涂抹真空润滑脂，并将其密封到正方形的相对边缘。玻璃滑片形成正方形，每个盘子的中心有一个中央槽。

改性玻璃方块或腔室在通风橱中对这些改性玻璃方块或腔室进行紫外线消毒至少 15 分钟。接下来，将 250 至 300 微升多元醇赖氨酸移液到腔室的中央槽上。然后将腔室在室温下孵育 2 小时，大约在孵育结束前 15 分钟。

两小时后准备 matri 凝胶溶液，吸出多元醇赖氨酸，并用 1 毫升高压灭菌水清洗中央槽。然后将 250 至 300 微升 Matri 凝胶溶液移液到中央槽上，并在 37 摄氏度下孵育腔室一小时。孵育后，吸出基质胶溶液。

然后用 1 到 2 毫升 SFM 轻轻清洗中央食槽。现在将 100 微升 E-F-H-S-F-M 或 F-B-S-S-F-M 移液到中央槽上，为培养的细胞做准备。接下来，将 4 到 5 毫升含有培养物的神经球移液到一个新的 60 毫米培养皿中。

然后将培养皿放在计数显微镜的载物台上，位于 5 x 观察物镜下方。使用 P 10 移液器轻轻地将 5 到 8 个整个神经球转移到每个腔室的中央槽上。最多 4 个。

神经球可以立即转移，但不要将它们与中央槽中的神经球分离。小心地将它们散布在不破坏基质胶基质的情况下。然后在中央槽上再添加 150 微升 E-F-H-S-F-M 或 F-B-S-S-F-M。

现在培养，将细胞放在加湿的培养箱中。培养 17 至 20 小时后，69 至 72 小时后将提供未分化的 NPC。在文化中，将提供差异化的 NPC。

在会计显微镜下，选择具有最佳细胞的腔室以进行活细胞成像迁移分析。细胞应该是圆形的，几乎完全从它们的神经球中解离出来，还没有，或者刚刚开始在引擎盖中形成过程。准备腔室盖。

用 70% 乙醇清洗方形玻璃盖玻片，然后用高压灭菌水清洗，并在两个平行边缘上涂抹一条真空润滑脂。现在盖住腔室。首先，从中央槽吸出培养基，然后快速密封盖子，像屋顶一样滑到矩形墙壁上。

接下来，使用毛细管作用，将 100 微升新鲜培养基加载到中央槽中。现在使用真空润滑脂为培养基池创建边界。在活细胞成像系统的中央槽的每一端，都准备好了 agros 凝胶管、银、氯化银电极和两个 60 毫米培养皿供使用。

作为培养基储液器，让腔室在 37 摄氏度 5% 二氧化碳环境中静置 20 到 30 分钟。在此期间，用 Dremel 或工具移液管在两个空培养皿的盖子和 Galvan Axxis 腔室培养皿的盖子上钻孔，在中央槽的两侧加入 1.5 至 2 毫升培养基，并在每个空培养皿中加入 7 至 8 毫升 SFM。在腔室中央槽的每一侧放置一个培养皿，并将一个电极放入每个培养皿中。

弥合腔室和培养皿之间的间隙以建立电连续性。使用 Agros 凝胶电桥，将电极连接到外部电源，串联 M 表以测量电流并打开电源。使用音量计测量直接穿过中心槽的电场强度。

根据需要调整电源的输出。现在在成像系统上启动延时模块。在 Axio 视觉软件中，选择 Multidimensional Acquisition 并单击 see。

对于通道，选择通道 6，单击 T 进行延时摄影。将延时间隔设置为一分钟，将持续时间设置为 8 小时，在设置之前、之后时间点字段中，选择之前和之后的时间点。现在单击开始，并允许实验在完成检测后运行所需的时间，继续进行 IHC 分析。

运动学分析显示，在每毫米 250 毫伏的情况下，未分化 NPC 表现出在该场强下朝向阴极的高度定向和快速电流 axxis，超过 98% 的未分化 NPC 在成像的整个 6 到 8 小时内迁移。在没有 A-D-C-E-F.观察到细胞的随机运动。

由于死细胞不会迁移，这表明它们在此期间仍然有效。在不存在或存在 A-D-C-E-F 的情况下，分化表型在分化细胞的 A-D-C-E-F 亚群存在和不存在的情况下，分化的表型经历了可忽略不计的迁移。倾向于垂直于 DCEF 方向对齐的扩展过程，但没有观察到明显的细胞体易位。

免疫染色证实 NPC 在 DC EF 暴露 6 小时后保持神经前体标志物巢的阳性表达。在涉及诱导分化为成熟表型的 NPC 的测定中，大多数细胞在 DCEF 暴露 6 小时后表达成熟的星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白或 GFAP。遵循此程序，可以通过使用基因敲除模型深入了解将直流电场转导为细胞运动所涉及的细胞机制。

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