Name: 免电力，顺序的核酸和蛋白质的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习无需电力的固相萃取方法，利用转移吸管中的吸附剂从样本中顺序分离核酸和蛋白质。该技术适用于资源有限环境下的PCR级核酸和免疫活性蛋白提取，操作简便且无需离心设备。

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提取移液管的开发部分获得了授予DRP的内部研究与开发基金的资助。

1. 样品裂解
<ol>
 <li>样品应为液态。若样品为固态（如食物或粪便），应将其悬浮于水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）等液体介质中。</li>
 <li>在1.5 mL离心管中，将500 μL样品与500 μL 6M硫氰酸胍（pH 6.5）混合。</li>
 <li>按压提取移液管的胶头，排出其中的空气。</li>
 <li>缓慢释放胶头使其逐渐膨胀，将全部1 mL样品通过吸附材料吸入提取移液管中。</li>
 <li>将提取装置倒置，使吸附珠和样品流入胶头部分。</li>
 <li>在胶头内将吸附珠与样品充分研磨，注意避免将样品从提取移液管中挤出。</li>
</ol>
2. 核酸提取（图1，面板 A）
<ol>
 <li>将提取移液管倒置（管口向下），并将样品排入原来的 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>以适中速度将全部 1 mL 样品吸入提取移液管，使其流经吸附剂，并注意保持吸附剂位于移液管颈部。</li>
 <li>按压吸球，将全部样品排入 1.5 mL 离心管中。</li>
 <li>重复步骤 2.2 和 2.3，使样品再经过吸附剂 4 次，共完成 5 次过柱。</li>
 <li>第五次过柱后，将全部 1 mL 样品排入含有 4 mL 蛋白质提取缓冲液的 15 mL 尖底离心管中，盖紧管盖，留待后续使用。</li>
 <li>用 1 mL 95% 乙醇重复过柱洗涤 3 次，以清洗分离的核酸，最后一次洗涤后将乙醇返回原管。</li>
 <li>使用另一份 1 mL 95% 乙醇，重复步骤 2.6 进行第二次洗涤。</li>
 <li>按压并释放吸球持续 5 分钟，使环境空气流经整个提取移液管，以干燥核酸/吸附剂层。用无尘纸（Kimwipe）擦拭移液管尖端残留的乙醇。</li>
 <li>用 250 μL 10 mM Tris 缓冲液（pH 6.8）重复过柱 5 次，以洗脱核酸。Tris 缓冲液可用其他合适的水溶液（如 PBS）替代。所得溶液即为提取的核酸溶液。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取（图1，图版B）
<ol>
 <li>将步骤2.5中的样品与蛋白质提取缓冲液管通过倒置混合，并将约2至3毫升的该5 mL样品通过新的提取移液管的吸附剂。</li>
 <li>将全部样品排入同一个15 mL锥形管中，注意保持吸附剂位于提取移液管的颈部。</li>
 <li>重复步骤3.1和3.2，使样品在吸附剂上通过15次。</li>
 <li>用1 mL的95%乙醇在吸附剂床中洗涤三次，以清洗吸附剂及结合的蛋白质，并将乙醇排入其原始管中。</li>
 <li>使用第二份1 mL的95%乙醇重复步骤3.4进行洗涤。</li>
 <li>按压并释放吸球5分钟，使环境空气流经整个提取移液管，以干燥蛋白质/吸附剂床。使用无尘纸擦拭提取移液管尖端残留的乙醇。</li>
 <li>通过在吸附剂上反复加入250 μL PBS溶液五次来回收蛋白质。PBS缓冲液可用其他合适的水溶液替代，例如10 mM Tris（pH 6.8）。所得溶液即为含有样品中蛋白质的提取液。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="核酸和蛋白质提取示意图；裂解、洗涤和洗脱步骤；实验方案流程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1A"> 
图1. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="用于大小比较的DNA电泳结果；用于遗传学研究的泳道分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="分离DNA的紫外光谱；吸光度与波长的关系；图示；分离效果比较。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="大肠杆菌快速检测试纸，定性分析，细菌检测结果对比图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="SDS-PAGE 电泳结果，泳道 A-D 中的蛋白质条带，按分子量分离。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

本文的制作和免费访问由美国国防威胁降低局赞助。

本报告中所述的工具、化学试剂和实验方案代表了首个已知的无需电力的多重大分子提取系统，可用于基于现场的即时检测应用。这两种大分子均可应用于多种下游诊断或分析设备。例如，分离得到的核酸具有适用于PCR的品质（图2和图3），而样品中的蛋白质组分具有免疫反应活性（图4）。在环境恶劣或资源有限的地区使用该提取系统，可显著减轻当地人群的疾病负担。此外，该提取系统还可通过在条件艰苦或偏远地区提供一种稳健、快速且成本效益高的样本处理方法，助力全球范围内的疾病监测项目。
上述提取方法的一个重要方面是用户可根据需要对其进行修改。例如，当样本体积大于或小于初始的500 μL（步骤1.2）时，用户可相应调整试剂的体积。也就是说，试剂与样本体积之间的比例应保持恒定，而绝对体积则可进行调整。此外，用户也可根据需要调整样本通过吸附剂的次数。例如，若使用更大的样本体积，可将样本通过吸附剂的次数增加至超过所列次数（步骤2.4和3.3），从而提高大分子类型（核酸或蛋白质）与吸附剂接触的可能性。增加通过次数可提高捕获效率，直至达到吸附剂的饱和状态。
我们发现，该提取工具及相关化学试剂存在一些局限性，其中最显著的是蛋白质提取化学试剂在回收高度糖基化蛋白质方面效率较低。如果下游诊断的目标是糖基化蛋白质，则该系统可能不适合用于鉴定。此外，核酸或蛋白质提取效率的上下限仍在确定中，目前正在进行优化以最大程度提高回收效率。该工具的进一步开发将弥补这些现有的知识空白。

<table><tbody><tr><td>硫氰酸胍</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>G4000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>11ACS200</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827-1L</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr></tbody></table>

无需电力的核酸与蛋白质分步提取法

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

传统和新发的病原体，如肠出血性大肠杆菌 大肠杆菌 （肠出血性大肠杆菌）， 鼠疫耶尔森菌， 或朊病毒相关疾病对全球各国政府、产业界和医疗专业人员而言均构成重大关切。例如，产志贺毒素大肠杆菌（EHECs）与 志贺氏菌每年导致约32.5万名儿童死亡，在发展中国家尤为普遍，而基于实验室的病原鉴定（在美国较为常见）在这些地区往往无法实现 1低成本、基于现场的即时检测工具的开发与推广，有助于快速鉴定或诊断病原体或疾病标志物，可能显著改变疾病进展和患者的预后。我们开发了一种无需电力或配套实验室设备、通过固相萃取（SPE）从样本中分离核酸和蛋白质的工具。 2分离得到的大分子可用于实验室或基于现场的即时检测平台进行诊断。重要的是，该方法能够对未分割的同一样本直接进行核酸和蛋白质数据的比较，通过基因组和蛋白质组分析的相互印证，提高检测结果的可信度。
我们的分离工具采用行业标准的固相核酸分离技术——BOOM 技术，该技术通过硅基颗粒或滤膜从变性盐溶液（通常为异硫氰酸胍）中结合并分离核酸3。CUBRC 专有的固相萃取化学方法则用于从变性盐溶液中纯化蛋白质，此处是从核酸分离后的废液或穿流液中进行纯化4。
通过将性能明确的化学试剂集成到一个小型、廉价且操作简便的平台上，我们开发出一种便携式的核酸与蛋白质提取系统，可在多种条件下进行操作。所提取的核酸具有良好的稳定性，可运输至具备电源的场所进行PCR扩增；而蛋白质组分则可立即用于手持式或其他基于免疫学的检测方法进行分析。在野外快速鉴定疾病标志物，有助于在疾病进展的早期阶段即指导采取正确的治疗方案，从而显著改善患者的预后。本文所述的工具与方法几乎适用于所有类型的病原微生物，能够在降低操作与后勤负担的同时，为使用者提供针对多种大分子类型的并行分析冗余能力。

核酸分离：分离的核酸可进行PCR扩增，且无蛋白质污染。
回收的核酸适用于基于PCR的应用。例如， 图2 显示与肠出血性大肠杆菌相关的志贺毒素基因的扩增 E. coli O157:H7 菌株 EDL-933（ATCC # 35150）来自使用提取移液管进行的核酸/蛋白质提取步骤。志贺毒素基因 stx1 和 stx2 存在于该菌株及其他产志贺毒素大肠杆菌的温和性λ样噬菌体和缺陷型噬菌体中 E. coli 在P的控制下的菌株R 启动子 5 6 7 8SOS反应的激活在 E. coli 导致前噬菌体诱导和/或毒素产生 9我们采用了一种经改良的Feng多重PCR检测方法。 等.11 以鉴定 stx1 和 stx2个基因，在培养样本和加标污水样本中。泳道A和B在 图2 显示未处理培养样品（泳道 A）和经处理培养样品（泳道 B）的 PCR 扩增结果。这些结果几乎完全相同，表明经处理或分离的核酸未发生保真度损失。接下来，我们对加标原污水（泳道 D）以及从加标污水中分离的核酸（泳道 E）进行了扩增 &amp; F)。这些数据表明，与未提取的加标污水样本中的核酸相比，提取后的核酸实现了更高的扩增效果。因此，我们得出结论：在提取过程中，可能去除了污水中天然存在的PCR抑制物，或使核酸得到了浓缩。这两种假设的共同作用亦有可能。
接下来使用紫外光谱法证明所分离的核酸相对不含污染性蛋白质。图3展示了两种E. coli O157:H7核酸提取物（标记为分离a和分离b）的紫外光谱，与标记为分离前的细菌培养物归一化光谱进行比较。所分离核酸的紫外光谱与纯核酸的光谱相似，在260 nm和280 nm处的吸光度比值接近1.810。这些数据表明，采用所述技术回收的核酸组分中几乎不含污染性蛋白质。
蛋白质分离：从核酸/蛋白质分离实验中回收的蛋白质具有免疫反应性，并且在电泳上与纯蛋白质完全相同。
示例2：将分离的蛋白质组分加入RapidChek E. coli O157侧向流动检测试纸条（SDIX, Inc.）中。对照显示，所有含有E. coli O157的样品均呈阳性鉴定结果，无论是否进行STX诱导（图4，分别为B道和C道）。图4中的数据还显示，对含有E. coli O157的样品经提取移液管进行核酸提取后再提取蛋白质的处理后，检测结果亦为阳性。这些数据表明，各样品中分离的蛋白质具有免疫反应性，因而引发阳性响应。
对蛋白质样品进行PCR扩增（如示例1所述），以验证分离得到的蛋白质组分中不含污染性核酸。这些实验的凝胶电泳结果均为阴性。因此，我们得出结论：样品中的蛋白质组分已与污染性核酸有效分离。综合核酸分离步骤中所述结果可见，核酸与蛋白质组分通过不同的分离步骤被分别纯化。
示例3：分离得到的蛋白质适用于电泳10。图5展示了一块经考马斯亮蓝染色的8%丙烯酰胺凝胶，其中加样孔加载了BSA（图5，泳道A和C）以及使用提取移液管及相关方案从6M异硫氰酸胍中分离得到的BSA。分离蛋白的电泳迁移率与对照样品完全相同。因此我们得出结论：提取过程未改变分离蛋白的共价结构。
<img alt="显示从样本准备到洗脱步骤的移液管核酸提取过程示意图。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1a"> 
图 1，图版 A：典型的核酸提取流程示意图。 在样本管中将样本与 6M 异硫氰酸胍混合，并通过吸附剂反复转移五次。最后一次通过后，将样本加入蛋白提取缓冲液中。吸附剂及其结合的核酸用乙醇洗涤两次。然后将样本空气干燥，并从吸附剂中洗脱。
<img alt="显示样本管、移液器以及洗涤/洗脱步骤的蛋白质提取流程示意图。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1b"> 
图1，图版B：典型的蛋白质提取流程示意图。 将步骤1中与蛋白质分离缓冲液混合的样本（来自图1，图版A）通过第二个提取移液管的吸附剂重复15次。后续操作步骤与核酸提取方案完全相同。
<img alt="用于大小比较的DNA电泳结果，含用于遗传学研究的泳道分析。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：溴化乙锭染色琼脂糖凝胶的负片图像。 使用培养样品（泳道 A 和 B）或添加了 E. coli O157:H7 的原始污水样品（泳道 D、E 和 F）进行了多重志贺毒素1和2基因扩增实验。样品直接加入PCR反应管（泳道 A 和 D），或经核酸提取流程处理后将提取的核酸加入PCR反应管（样品 B、E 和 F）。该PCR方案基于Feng 等11所述方法进行修改，仅保留针对 stx1（下方条带）和 stx2（上方条带）引物对的扩增，去除了所有其他引物对。泳道 C 为BioRad的1 Kb DNA标记物。
<img alt="分离DNA的紫外光谱；吸光度与波长关系；曲线图；分离效果对比。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：使用所述提取移液管分离的 E. coli O157:H7 核酸的紫外光谱结果。 分离得到的核酸标记为分离a和分离b。在核酸提取前对样品也进行了紫外光谱检测，标记为提取前。光谱数据使用日立U3010分光光度计及配套软件获得。
<img alt="大肠杆菌快速检测试纸、定性分析、细菌检测结果对比图。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：RapidChek 试纸的彩色照片。 使用 图 2 中的样品，通过提取移液管分离其蛋白质含量，并通过侧向流动分析检测其免疫反应性。A–C 泳道为未经处理的对照，即直接将细胞培养物加入试纸，未进行核酸或蛋白质提取。泳道 A 为阴性对照 E. coli BL21 DE3 pLysS；泳道 B 和 C 显示未经处理的 E. coli O157:H7（B），或经丝裂霉素 C 处理 4 小时的菌株（C）。泳道 D 至 H 显示将提取的蛋白质加入侧向流动试纸后的结果。泳道 D 和 E 使用来自 E. coli BL21 DE3 pLysS 的蛋白质提取物作为阴性对照，分别未经（D）或经丝裂霉素 C 处理（E）。泳道 F–H 显示使用从 E. coli O157:H7 提取的蛋白质时的结果。蛋白质分别提取自未经处理（F）、经丝裂霉素 C 处理 2 小时（G）或 4 小时（H）的培养物。阳性结果呈现两条红色条带。
<img alt="SDS-PAGE 电泳结果，A-D 泳道中的蛋白质条带，按分子量分离。" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：考马斯亮蓝染色 SDS-PAGE 凝胶照片。 使用提取移液管及所述方案从溶液中分离 BSA。泳道 A 和 C 分别为 250 μg/mL 和 500 μg/mL 的对照样品。泳道 B 和 D 显示从含有与相应对照相同浓度的溶液中回收的 BSA。

介绍了一种无需电力即可从样品中依次分离核酸和蛋白质的工具及化学方法。该工具由固定在移液管内的吸附剂组成，分离化学方法基于固相萃取原理。所分离的生物大分子可通过基于免疫检测和PCR的分析方法进行检测。

传统和新出现的病原体，如肠出血性大肠杆菌（EHEC）、鼠疫耶尔森菌或朊病毒相关疾病，均受到广泛关注……

本实验的总体目标是从样本中分离出可用于PCR的核酸和具有免疫活性的蛋白质，且无需依赖电力或实验室基础设施。核酸和蛋白质的分离首先将样本与胍和硫氰酸盐混合以裂解样本，然后将混合物通过提取移液管中的吸附剂。在第五次也是最后一次通过吸附剂后，将混合物放入蛋白质提取缓冲液中，静置以用于分离免疫活性蛋白质。接下来，通过将95%乙醇流经吸附剂来洗涤吸附剂及其结合的核酸。随后，多次通过室温空气吹扫吸附剂5分钟，以干燥吸附剂及结合的核酸。用于PCR扩增的核酸分离最后一步是使用250微升Tris缓冲液或其它类似的水溶液洗脱吸附剂上的核酸，从而实现免疫活性蛋白的分离。将样品与蛋白质提取缓冲液混合后，使用第二支移液管将混合物反复通过吸附剂15次。下一步是用95%乙醇多次通过吸附剂，以洗涤吸附剂上结合的蛋白质。然后通过吸附剂通入环境空气5分钟，使吸附剂及其结合的蛋白质干燥。该方案的最后一步是从吸附剂中洗脱蛋白质。最终，本实验中使用的提取移液管可实现无需电力即可分离出可用于PCR的核酸和具有免疫活性的蛋白质。大家好，我叫Dave Pawlowski。我是纽约州布法罗市库布里克公司的一名高级研究科学家，今天我们将学习一种技术，该技术可在无需离心机、涡旋振荡器或其他额外实验设备的情况下，连续分离蛋白质和核酸。在样品裂解前，请确保样品处于液态。如果样品为固态（例如食物或粪便），应将其悬浮于水或磷酸盐缓冲盐水等液体介质中。在1.5毫升离心管中，将500微升样品与500微升6摩尔的硫氰酸胍混合。接着，按压提取移液管的吸头以排出其中的空气，然后缓慢松开吸头，使整个1毫升样品通过吸附材料被吸入提取移液管中。将提取工具倒置，使吸附珠和样本流入球部。在球部内将吸附珠与样本研磨，注意不要将样本从提取移液管中挤出。将提取移液管倒置，将样品排回原来的1.5毫升离心管中。以中等速度将全部1毫升样品吸入提取移液管，使其流经吸附剂。注意保持吸附剂位于提取移液管的管颈处，通过按压吸球将全部样品排入1.5毫升离心管中。重复此过程，使样品在吸附剂上再过柱四次，共过柱五次。第五次过柱后，将全部一毫升样品排入含有四毫升蛋白质提取缓冲液的15毫升锥形管中。通过倒置混匀管内液体，然后盖上管盖，放置一旁备用。用1毫升95%乙醇重复过柱洗涤分离的核酸三次，每次将乙醇回收至其原始离心管中。最后一次过柱后，再用第二个1毫升95%乙醇重复洗涤三次。下一步为干燥吸附柱，当吸附柱完全干燥时，核酸回收效果最佳。我知道这一步很繁琐。但是，如果您在推荐的时间范围内完成此步骤，结果会更好。按压并释放球囊持续五分钟。使环境空气通过提取移液管，以干燥核酸和吸附床，并用擦拭纸擦去移液管尖端残留的乙醇。使用Kim擦拭纸，通过将250微升10毫摩尔的Tris缓冲液在吸附剂上反复通过五次，回收核酸。Tris缓冲液可用任何其他合适的水溶液（如PBS）替代。所得溶液含有提取的核酸，用于先进行蛋白质提取。将样品与之前预留的蛋白质提取缓冲液混合，将该五毫升样品中的约两到三毫升转移至新的提取吸附剂上。用移液器将整个样品排入同一个15毫升锥形管中，注意保持吸附剂留在提取移液器的颈部。重复此过程，使样品在吸附剂中循环15次。用1毫升95%乙醇通过吸附剂床三次，洗涤吸附剂及结合的蛋白质，并将乙醇排入原管；再用第二个1毫升95%乙醇洗涤三次。该操作流程的下一步是再次干燥吸附剂。与核酸类似，蛋白质的回收效率在吸附剂干燥时最佳。需干燥较长时间。按压并释放球泡五分钟，使环境空气流经提取移液管。为干燥蛋白吸附床，用擦拭纸擦去提取移液管尖端残留的乙醇。使用Kim擦拭纸，将250微升PBS溶液反复通过吸附剂五次，以回收蛋白。PBS 缓冲液可替换为其他任何合适的水溶液，例如 10 毫摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液，pH 6.8。所得溶液含有样品中的蛋白质成分。志贺毒素基因与肠出血性大肠杆菌 O157:H7 菌株 EDL933 相关，通过提取移液管从核酸和蛋白质提取步骤中扩增获得。志贺毒素基因，即志贺毒素1和志贺毒素2，位于温带λ样细菌噬菌体和缺陷型细菌噬菌体上，受PR启动子调控。大肠杆菌中SOS反应的激活可导致前噬菌体的诱导和/或毒素的产生。在此情况下，当使用丝裂霉素C诱导SOS反应时，与未处理的对照组相比，志贺毒素2基因的扩增显著增加。这表明原噬菌体被诱导以及噬菌体基因组的复制。视频中所述核酸-蛋白质分离实验所获得的蛋白质具有免疫反应性。将分离得到的蛋白质组分应用于大肠杆菌 O157 快速检测试纸条（侧向流动检测）。对照结果显示，所有含有大肠杆菌 O157（无论是否诱导产生志贺毒素）的样本均呈阳性，表现为出现两条红色条带。数据还显示，那些通过提取移液管进行核酸和蛋白质处理后含有大肠杆菌 O157 的样本也呈阳性结果。这些数据表明，从每个样本中分离出的蛋白质具有免疫活性，因而可触发阳性反应。分离得到的蛋白质适用于电泳分析，如本图所示：使用六摩尔古迪纳异硫氰酸盐分离的BSA上样于8%丙烯酰胺凝胶，并经考马斯亮蓝染色。采用该提取、移液及相关实验方案，分离蛋白的电泳迁移率与对照样品完全一致。一旦掌握，可在20分钟内完成该技术操作。观看本视频后，您应能清楚地了解如何从该简易装置中分离蛋白质和核酸。感谢您花时间观看我们的视频。

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无需电力的核酸与蛋白质分步提取法

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