无需电力的核酸与蛋白质分步提取法
2012年5月15日
介绍了一种无需电力即可从样品中依次分离核酸和蛋白质的工具及化学方法。该工具由固定在移液管内的吸附剂组成，分离化学方法基于固相萃取原理。所分离的生物大分子可通过基于免疫检测和PCR的分析方法进行检测。
本实验的总体目标是从样本中分离出可用于PCR的核酸和具有免疫活性的蛋白质，且无需依赖电力或实验室基础设施。核酸和蛋白质的分离首先将样本与胍和硫氰酸盐混合以裂解样本，然后将混合物通过提取移液管中的吸附剂。在第五次也是最后一次通过吸附剂后，将混合物放入蛋白质提取缓冲液中，静置以用于分离免疫活性蛋白质。
接下来，通过将95%乙醇流经吸附剂来洗涤吸附剂及其结合的核酸。随后，多次通过室温空气吹扫吸附剂5分钟，以干燥吸附剂及结合的核酸。用于PCR扩增的核酸分离最后一步是使用250微升Tris缓冲液或其它类似的水溶液洗脱吸附剂上的核酸，从而实现免疫活性蛋白的分离。
将样品与蛋白质提取缓冲液混合后，使用第二支移液管将混合物反复通过吸附剂15次。下一步是用95%乙醇多次通过吸附剂，以洗涤吸附剂上结合的蛋白质。然后通过吸附剂通入环境空气5分钟，使吸附剂及其结合的蛋白质干燥。
该方案的最后一步是从吸附剂中洗脱蛋白质。最终，本实验中使用的提取移液管可实现无需电力即可分离出可用于PCR的核酸和具有免疫活性的蛋白质。大家好，我叫Dave Pawlowski。
我是纽约州布法罗市库布里克公司的一名高级研究科学家，今天我们将学习一种技术，该技术可在无需离心机、涡旋振荡器或其他额外实验设备的情况下，连续分离蛋白质和核酸。在样品裂解前，请确保样品处于液态。如果样品为固态（例如食物或粪便），应将其悬浮于水或磷酸盐缓冲盐水等液体介质中。
在1.5毫升离心管中，将500微升样品与500微升6摩尔的硫氰酸胍混合。接着，按压提取移液管的吸头以排出其中的空气，然后缓慢松开吸头，使整个1毫升样品通过吸附材料被吸入提取移液管中。
将提取工具倒置，使吸附珠和样本流入球部。在球部内将吸附珠与样本研磨，注意不要将样本从提取移液管中挤出。
将提取移液管倒置，将样品排回原来的1.5毫升离心管中。以中等速度将全部1毫升样品吸入提取移液管，使其流经吸附剂。注意保持吸附剂位于提取移液管的管颈处，通过按压吸球将全部样品排入1.5毫升离心管中。
重复此过程，使样品在吸附剂上再过柱四次，共过柱五次。第五次过柱后，将全部一毫升样品排入含有四毫升蛋白质提取缓冲液的15毫升锥形管中。通过倒置混匀管内液体，然后盖上管盖，放置一旁备用。
用1毫升95%乙醇重复过柱洗涤分离的核酸三次，每次将乙醇回收至其原始离心管中。最后一次过柱后，再用第二个1毫升95%乙醇重复洗涤三次。下一步为干燥吸附柱，当吸附柱完全干燥时，核酸回收效果最佳。
我知道这一步很繁琐。但是，如果您在推荐的时间范围内完成此步骤，结果会更好。按压并释放球囊持续五分钟。
使环境空气通过提取移液管，以干燥核酸和吸附床，并用擦拭纸擦去移液管尖端残留的乙醇。使用Kim擦拭纸，通过将250微升10毫摩尔的Tris缓冲液在吸附剂上反复通过五次，回收核酸。Tris缓冲液可用任何其他合适的水溶液（如PBS）替代。
所得溶液含有提取的核酸，用于先进行蛋白质提取。将样品与之前预留的蛋白质提取缓冲液混合，将该五毫升样品中的约两到三毫升转移至新的提取吸附剂上。用移液器将整个样品排入同一个15毫升锥形管中，注意保持吸附剂留在提取移液器的颈部。
重复此过程，使样品在吸附剂中循环15次。用1毫升95%乙醇通过吸附剂床三次，洗涤吸附剂及结合的蛋白质，并将乙醇排入原管；再用第二个1毫升95%乙醇洗涤三次。
该操作流程的下一步是再次干燥吸附剂。与核酸类似，蛋白质的回收效率在吸附剂干燥时最佳。需干燥较长时间。
按压并释放球泡五分钟，使环境空气流经提取移液管。为干燥蛋白吸附床，用擦拭纸擦去提取移液管尖端残留的乙醇。使用Kim擦拭纸，将250微升PBS溶液反复通过吸附剂五次，以回收蛋白。
PBS 缓冲液可替换为其他任何合适的水溶液，例如 10 毫摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液，pH 6.8。所得溶液含有样品中的蛋白质成分。志贺毒素基因与肠出血性大肠杆菌 O157:H7 菌株 EDL933 相关，通过提取移液管从核酸和蛋白质提取步骤中扩增获得。
志贺毒素基因，即志贺毒素1和志贺毒素2，位于温带λ样细菌噬菌体和缺陷型细菌噬菌体上，受PR启动子调控。大肠杆菌中SOS反应的激活可导致前噬菌体的诱导和/或毒素的产生。在此情况下，当使用丝裂霉素C诱导SOS反应时，与未处理的对照组相比，志贺毒素2基因的扩增显著增加。
这表明原噬菌体被诱导以及噬菌体基因组的复制。视频中所述核酸-蛋白质分离实验所获得的蛋白质具有免疫反应性。将分离得到的蛋白质组分应用于大肠杆菌 O157 快速检测试纸条（侧向流动检测）。
对照结果显示，所有含有大肠杆菌 O157（无论是否诱导产生志贺毒素）的样本均呈阳性，表现为出现两条红色条带。数据还显示，那些通过提取移液管进行核酸和蛋白质处理后含有大肠杆菌 O157 的样本也呈阳性结果。这些数据表明，从每个样本中分离出的蛋白质具有免疫活性，因而可触发阳性反应。
分离得到的蛋白质适用于电泳分析，如本图所示：使用六摩尔古迪纳异硫氰酸盐分离的BSA上样于8%丙烯酰胺凝胶，并经考马斯亮蓝染色。采用该提取、移液及相关实验方案，分离蛋白的电泳迁移率与对照样品完全一致。一旦掌握，可在20分钟内完成该技术操作。
观看本视频后，您应能清楚地了解如何从该简易装置中分离蛋白质和核酸。感谢您花时间观看我们的视频。
概述
本文介绍了一种新型工具和化学方法，用于在无电力条件下从样本中顺序分离核酸和蛋白质。该方法在转移移液器中利用吸附剂，采用固相萃取原理进行有效分离。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 分析化学
背景
- 传统的核酸和蛋白质分离方法通常需要电力和专门设备。
- 本研究提出了一种无电力的样品处理替代方法。
- 该方法适用于各种样品类型，包括固体样品。
- 利用硫氰酸胍进行样品裂解。
研究目的
- 开发一种分离PCR就绪核酸和免疫反应蛋白的方法。
- 消除分离过程中对实验室基础设施的需求。
- 提供一个可在现场设置中执行的用户友好协议。
使用的方法
- 用硫氰酸胍进行样品裂解。
- 通过提取移液器中的吸附剂对样品进行顺序通过。
- 用乙醇洗涤结合的核酸和蛋白质。
- 使用水溶液洗脱核酸和蛋白质。
主要结果
- 成功在无电力条件下分离核酸和蛋白质。
- 该协议允许提取PCR就绪核酸。
- 有效分离了免疫反应蛋白以供进一步分析。
- 证明适用于各种样品类型，包括固体样品。
结论
- 所开发的方法为核酸和蛋白质分离提供了一个实用的解决方案。
- 适用于资源有限的环境。
- 这种方法可以促进多种生物学领域的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation enables rapid, field-based molecular analysis where laboratory infrastructure is unavailable. This capability supports early pathogen detection, dual biomarker validation, and streamlined sample logistics in resource-limited or decentralized settings. The approach enhances predictive confidence by allowing direct genomic and proteomic corroboration from a single sample, reducing ambiguity at critical discovery and diagnostic inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of infectious agents in diverse environments.
- Supports functional target validation by providing both nucleic acid and protein outputs from the same sample.
- Facilitates mechanistic de-risking through multi-modal biomarker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid and protein extracts for downstream PCR and immunoassay workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing sample handling and split-sample variability.
- Enables rapid, scalable screening in field or low-resource settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field-collected samples with translational biomarker strategies by supporting both genomic and proteomic readouts.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and analytical flexibility.
- Reduces risk of false negatives by enabling redundant molecular confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, field diagnostics, and preclinical validation by enabling robust sample collection and dual-analyte extraction outside traditional labs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking for pathogen and biomarker identification.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acids and proteins for immediate or deferred analysis.
- Analytics: Provides quantitative, corroborative outputs for cross-platform comparison and decision-making.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and sample continuity from field to lab.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, reusable extraction platform adaptable to multiple sample types and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity by enabling dual molecular analysis.
- Operational Value: Standardizes extraction protocols and eliminates dependency on electricity or specialized equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in decentralized or resource-limited settings.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, field-compatible sample analysis.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for sample handling and extraction steps.
- Minimal instrumentation needed; relies on proprietary extraction pipettes and standard buffers.
- Cross-team standardization is facilitated by unified protocols for nucleic acid and protein isolation.
- Adaptable to a wide range of sample types, including liquids and solids suspended in buffer.
- Throughput is limited by manual processing; best suited for rapid, point-of-care, or low-to-moderate volume applications.
